Métodos diagnósticos em parasitologia

Métodos diagnósticos em parasitologia

Métodos diagnósticos em parasitologia

Profª Carolina Zinn

Exame parasitológico de fezes (EPF)

  • Grande importância para o diagnóstico de parasitoses intestinais, causadas por helmintos e protozoários

  • EPF não é o nome de uma técnica, e sim do pedido para a realização de um exame de fezes em busca de parasitos

  • Grande desafio do diagnóstico na parasitologia é a baixa sensibilidade das técnicas quando não realizadas corretamente

  • Falta de conhecimento sobre a coleta da amostra, os fundamentos de conservação e da execução do método, levam frequentemente a resultados falso-negativos!!!

Exame parasitológico de fezes (EPF)

  • Outro erro  indicação de anti-helmínticos sem solicitar EPF para verificar a real necessidade

  • O profissional responsável por escolher a técnica deve ter claramente delimitado o objetivo do exame

  • Pacientes assintomáticos  técnica capaz de detectar o maior número possível de espécies

  • Existem técnicas preferenciais para a busca de determinadas estruturas

  • É fundamental que o médico indique a suspeita clínica e, se possível, a técnica desejada

Exame parasitológico de fezes (EPF)

  • Tem como objetivo diagnosticar os parasitos intestinais, por meio da pesquisa das diferentes formas parasitárias que são eliminadas nas fezes.

  • O exame macroscópico permite a verificação da consistência das fezes, do odor, da presença de elementos anormais, como muco ou sangue, e de vermes adultos ou partes deles.

  • O exame microscópico permite a visualização dos ovos ou larvas de helmintos, cistos, trofozoítos ou oocistos de protozoários. Pode ser quantitativo ou qualitativo.

Exame parasitológico de fezes (EPF)

  • A grande maioria dos métodos é apenas QUALITATIVO = apenas indica a presença do parasita ou não

  • Existem métodos QUANTITATIVOS (Kato-Katz) = se faz a contagem dos ovos nas fezes, permitindo, assim, avaliar a intensidade do parasitismo.

  • Métodos QUALI  rotina

  • Métodos QUANTI  pouco utilizados, pois a dose dos medicamentos antiparasitária não leva em conta a carga parasitária e sim o peso corporal do paciente. Estudos epidemiológicos e/ou controle de cura

Coleta da amostra

  • Deve ser colhida sem contato com o vaso sanitário

  • Utilizar recipientes limpos, isentos de água (pode conter microorganismos de vida livre), urina (destrói a mobilidade e os trofozoitas) ou outro material que possa contaminar  pinico

  • Jornais e outros tipos de papéis também devem ser evitados a fim de não contaminar

  • Transferir a amostra para o frasco coletor cedido pelo laboratório

Coleta da amostra

  • Identificar o frasco com letra legível, indicando nome do paciente, data e hora da coleta  lápis (não borrar com o conservante)

  • Tempo de entrega do material depende da suspeita clínica

    • Fezes diarreicas – Giardia 30 min – estrongiloidíase com exame de larvas vivas imediatamente após a emissão das fezes
  • De preferência – coleta pela manhã no laboratório ou enviada rapidamente

  • Caso não seja possível enviar imediatamente o material será necessário conservar o material

Conservantes

  • MIF (mercúrio, iodo e formol) – mais popular

  • Formol 10% - proibição do mercúrio

  • Formol tamponado

  • SAF (acetado de sódio, ácido acético glacial, formol e água destilada) – bom para trofozoítos em fezes diarreicas

  • Embrulhar em papel e armazenar na geladeira (5-10ºC) ou isopor com gelo – até 48hs

Conservantes

  • Colocar o conservante, a amostra, homogeneizar bem e colocar mais conservante

  • Quando são feitas várias coletas em dias alternados, elas podem ser misturadas no mesmo recipiente

Cuidados fundamentais

  • Usar luvas

  • Trabalhar com calma, identificando corretamente

  • Usar material descartável  evita falso-positivos

Escolha do método

  • Não existe um método capaz de diagnosticar, ao mesmo tempo, todas as formas parasitárias.

  • Alguns métodos são mais gerais, permitindo o diagnóstico de vários parasitos intestinais, outros são métodos específicos, indicados para um parasito em especial.

  • Métodos gerais  método de Hoffman, Pons e Janer e o os métodos de centrifugação (MIFC, Ritchie e Coprotest).

  • Na maioria dos pedidos de EPF, a suspeita clínica não é relatada, e o exame é feito por um dos métodos gerais, acima citados.

