Espectofotômetro

Espectofotômetro

(Parte 1 de 3)

Universidade Paulista Unip – Jundiaí Espectrofotometro em Laboratório Clínico

Alunos: Giovanna C. Poma, Luciana B. de Godoi, Carla Ap. Luiz, Marcela de Melo, Helen C. de Sá, Manoel Santos, Thaise H. dos Santos, Andressa Joana L. Ribeiro e Jéssica T. da S. Gonçalves

Sumário

Abstract

Resumo

Introdução

ESPECTROFOTOMETRIA

  1. Espectrofotômetros

Espectrofotômetros são instrumentos capazes de registrar dados de absorbância ou transmitância em função do comprimento de onda. Este registro é chamado de espectro de absorção ou de espectro de transmissão, segundo o dado registrado for de absorbância ou transmitância, respectivamente. O espectro de absorção é característico para cada espécie química, sendo possível a identificação de uma espécie química por seu “espectro de absorção”.

A característica mais importante dos espectrofotômetros é a seleção de radiações monocromáticas, o que possibilita inúmeras determinações quantitativas regidas pela Lei de Beer. Quando a região espectral usada é a ultravioleta/visível, são necessários componentes óticos de quartzo e detectores altamente sensíveis capazes de detectar radiações nessa extensa faixa espectral em que atua o instrumento. Os espectrofotômetros, em geral, contêm cinco componentes principais: fontes de radiação, monocromador, recipientes para conter as soluções, detectores e indicadores de sinal.

Os métodos espectroscópicos baseiam-se na absorção e/ou emissão de radiação eletromagnética por muitas moléculas, quando os seus electrões se movimentam entre níveis energéticos. A espectrofotometria baseia-se na absorção da radiação nos comprimentos de onda entre o ultravioleta e o infravermelho. (Fig. 1).

Fig.1. Espectro electromagnético. A espectrofotometria utiliza a radiação compreendida entre o ultravioleta (ultraviolet) e o infravermelho (infrared).

  1. Fontes de radiação

As fontes de radiação mais comuns baseiam-se na incandescência e são muito práticas no infravermelho e no visível, mas devem atuar em temperaturas elevadas na faixa do ultravioleta. As fontes de radiação são constituídas por filamentos de materiais que são excitados por descargas elétricas com elevada voltagem ou aquecimento elétrico.

Para que uma fonte de radiação seja considerada de boa qualidade deve:

- Gerar radiação continua, ou seja, emitir todos os comprimentos de onda, dentro da região espectral utilizada;

- Ter intensidade de potência radiante suficiente para permitir a sua detecção pelo sistema detector da máquina;

- Ser estável, isto é, a potência radiante deve ser constante. Além disso, deve ter vida longa e preço baixo.

  1. Tipos de fontes de radiação

3.1 Lâmpadas de filamento de tungstênio: incandescente, produz emissão continua na faixa e 320 a 2500nm. O invólucro de vidro absorve toda radiação abaixo de 320nm, limitando o uso da lâmpada para o visível e infravermelho.

3.2 Lâmpadas de quartzo-iodo: incandescente, o invólucro de quartzo emite radiação de 200 a 3000nm. Sua vantagem é que pode atuar na região do ultravioleta.

3.3 Lâmpadas de descarga de hidrogênio ou de deutério: é a mais usada para emissão de radiação ultravioleta. Consiste em um par de eletrodos fechados em um tubo de quartzo ou vidro, com janela de quartzo, preenchido com gás hidrogênio ou deutério. Aplicando alta voltagem, produz-se uma descarga de elétrons que excitam outros elétrons gasosos a altos níveis energéticos. Quando os elétrons voltam a seus estados fundamentais, emitem radiação contínua de 180 a 370nm.

3.4 Lâmpadas de catodo oco: tipo especial de fonte de linha. É preenchida com um gás nobre, a fim de manter uma descarga de arco. O cátodo tem a forma de um cilindro oco, fechado em uma extremidade, revestido com o metal cujas linhas espectrais se desejam obter. O ânodo é um fio reto ao lado do cátodo. A energia do arco causa ejeção dos átomos metálicos do revestimento do cátodo os quais, excitados, emitem os seus espectros característicos.

3.5 Lasers: pelo processo de emissão estimulada, os lasers produzem uma enxurrada de feixes muito estreitos e intensos de radiação. Todas as ondas procedentes ao material emissor estão em fase entre si, e, por isso, praticamente não apresenta dispersão quando se propaga. Isso permite uma concentração de energia num ponto muito pequeno, mesmo que esteja numa distância considerável.

A chamada radiação luminosa corresponde a uma gama de comprimentos de onda que vai desde o ultravioleta ao infravermelho no espectro da radiação eletromagnética. (Fig.2).

Fig2. Radiação luminosa.

O espectro do visível está contido essencialmente na zona entre 400 e 800 nm (Tabela 1).

Tabela 3: Comprimentos de onda da luz visível.

