Relatório de Aula Prática - MIcrobiologia

Relatório de Aula Prática - MIcrobiologia

(Parte 1 de 2)

19

Universidade Federal de Goiás

Campus Jataí

Curso de Biomedicina

Hélio de Souza Júnior

Aulas Práticas

Relatório de todas as aulas práticas realizadas durante o segundo semestre de 2009 apresentado á disciplina de Microbiologia Básica, ministrada pelo Professor Dr. Alexandre Braoios.

Jataí – GO

Dezembro de 2009

SUMARIO

  1. Coloração de Gram....................................................................................................01

    1. Introdução ..........................................................................................................01

    2. Objetivos............................................................................................................01

    3. Materiais.............................................................................................................01

    4. Métodos..............................................................................................................02

    5. Resultados..........................................................................................................02

    6. Conclusão...........................................................................................................03

  2. Semeadura para Isolamento.......................................................................................04

    1. Introdução...........................................................................................................04

    2. Objetivos............................................................................................................05

    3. Materiais.............................................................................................................05

    4. Métodos..............................................................................................................05

    5. Resultados..........................................................................................................06

    6. Conclusão...........................................................................................................06

  3. Meios seletivos e Diferenciais...................................................................................07

    1. Introdução...........................................................................................................07

    2. Objetivos............................................................................................................08

    3. Materiais.............................................................................................................08

    4. Métodos..............................................................................................................09

    5. Resultados..........................................................................................................09

    6. Conclusão...........................................................................................................09

  4. Teste para diagnostico de Staphylococcus aureus.....................................................10

    1. Introdução...........................................................................................................10

    2. Objetivos............................................................................................................11

    3. Materiais.............................................................................................................11

    4. Métodos..............................................................................................................11

    5. Resultados..........................................................................................................12

    6. Conclusão...........................................................................................................12

  5. Teste de Sensibilidade aos Antimicrobianos.............................................................13

    1. Introdução...........................................................................................................13

    2. Objetivos............................................................................................................14

    3. Materiais.............................................................................................................14

    4. Métodos..............................................................................................................14

    5. Resultados..........................................................................................................15

    6. Conclusão...........................................................................................................15

  6. Referências Bibliográficas.........................................................................................17

Coloração de Gram

Introdução

A coloração de Gram é um método de coloração de bactérias desenvolvido pelo médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram (1853 - 1838), em 1884, e que consiste no tratamento sucessivo de um esfregaço bacteriano, fixado pelo calor, com o reagente cristal violeta, lugol, álcool-acetona e fucsina básica. Essa técnica permite a separação de amostras bacterianas em Gram-positivas e Gram-negativas e a determinação da morfologia e do tamanho das amostras analisadas. A coloração de Gram é um dos mais importantes métodos de coloração utilizados em laboratórios de microbiologia e de análises clínicas, sendo quase sempre o primeiro passo para a caracterização de amostras de bactérias. A técnica tem importância clínica uma vez que muitas das bactérias associadas a infecções são prontamente observadas e caracterizadas como Gram-positivas ou Gram-negativas em esfregaços de pus ou de fluidos orgânicos. Essa informação permite ao clínico monitorar a infecção até que dados de cultura estejam disponíveis. É possível a análise de vários esfregaços por lâmina, o que facilita a comparação de espécimes clínicos. As lâminas podem ser montadas de forma permanente e preservadas como documentação.

Objetivo

Confeccionar uma lâmina e utilizar a técnica de gram para visualizar a morfologia das bactérias ao microscópio óptico.

Materiais

  1. Lamina;

  2. Solução salina;

  3. Alça bacteriológica;

  4. Bico de Bunsen;

  5. Colônia de bactérias;

  6. Cristal Violeta, Lugol, Álcool-acetona, Fucsina;

  7. Papel filtro;

  8. Microscópico.

Métodos

  1. Sobre a lâmina de vidro, colocou-se uma gota de solução salina. Com a alça bacteriológica tocar levemente na superfície da colônia e emulsionar o material na gota de solução salina (caso o microrganismo seja fornecido em solução, colocar uma gota na lâmina). Deixar secar.