  • Quando é solicitada a pesquisa de um parasito que exige a execução de um método específico  método específico e método geral devem ser executados  o EPF ficará mais completo, pois será feita a pesquisa dos vários parasitos intestinais e não apenas daquele solicitado.

Escolha do método

  • Execução de vários métodos com cada amostra fecal

    • um método geral
    • um específico para larvas de helmintos
    • um específico para cistos de protozoários.
  • Procedimento é inviável - quantidade insuficiente de fezes, ou pelo elevado número de exames a serem realizados por dia

  • Interação médico-laboratório  contribuiria para que o EPF fosse o mais exato possível.

  • Automação – ainda não é uma realidade na parasitologia

  • Testes imunológicos

  • Testes moleculares

Escolha do método

  • Imunoenzimáticos - EIA ou ELISA

    • Entamoeba histolytica/ dispar
    • Giardia lamblia
    • Cryptosporidium
  • Imunofluorescentes-IFAs

    • Cyclospora
    • Isospora
  • PCR

    • detecção e subtipagem
    • Cryptosporidium

Escolha do método

  • A fim de obter mais qualidade no EFP, devemos sempre ter em mente que

  • 1. algumas espécies de parasitos só são evidenciadas por técnicas especiais;

  • 2. um exame isolado, onde o resultado é negativo, não deve ser conclusivo, sendo recomendável a sua repetição com outra amostra;

  • 3. a produção de cistos, ovos ou larvas não é uniforme ao longo do dia ou do ciclo do parasito.

Métodos

  • Exame de fezes direto a fresco

  • Técnicas de concentração - Muitas vezes o número de formas parasitárias eliminadas com as fezes é pequeno, havendo necessidade de recorrer a processos de enriquecimento para concentrá-las.

    • Espontânea ou por centrifugação
    • Flutuação ou sedimentação
  • Técnicas para buscas de larvas

  • Existem diversas técnicas semelhantes, baseadas no mesmo fundamento, com nome diferente

  • Um método será mais ou menos utilizado na rotina do EPF, quando, além de permitir o diagnóstico de vários parasitos intestinais, é também de fácil execução e pouco dispendioso.

Helmintos - Formas evolutivas eliminadas via anal

  • OVOS

    • Ascaris lumbricoides
    • Trichuris trichiura
    • Enterobius vermicularis
    • Ancylostoma duodenale
    • Necator americanus
    • Taenia solium
    • Taenia saginata
    • Hymenolepis nana
    • Schistosoma mansoni

Protozoários - Formas evolutivas eliminadas via anal

  • CISTOS/TROFOZOÍTOS

    • Giardia lamblia
    • Entamoeba histolytica/E. dispar
    • Entamoeba coli
    • Endolimax nana
    • Iodamoeba bütschlii
    • Chilomastix mesnili
    • Blastocystis hominis (apenas cisto)

Método direto

  • Procedimento simples

  • Permite visualizar trofozoítos vivos

  • Obtida diretamente da amostra fecal, sem conservante, pouco material (falso-negativo)

  • Métodos de concentração são melhores  mais amostra, maior sensibilidade

Método direto

  • Recolhe-se uma porção bem pequena (cabeça do palito de fósforo) e coloca-se sobre a lâmina

  • Adiciona-se salina

  • Homogeiniza

  • Coloca lamínula

  • Análise em microscópio em 10 e 40X

Processos de concentração

  • Sedimentação espontânea: método de Hoffman, Pons e Janer, também conhecido como método de Lutz. Permite o encontro de ovos e larvas de helmintos e de cistos de protozoários;

  • Sedimentação por centrifugação: método de Blagg (também conhecido por método de MIFC), método de Ritchie, Coprotest. Usados para a pesquisa de ovos e larvas de helmintos, cistos e alguns oocistos de protozoários;

  • Flutuação espontânea: método de Willis. Indicado para a pesquisa de ovos leves (principalmente ancilostomídeos);

  • Centrífugo-flutuação: é o teste de Faust. Usado para a pesquisa de cistos e alguns oocistos de protozoários, permitindo, também, o encontro de ovos leves.

  • Concentração de larvas de helmintos por migração ativa, devido ao hidrotropismo e termotropismo positivos: método de Baermann-Moraes e método de Rugai. Indicados para a pesquisa de larvas de Strongyloides stercoralis.