Cor

Comprimento de onda

(nm)

violeta

390 - 455

azul

455 - 492

verde

492 - 577

amarelo

577 - 597

laranja

597 - 622

vermelho

622 - 780

  1. Monocromadores

São dispositivos essenciais dos espectrofotômetros e tem como função a seleção do comprimento de onda e que se tem interesse para a análise. È constituído de uma fenda de entrada de um elemento de dispersão de radiação e de uma fenda de saída. O elemento de dispersão pode ser um prisma ou uma rede de difração.

4.1 Monocromadores prismáticos: a radiação policromática procedente da fonte de radiação passa pela fenda de entrada e incide sobre a face de um prisma, sofrendo desvio. Os prismas de quartzo são indicados para trabalhar na região ultravioleta, embora tenham mais dispersão que o vidro. Na região do visível são empregados primas de vidro. Os prismas de quartzo apresentam desvantagem de serem altamente refringentes e oticamente ativos.

4.2 Monocromadores reticular: o principal elemento de dispersão dos monocromadores reticulares é a rede de difração, que consiste em uma placa transparente com inúmeras ranhuras paralelas e de mesma distância. As redes de difração dispersam a radiação policromática baseadas no fenômeno da interferência, e a dispersão resultante desta rede é linear. As redes de difração possuem resolução melhor que os prismas e podem ser utilizadas em todas as regiões espectrais.

4.3 Espectrofotômetros e a Luz Monocromática: é um aparelho que faz passar um feixe de luz monocromática através de uma solução, e mede a quantidade de luz que foi absorvida por essa solução (Fig. 3). Usando um prisma o aparelho separa a luz em feixes com diferentes comprimentos de onda (tal como acontece no arco-íris com a separação das cores da luz branca). Pode-se assim fazer passar através da amostra um feixe de luz monocromática (de um único comprimento de onda, ou quase). O espectrofotômetro permite-nos saber que quantidade de luz é absorvida a cada comprimento de onda.

Fig. 3. Espectrofotômetro. A luz é dividida em feixes de diferentes comprimentos de onda por meio de um prisma óptico e passa através da amostra, contida numa cuvette ou célula de espectrofotómetro.

  1. Espectros de absorção

O conjunto das absorbâncias aos vários comprimentos de onda para um composto chamasse.

5.1 Espectro de absorção: e varia de substância para substância. Se uma substância é verde, por exemplo, então deixa passar ou reflete a cor nesse comprimento de onda, absorvendo mais a luz na região do vermelho. A seguir podem ver-se espectros de várias substâncias diferentes (Fig. 4).

Fig.4. Espectros de absorção de diferentes substâncias (1: bacterioclorofila; 2: clorofila a; 3: clorofila b; 4: ficoeritrobilina; 5: beta-caroteno). A substância 1, por exemplo, absorve pouco na região do visível, logo deve ser praticamente incolor para os nossos olhos.

Uma vez que diferentes substâncias têm diferentes padrões de absorção, a

espectrofotometria permite-nos, por exemplo, identificar substâncias com base no seu espectro. Permite também quantificá-las, uma vez que a quantidade de luz absorvida está relacionada com a concentração da substância, como vamos ver adiante. Às vezes uma substância, quando alterada quimicamente, pode passar a apresentar um espectro de absorção diferente. Quando isto acontece, temos uma maneira de detectar essas mesmas alterações. Por exemplo, o NADH reduzido absorve a 340 nm, enquanto que a forma oxidada não tem absorbância significativa a esse comprimento de onda (Fig. 5).

Fig. 5. Espectros de absorção do NAD+ e do NADH.

Essas diferenças de espectro podem ser utilizadas laboratorialmente para seguir o percurso de reacções que se esteja a estudar, por exemplo, reacções metabólicas que envolvam a oxidação do NADH ou a redução do NAD+.

5.2. Espectrofotometria e quantificação

5.2.1. Princípios de absorção da luz:

5.2.1.1. A absorção da luz é tanto maior quanto mais concentrada for a solução por ela atravessada:

Io IT1

feixe de luz de solução 10 g/l

intensidade Io

Io IT2

20g/l

Fig.6. Relação entre a concentração de uma solução e a luz absorvida. A solução 20g/l absorve o dobro da solução 10g/l.

5.2.1.2. A absorção da luz é tanto maior quanto maior for à distância percorrida pelo feixe luminoso através das amostras:

Io IT1

1 cm

feixe de luz de

intensidade Io

Io IT3

3 cm

Fig. 7. Relação entre a distância percorrida pelo feixe luminoso e a luz absorvida por uma solução. A solução contida na cuvette com 3 cm absorve 3 vezes mais luz que a contida na cuvette de 1 cm. Juntando (1) e (2), temos a lei de Beer-Lambert:

constante

(para um l fixo)

absorvância (l fixo) Al el. c.l distância percorrida

pelo feixe luminoso

concentração através da amostra

da solução

absorvente

(Parte 1 de 3)

Comentários