  2. Passou-se o esfregaço na chama do bico de Bunsen três vezes a fim de fixar o material.

  3. Posteriormente cobriu-se o esfregaço seco com violeta de genciana (cristal violeta) e deixar por um minuto.

  4. Lavou-se com água corrente.

  5. Esgotou-se a lâmina, e a cobriu com solução de lugol e deixar por um minuto.

  6. Esgota-se a lâmina e, mantendo a mesma inclinada, pingou-se gotas de Álcool-acetona até que não se desprenda mais corante da preparação.

  7. Lavou-se com água corrente.

  8. Cobriu-se a lâmina com solução de fucsina e deixar por trinta segundos.

  9. Lavou-se a lâmina e a cobriu com papel filtro para a secagem da lâmina.

  10. Em seguida examinou-se ao microscópio com a objetiva de imersão.

Resultados:

Gram (+) coram de roxo, gram (-) coram de rosa.

100X

Conclusão

O método da coloração de Gram é baseado na capacidade das paredes celulares de bactérias Gram-positivas de reterem o corante cristal violeta no citoplasma durante um tratamento com álcool-acetona enquanto que as paredes celulares de bactérias Gram-negativas não o fazem.

Resumindo, as bactérias Gram positivas coram-se de roxo e as Gram negativas coram-se de vermelho. Esta técnica de coloração permite então a distinção entre bactérias com parede celular mais ou menos rica em peptidoglicanos. De referir que embora uma bactéria Gram negativa nunca possa corar positivamente pelo Gram, uma bactéria estruturalmente Gram positiva pode corar negativamente se a sua parede de peptidoglicano for destruída ou danificada (ex. envelhecimento celular ou acção de lisozimas).

Semeadura para Isolamento

Introdução

Identificar um dado organismo como espécie baseia-se no preenchimento das características atribuídas àquela espécie. O reconhecimento da fonte ou origem do espécime (ambiente, espécie animal, tipo de patologia e localização) do organismo é às vezes fundamental para identificação e a correta caracterização cultural do organismo em meios de isolamento primário, assim como a execução e interpretação da coloração e reação ao Gram são vitais para o sistema de identificação.

Para isolar o microrganismo efetua-se a inoculação ou semeadura, utilizando a técnica do esgotamento do inóculo por estrias, tendo-se o cuidado de usar inteiramente toda a área do meio para garantir a separação das bactérias, de modo que após a incubação cada célula separada origine uma colônia.

O processo de identificação propriamente dito começa com a observação das características das colônias isoladas (a olho nu, com lupa ou microscópio, usando a objetiva de menor aumento). Os seguintes critérios são utilizados para a caracterização colonial:

  1. Forma;

  2. Tamanho (mm);

  3. Elevação - achatada (alta, baixa), espraiada, convexa, etc;

  4. Bordos - inteiros, ondulados, lobados, denticulados, franjados, etc.;

  5. Superfície - lisa, rugosa;

  6. Estrutura - amorfa, granulosa, filamentosa;

  7. Caracteres ópticos - opaca, translúcida e transparente;

  8. Cromogenia ou Pigmentação - amarela, branca, preta, rósea, etc.;

  9. Odor – ausente, presente, semelhante a...

 Após a observação dessas características devem ser feitos esfregaços para colorações especiais, para observação da morfologia microscópica (forma, arranjos, tamanho e reação ao Gram), presença ou ausência de esporos, flagelos, cápsulas, granulações e coloração bipolar (freqüente nas pasteurelas e yersinias). Os procedimentos seguintes envolvem a caracterização metabólica, tolerância a agentes químicos e físicos, a antimicrobianos e fagos (fagotipagem), bem como propriedades antigênicas ou sorológicas e patogenicidade através da inoculação em espécies animais susceptíveis (apropriadas).  