Sedimentação espontânea, Método de Lutz ou de Hoffman, Pons e Janer (HPJ)

  • Método de concentração

  • Cistos, oocistos, ovos ou larvas

  • Procedimento:

    • Colocar aproximadamente 2g de fezes em um frasco de Borrel (pode ser substituído por copo plástico descartável), com cerca de 5mL de água, e triturar bem com bastão de vidro (ou "palito de picolé").
    • Acrescentar mais 20mL de água.
    • Filtrar a suspensão para um cálice cônico de 200 mL de capacidade, por intermédio de tela metálica ou de náilon com cerca de 80 a 100 malhas por cm2, ou gaze cirúrgica dobrada em quatro; os detritos retidos são lavados com mais 20mL de água, agitando-se constantemente com o bastão de vidro, devendo o líquido da lavagem ser recolhido no mesmo cálice.
    • Completar o volume do cálice com água.

Sedimentação espontânea, Método de Lutz ou de Hoffman, Pons e Janer (HPJ)

    • Deixar essa suspensão em repouso durante 2 a 24 horas

Sedimentação espontânea, Método de Lutz ou de Hoffman, Pons e Janer (HPJ)

  • Existem duas técnicas para se colher o sedimento para exame:

    • a. introduzir uma pipeta obliterada pelo dedo indicador até o sedimento contido no fundo do cálice, retirar o dedo e deixar subir uma pequena porção do sedimento; recolocar o dedo e retirar a pipeta;
    • b. desprezar o liquido sobrenadante cuidadosamente, homogeneizar o sedimento e colher uma gota do mesmo (esse procedimento é melhor, pois a gota colhida é mais representativa do sedimento).
  • Colocar parte do sedimento numa lâmina com uma gota de lugol e fazer um esfregaço.

  • O uso de lamínulas é facultativo. Examinar com as objetivas de 10x e 40x. Deve-se examinar, no mínimo, duas lâminas de cada amostra.

Sedimentação espontânea, Método de Lutz ou de Hoffman, Pons e Janer (HPJ)

  • Método mais utilizado

  • Barato

  • Sensível para cistos de protozoários, ovos e larvas de helmintos

  • Desvantagem: demorado

  • Coprotest – formol 10% - facilita o procedimento – paciente coleta já com o conservante e homogeiniza por 2 minutos – o laboratorista somente continua o procedimento anterior

  • Paratest – formol 5% com sistema de filtragem – eficiência reduzida devido a quantidade pequena de amostra

Centrífugo-sedimentação, Método de Ritchie, de Blagg ou “formol-éter”

  • Baseia-se na sedimentação forçada pela centrifugação

  • Ovos e larvas de helmintos, cistos e alguns oocistos de protozoários

  • Procedimento:

    • Colher as fezes recém-emitidas em liquido conservador de MIF.
    • Homogeneizar bem.
    • Filtrar a suspensão de fezes em gaze dobrada em quatro ou em filtro descartável, num copo plástico descartável.
    • Transferir 1 a 2mL do filtrado para um tubo cônico de centrifugação, com capacidade para 15mL
    • Acrescentar 4 a 5mL de éter sulfúrico e agitar vigorosamente (importante para desengordurar o material).
    • Centrifugar por um minuto a 1.500rpm.
    • Se formarão 4 camadas – no fundo está o sedimento com os parasitos

Centrífugo-sedimentação, Método de Ritchie, de Blagg ou “formol-éter”

    • Com o auxílio de um bastão, descolar a camada de detritos da parede do tubo.
    • Inverter o tubo para desprezar o liquido, mantendo-o com a boca voltada para baixo, até limpar a parede do mesmo, utilizando um bastão de vidro (ou palito de picolé) contendo algodão na extremidade.
    • Inverter o tubo em uma lâmina, deixando escoar todo o sedimento. Se a quantidade de sedimento for excessiva, utilizar uma pipeta para colhê-lo e preparar as lâminas.
    • Colocar uma gota de lugol
    • Cobrir com lamínula e examinar com as objetivas de 10 e 40X em “zig-zag”

Centrífugo-sedimentação, Método de Ritchie, de Blagg ou “formol-éter”

  • Método dos mais recomendados

  • Rápido

  • Fácil

  • Sensível

  • Desvantagem: necessita de centrífuga

Centrífugo-flutuação ou Método de Faust

  • Indicado para pesquisa de cistos de protozoários; ovos leves de helmintos podem ser detectados algumas vezes

  • Procedimento

    • Diluir 10g de fezes em 20mL de água filtrada.
    • Homogeneizar bem.
    • Filtrar através de gaze dobrada em quatro, num copo plástico, e transferir para um tubo de centrífuga.
    • Centrifugar por um minuto a 2.500rpm.
    • Desprezar o líquido sobrenadante e ressuspender o sedimento em água.
    • Repetir as operações 4 e 5 mais duas ou três vezes, até que o líquido sobrenadante fique claro.

