Microbiologia Relatório - Coloração de Gram

Microbiologia Relatório - Coloração de Gram

Matéria: Microbiologia I Professoras: Lívia e Janaína Alunas: Juliana Esteves

Patrícia Sbano Renata Gudergues Ryanna Soares Thalita Martins

Introdução

As bactérias podem ser divididas em dois grandes grupos, as Gram-Positivas e as Gram-Negativas. Assim, podem ser diferenciadas:

Gram Positivas Gram Negativas

Ala-Glu-Lya-Ala Ala-Glu-DAP-Ala

Tetrapeptídeos não se ligam diretamente

Ligação deireta entre tetrapeptídeos

Presença de mais camadas de peptídeosglicanos (cerca de 20)

Presença de menos peptídiosglicanos (cerca de 5)

Presença de ácidos tecóicos que participam da passagem de íons

Ausência de ácidos tecóicos

Não apresenta membrana externa

Presença de membrana externa flexível, sendo uma segunda bicamada fosfolipídica Ausência de periplasma Presença de periplasma

Um modo de diferenciar as bactérias gram positivas das gram negativas é pelo método denominado coloraçãop de gram. Esse método requer a utilização de corantes específicos, tais como lugol, safranina e cristal violeta. O lugol permite a formação de complexos CVI (Cristal Violeta Iodo) insolúveis em água, assim, o esfregaço com as bactérias apresentam, com o uso do cristal violeta, a coloração roxa. Depois outros passos são seguidos para a determinação, o que veremos adiante.

Outra estrutura facultativa é o esporo, presente, na maioria das vezes, em gram positivas. Permitem resistência para as bactérias, contra condições adversas, como raios UV, escassez de nutrientes, calor ou frio excessivo, desinfectantes e à desidratação. Quando as bactérias que apresentam esporos se encontram em condições adversas, ocorre o processo de esporulação, proporcionando a manutenção do material genético de forma a parar o metabolismo. O esporo é constituído de exosporo, capa e córtex. Mas quando em condições favoráveis o esporo dá origem à célula vegetativa. Há uma prática, na qual podemos visualizar os esporos a partir de coloração. Desse modo, podemos classificár a bactéria de acordo com a localização do esporo na célula, como; centrais, terminais e subterminais.

Objetivos:

Melhor visualização da matéria administrada em sala de aula sobre os dois grande grupos de bactérias existentes. Observar os resultados e discutir, com base no conteúdo, a coloração apresentada. Observar e classificar uma bactéria por meio de seus esporos, sempre concomitante com o conteúdo abordado em sala.

Materiais Utilizados:

1) Coloração de Gram

Bico de bunsen Lâminas

Tubo com Staphylococcus aureus

Salina Alça Bacteriológica Cristal violeta

Lugol Álcool absoluto Safranina Óleo de imersão Microscópio Pinça de Madeira

2) Coloração de Esporos

Bico de bunsen Lâminas Tubo com Staphylococcus aureus Salina Alça Bacteriológica Bácher Verde Malaquita Safranina Óleo de imersão Microscópio Pinça de Madeira Placa de Amianto

Metodologia:

1) Coloração de Gram

Em uma lâmina limpa, dentro da zona de segurança do bico de Bulsen, adicionam-se uma gota de salina. Com a alça bacteriológica devidamente flambada ao rubro, coleta-se o inóculo do meio de cultura e espalha-se o mesmo na lâmina junto à salina com o auxílio da alça, seguindo as recomendações de biossegurança necessárias . O espalhamento da amostra deve ser feito de modo que todo o conteúdo do inóculo esteja uniforme na lâmina a ser analisada.

Para a fixação da bactéria à lâmina, paira-se a mesma contendo o inóculo sob o bico de

Bulsen até que o líquido contido (bactéria + solução salina) seque, de modo a matar as bactérias existentes no mesmo.

Com o esfregaço preparado, adiciona-se cristal violeta, corante principal, de modo a cobrir todo o esfregaço durante um minuto. Lava-se o esfregaço com água destilada para a retirada do excesso de cristal violeta da amostra. O suficiente se apresenta quando não mais é observada a coloração roxa na água.

Posteriormente, adiciona-se lugol, que possui a função de mordente, ou seja, aumenta a afinidade do corante pela célula, de modo a cobrir todo o esfregaço durante um minuto.

Em seguida, adiciona-se o álcool absoluto, diferenciador, sua ação permite que algumas células de descorem mais facilmente que outras, a adição do álcool deve ser rápida e precisa, deve durar de 5 a 10 segundos.

Após, lava-se novamente a amostra com água destilada e adiciona-se safranina, corante secundário, que irá corar as células anteriormente descoradas com o álcool absoluto. A ação da safranina deve ser de 30 segundos.

Por fim, lava-se com água destilada e seca-se delicadamente a amostra de modo a retirar qualquer excesso de água. Coloca-se algumas gotas de óleo de imersão e observa-se a diferenciação das bactérias Gram-positivas das Gram-negativas ao microscópio óptico, utilizando a lente objetiva de imersão.

2) Coloração de Esporos

Incialmente ferve-se água em um bécher e com a água fervente, coloca-se o esfregaço sob o bécher e adiciona-se verde malaquita por 10 minutos com a lâmina sob a fervura de modo que o corante não seque na amostra. Lava-se o excesso com água destilada observando o mesmo princípio da coloração simples. A lavagem é suficiente quando não mais se observa coloração verde na água.

Cobre-se o esfregaço com safranina durante 30 segundos, seca-se a amostra delicadamente, adiciona-se o óleo de imersão e observa-se o resultado ao microscópio óptico utilizando a lente objetiva de imersão.

Resultados e Discussão:

1) Coloração de Gram

Após o proceder o método de coloração de Gram na bactéria Staphylococcus aureus a coloração final obtida havia sido roxa, em seguida pela análise microscópica foi possível visualizar que as mesmas possuiam formato esférico e arranjo em cachos.

A coloração final roxa obtida permite a classificação da bactéria Staphylococcus aureus como Gram positivas, as quais contém uma espessa parede celular de peptidoglicano dando às bactérias a capacidade de reter a cor arroxeada.

2) Coloração de Esporos

Após proceder o método de coloração de esporos e levá-los para análise microscópica foi possível observar apenas a presença de esporos, os quais encontravam-se corados de verde, e ausência de células vegetativas, indicando que as mesmas já haviam morrido devido as condições adversas passadas a um maior período de tempo restando-se apenas os esporos.

Comentários