Objetivo

Isolar uma determinada bactéria que possa conter na amostra usando os meio de cultura solido Ágar MacConkey e Ágar Nutritivo.

Materiais

  1. Solução salina;

  2. Alça bacteriológica;

  3. Bico de Bunsen;

  4. Amostra de bactérias (colônias);

  5. Ágar MacConkey e Ágar Nutritivo;

Métodos

  1. Com a alça bacteriológica devidamente esterilizada, coletou-se amostras de bactérias;

  2. Utilizando a técnica do esgotamento do inóculo por estrias (Figura 1), foi semeado a amostra de bactérias nos Ágares Nutritivo e MacConkey.

  3. Incubou-se os meios de cultivo sólidos.

  4. Posteriormente observou-se as características das colônias que cresceram nos dois ágares (Figura 2).

Resultados

Algumas colônias no Ágar MacConkey apresentaram coloração rosada, amarelada ou incolores, mucóides ou não, odor forte, colônias grandes, brilhantes, enquanto no Agar nutriente cresceram vários tipos bacterianos, com diferentes características.

Conclusão

Um isolamento bem feito é fundamental no processo de identificação das bactérias, visto que a área de isolamento é fundamental para o desenvolvimento dos passos seguintes de identificação.

Os Ágares Nutritivo e MacConkey são exemplos de meio de cultura que podem ser usados num primeiro passo de identificação das mesmas, visto que o Agar Nutritivo permite o crescimento de toda bactéria, desde que não seja fastidiosa, tendo o básico para o crescimento destes microorganismos, e o Agar Maconkey como um meio seletivo e diferencial na suspeita de uma bactéria.

Meios Seletivos e Diferenciais (Ágares SS, Manitol e MacConkey)

Introdução

Meios de cultura consistem da associação qualitativa e quantitativa de substâncias que fornecem os nutrientes necessários ao desenvolvimento (cultivo) de microrganismos fora do seu meio natural. Tendo em vista a ampla diversidade metabólica dos microrganismos, existem vários tipos de meios de cultura para satisfazerem as variadas exigências nutricionais.

Quanto à composição química podem ser simples ou básicos (que permitem o crescimento bacteriano, sem satisfazer, contudo nenhuma exigência em especial) e complexos ou especiais (quando cumprem com as exigências vitais de determinados microrganismos).

De acordo com a finalidade bacteriológica ou micológica os meios especiais podem ser classificados em vários tipos, por exemplo:

  • Diferenciais - Permitem separar grupos de microorganismos através da sua aparência no meio (características morfológicas ou bioquímicas) e contêm indicadores, que assinalam as alterações na aparência do crescimento bacteriano (colônias) ou no meio (mudança de cor). O mais comum é o:

    • Ágar Sangue – contém sangue misturado do ágar e é usado para verificar a capacidade hemolítica dos microorganismos. Bactérias γ-hemolíticas (não há hemólise); bactérias α-hemolíticas (hemólise parcial) e β-hemolíticas (hemólise total)

  • Seletivos e diferenciais– Além de nutrientes necessários para o crescimento de todos os microorganismo, contém 1 ou mais compostos que são essenciais devido à sua especificidade funcional de isolar grupos específicos, permitindo o seu crescimento em detrimento de outro, pois são formulados para inibir o crescimento de microorganismos que não interessam ao fim em vista. Os agentes de seleção podem ser produtos químicos, corantes, antimicrobianos. A maioria deles é também diferencial, permitindo diferenciar as colônias (sólidos) dos microorganismos. Os mais conhecidos e que foram usados na aula foram:

    • Ágar SS – possui componentes (sais de bile, verde brilhante e citrato de ferro) que inibem microrganismos Gram positivos. E a incorporação de lactose ao meio permite diferenciar se o microrganismo é lactose positiva (bactérias que fermentam a lactose produzem ácido que na presença do indicador vermelho neutro resulta na formação de colônias de cor rosa), e bactérias que não fermentam a lactose formam colônias transparentes. O tissulfato de sódio e o citrato férrico permitem a detecção de H2S, que é evidenciado pela formação de colônias de cor negra no centro.