Centrífugo-flutuação ou Método de Faust

    • Desprezar a água sobrenadante e ressuspender o sedimento com uma solução de sulfato de zinco a 33%, densidade de 1,18g/mL.
    • Centrifugar novamente por um minuto a 2.500rpm.
    • Os cistos e alguns oocistos de protozoários e os ovos leves, presentes na amostra fecal, estarão na película superficial. Recolher a película com alça de platina, colocar numa lâmina, acrescentar uma gota de lugol e cobrir com lamínula.
    • Examinar com as objetivas de 10x e 40 x.
  • Observação: O material deve ser examinado imediatamente, pois o contato com a solução de sulfato de zinco pode deformar as formas parasitárias, especialmente os cistos de protozoários.

Flutuação espontânea ou Método de Willis

  • Bom para pesquisa de ovos leves como de ancilostomídeos

  • Procedimento:

    • Colocar 10g de fezes em um frasco Borrel (pode ser usado o próprio frasco no qual as fezes foram enviadas).
    • Diluir as mesmas em solução saturada de açúcar ou sal (NaCl).
    • Completar o volume até a borda do frasco.
    • Colocar na boca do frasco uma lâmina, que deverá estar em contato com o líquido.
    • Deixar em repouso por cinco minutos.
    • Findo esse tempo, retirar rapidamente a lâmina, voltando a parte molhada para cima.
    • Levar ao microscópio e examinar com objetiva de 1ox e 40x.

Método para demonstração de larvas de helminto

  • Avaliação de larvas de helmintos

  • Baseado no hidrotropismo e termotropismo das larvas

  • Necessidade de fezes frescas e sem uso de conservantes

  • Importante redobrar os cuidados a fim de evitar contaminação no laboratório.

Método de Baermann-Moraes

  • Necessário ter preparado o aparelho de Baermann –suporte de madeira com orifícios para os funis que serão utilizados

  • Procedimento

    • Utilizar 8 a 10g de fezes.
    • Colocar numa gaze dobrada em quatro ou em uma peneira.
    • Colocar o material assim preparado sobre um funil de vidro, contendo um tubo de borracha conectado a extremidade inferior de sua haste.
    • Obliterar o tubo de borracha com uma pinça de Hoffhan e adicionar, ao funil, água aquecida (45°C) em quantidade suficiente para entrar em contato com as fezes.
    • Deixar uma hora em repouso.
    • Findo esse tempo, colher 5 a 7mL da água, em um tubo de centrífuga, abrindo-se a pinça.
    • Centrifugar a 1.000rpm por um minuto.
    • Colher o sedimento, sem desprezar o liquido sobrenadante e examinar ao microscópio (10x). Caso se detecte a presença de larvas, essas deverão ser coradas com lugol e observadas com a objetiva de 40x, para identificação

Método de Baermann-Moraes

Método de Rugai

  • Retirar a tampa do recipiente que acondiciona as fezes e envolvê-lo em uma gaze dobrada em quatro, fazendo uma pequena "trouxa".

  • Colocar o material assim preparado, com a abertura voltada para baixo, num cálice de sedimentação, contendo água aquecida (45°C), em quantidade suficiente para entrar em contato com as fezes.

  • Deixar uma hora em repouso.

  • Retirar cuidadosamente a trouxa

  • Colher o sedimento no fundo do cálice, com a ajuda de uma pipeta.

  • Examinar no microscópio, com a objetiva de 10x.

  • Corar as larvas com o lugol e observá-las com o maior aumento, para identificação.

Método de Rugai

Método quantitativo – Kato-Katz

  • Preparar uma solução de verde malaquita (essa solução tem a finalidade de conservar as fezes e clarificar as formas parasitárias), de acordo com a seguinte fórmula: Glicerina 100mL, Água destilada 100mL, Verde-malaquita a 3% 1 mL

  • Cortar papel celofane semipermeável em pedaços de 24mm por 30mm e deixá-los mergulhados na solução de verde malaquita por pelo menos 24 horas.

  • Colocar, sobre um papel higiênico, uma porção da amostra de fezes frescas sem conservantes.

  • Comprimir as fezes com um pedaço de tela meiálica (marca IBRAS - São Bemardo do Campo - no 120 – fios, urdume e trama: 0,091nm) ou similar de náilon. Nesta malha passam ovos de helmintos e detritos menores do que eles.

  • Retirar as fezes que passaram para a parte superior da tela e transferi-las, com o auxílio de um palito, para o orificio (6mm de diâmetro) de um cartão retangular de plástico, colocado sobre uma lâmina de microscopia.

Método quantitativo – Kato-Katz

  • Após encher completamente o orificio, retirar o cartão, cuidadosamente, deixando sobre a lâmina de vidro.

  • Cobrir as fezes com a lamínula de papel celofane embebida na solução de verde malaquita, inverter a lâmina, sobre uma folha de papel absorvente e comprimi-la.

  • Aguardar uma a duas horas e examinar ao microscópio, contando todos os ovos presentes na preparação.

  • O número de ovos encontrados no esfregaço fecal, multiplicado por 23, corresponderá ao número de ovos por grama de fezes (OPG).

Situação atual do diagnóstico parasitológico

  • Médico – às vezes pouco capacitado na indicação do exame, na orientação à coleta de material e na interpretação dos resultados. Pouca confiança no resultado do laboratório. Tratamento prévio.

  • Paciente – Coleta incorreta, atribui pouca importância à infecção parasitária, questões culturais. Auto-medicação.

  • Laboratório – exame trabalhoso, pouco padronizado, não automatizado, variabilidade intra e interobservadores, profissional pouco valorizado, qualificação profissional insuficiente, pouco compromisso/envolvimento, sobrecarga, métodos adaptados (não originais)

Informações Importantes na Solicitação

  • Dados sócio-demográficos (sexo,idade, escolaridade, ocupação, procedência)

  • Indicação clínica: sintomatologia, investigação diagnóstica, acompanhamento do tratamento, controle de cura, tratamento prévio ao diagnóstico, rotina pré-natal/ pré-operatória.

Questionamentos Importantes na entrega do material

  • Ingestão prévia de medicação, compostos químicos na semana anterior ao exame

  • Forma de coleta, tempo de coleta, preservação do material, intercorrências na coleta.

Sensibilidade X Especificidade

  • SENSIBILIDADE

  • Um teste é sensível quando seu resultado é positivo em indivíduos doentes. Pouco falso-negativo

  • ESPECIFICIDADE

  • Um teste é específico quando seu resultado é negativo em indivíduos não doentes. Pouco falso-positivo

  • EPF - BAIXA SENSIBILIDADE (muitos falsos negativos) e ALTA ESPECIFICIDADE (poucos falsos positivos)

Causas de negatividade no exame parasitológico

  • EVITÁVEIS – PROFISSIONAIS

  • Treinamento

  • Escolha do método (sensibilidade)

  • Inadequação do método

  • Leitura parcial da lâmina

  • Sobrecarga de trabalho

Causas de negatividade no exame parasitológico

  • INEVITÁVEIS - BIOLÓGICAS

  • A) Protozoários - períodos de negatividade

  • B) Helmintos

    • infecção unissexual por espécimes machos
    • fêmeas sexualmente imaturas
    • após eliminação do verme adulto
    • carga parasitária leve
    • irregularidade na postura/eliminação

Controle de qualidade

  • Treinamento dos profissionais

  • Controle externo de qualidade:

    • CONTROL- LAB – SBPC/ML
    • PNCQ – SBAC
    • INTERLABORATORIAIS
    • INTERNACIONAIS: CAP
  • Controle interno de qualidade

    • Amostra cega – amostra já processada no dia
    • Pool de amostras positivas ( COCOTECA® )
    • Amostras conservadas com parasita único
    • Lâminas com coloração permanente
    • Lâminas da rotina.

Laudo final

  • Reportar todos os parasitas encontrados

    • Sempre com os nomes científicos: grifados, ou em itálico, ou em negrito
    • Colocar o estágio de diagnóstico identificado

Exemplo:

  • Foram encontrados:

    • Ovos de Hymenolepis nana
    • Ovos de Hymenolepis nana
    • Ovos de Hymenolepis nana

    • Larvas de Strongyloides stercoralis
    • Larvas de Strongyloides stercoralis
    • Larvas de Strongyloides stercoralis

Laudo final

  • Para ausência de parasitos, reportar:

Exemplo

  • “Negativo - Não foram visualizadas formas diagnósticas de parasitas”

Ou

  • “Negativo - Não foram visualizadas formas diagnósticas de parasitas, na amostra enviada”

Laudo final

  • Reportar o(s) método(s) utilizado(s).

  • Reportar número de amostras analisadas:

Ex. “resultado positivo ou negativo e na Obs. o nº de amostras”

  • Reportar parasitas que não foram diferenciados

Ex. cistos de Entamoeba histolytica /dispar

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