    • Ágar Manitol – é um meio seletivo, pois contém uma concentração de sal (7,5%) muito elevada, que inibe a maior parte dos microorganismos, permitindo o crescimento principalmente de cocos Gram+. Também é um meio diferencial, pois contém o álcool manitol e 1 indicador de pH, o vermelho de fenol, que passa de amarelo a vermelho, se o manitol for fermentado.

    • Ágar Macconkey – é um meio seletivo permitindo o crescimento de bactérias Gram negativas e inibindo o crescimento de Gram positivas (especialmente estafilococos e enterococos) principalmente pela presença de corante cristal violeta e sais biliares e é diferencial, pois indica a fermentação de lactose (o meio fica amarelado quando isso ocorre, por causa mudança de pH).

Objetivo

Conhecer os vários tipos de meios de cultivo, vendo as características de cada um, visando à utilização dos mesmos na rotina laboratorial na pesquisa de um tipo bacteriano.

Observar a importância destes meios, visto que apresentam características de inibirem o crescimento de certas bactérias e diferenciar outras com base no seu metabolismo.

Materiais

  1. Solução salina;

  2. Alça bacteriológica;

  3. Bico de Bunsen;

  4. Amostra biológicas do nariz e de fezes;

  5. Ágar SS e Ágar Manitol.

Métodos

  1. Com a alça bacteriológica devidamente esterilizada, coletou-se amostras de bactérias do nariz dos próprios alunos e de fezes suspensas em um tubo de ensaio;

  2. Utilizando a técnica do esgotamento do inóculo por estrias foi semeado a amostra de bactérias nos ágares SS, Manitol.

  3. Incubou-se os meios de cultivo sólidos.

  4. Posteriormente observou-se as características das colônias nos ágares.

Resultados

Posteriormente os ágares foram analisados, sendo encontradas no ágar Manitol (que foi cultivado com amostra de bactérias da boca e de ouvido) duas colônias, uma com aspecto mais mucóide (brilhante), e outra de aspecto mais liso, sem odor. Mostrando o predomínio de Gran+.

No Ágar SS (que foi semeado com amostras de fezes) cresceu algumas colônias pretas.

Conclusão

Os meios diferenciais e seletivos são de fundamental importância na identificação das bactérias, uma vez que o laudo apresentado ao clinico deva conter informações necessárias PA um melhor tratamento da mesma.

O resultado, prévio no Ágar Manitol, indica a necessidade de testes mais específicos para a detecção de Stafilococos sp.

No Ágar SS que é indicado para fezes, uma cultura secundaria para as colônias pretas é necessária para identificação de Salmonela, que é patogenica, visto que uma das diferenças da Proteus, que não é patogênica, é que a ultima apresenta cheiro forte, (já que as duas apresentam-se em colônias pretas).

Testes para diagnóstico de Staphylococcus aureus (Reação das enzimas Catalase, Dnase e Coagulase)

Introdução

O teste da catalase é realizado com peróxido de hidrogênio (H2O2) sobre uma lâmina e consiste na detecção da enzima catalase em bactérias. Esta enzima atua sobre a água oxigenada (peróxido de hidrogênio 3 a 5%) desdobrando-a em oxigênio e água e conseqüentemente protege as bactérias dos ataques com superoxidantes produzidos como defesa pelos leucócitos. A catalase é produzida por muitos microrganismos e é usualmente empregada para diferenciar Staphylococcus, que são catalase positivos de Streptococcus, que são catalase negativos. A prova é considerada positiva quando há borbulhamento ou efervescência devido à liberação do oxigênio.

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