Bioquímica

Bioquímica

CENTRO FEDERAL DE EDUCAÇÃO TECNOLÓGICA DE QUÍMICA DE NILÓPOLIS – RJ

UNIDADE NILÓPOLIS

Curso Técnico Em Química Industrial

Bioquímica

Caracterização e Dosagem de Caseína no Leite.

TURMA: QIM 261

PROFESSOR:

Aloa Souza

DATA DE REALIZAÇÃO: 23/09/2008

COMPONENTES DO GRUPO

Gabrielle Guimarães

Jean Colaço

Matheus Dantas

Raphael dos Santos

Zelia Fernanda da Silva

NILÓPOLIS

SETEMBRO DE 2008

  1. INTRODUÇÃO

A caseína (do latim "caseus", queijo) é uma proteína do tipo fosfoproteína encontrada no leite fresco. Representa cerca de 80% do total de proteínas do leite. Quando coagulada com renina é chamada de "paracaseína" (caseína de coalho) e, quando coagulada através da redução de pH (utilização de ácidos) é chamada "caseína ácida". A terminologia britânica usa o termo "caseinogênio" quando a proteína não está coagulada e "caseína" quando a proteína está coagulada. Como existe no leite é um sal de cálcio.

A caseína não coagula com o calor. É precipitada pelos ácidos ou pela renina, uma enzima proteolítica produzida no estômago dos vitelos (bezerros) recém-nascidos (também é produzida por alguns tipos de plantas e micróbios). A enzima tripsina hidrolisa a peptona retirando o fosfato.

A caseína contém um número razoavelmente alto de peptídeos de prolina que não interagem. Não apresenta nenhuma ponte dissulfeto. Como conseqüência apresenta relativamente pouca estrutura secundária ou estrutura terciária, não formando estruturas globulares. Por isso não pode desnaturar. É relativamente hidrofóbica, tornando-se pouco solúvel em água. Encontra-se no leite como uma emulsão de partículas de caseína (micelas de caseína), de modo que a região hidrófoba (apolar) fica no interior e a região hidrófila (polar) na superfície exposto a água. As caseínas das micelas se prendem juntas por íons de cálcio e interações hidrofóbicas.

Além de ser consumido no leite, produção de derivados do leite (como queijo), a caseína é usada na produção de adesivos, plásticos (para punhos de facas, cabos de guarda-chuvas, botões, etc), como aditivo de alimentos e para a produção de vários produtos alimentícios e farmacêuticos.

O ponto isoelétrico da caseína é 4.6. É o ponto de pH em que ela precipita (coagulação ácida). A proteína purificada é insolúvel em água. Enquanto é insolúvel em soluções salinas neutras, prontamente se dispersa em meio alcalino diluído e em soluções salinas tais como oxalato de sódio e acetato de sódio. Além disso, a caseína faz muito bem à saúde.

Algumas pessoas com autismo e síndrome de Asperger são sensíveis a caseína e ao glúten. Antigamente pensava-se que autistas tinham incompatibilidade com lactose, mas descobriu-se que na verdade é com a caseína. A síndrome de Asperger é uma síndrome do espectro autista, diferenciando-se do autismo clássico por não apresentar nem retardamento no desenvolvimento cognitivo ou da linguagem do portador.

2. OBJETIVOS

Determinar a concentração de caseína em leite bovino UHT do tipo C e da marca Parmalat® pelo método espectrofotométrico.

3. MATERIAIS E MÉTODOS

Materiais: Pipetas graduadas (2, 5, 10mL); Tubos de ensaio; Papel indicador de pH; bastão de vidro; Bécher (100mL); Estante para tubos de ensaio; Tubo de centrífuga plástico com tampa; Centrífuga; Espectrofotômetro; Leite bovino tipo C; HCl 2%; Solução mão de Caseína a 5mg/mL; Reagente de Biureto.

Métodos:

Primeiramente, precipitou-se a caseína, pelo método de precipitação isoelétrica, diluindo-se 10mL de leite em 10mL de água destilada em um bécher de 100mL, pipetou-se para o mesmo recipiente 2mL de ácido clorídrico 2% para que o pH fosse ajustado numa faixa em que a caseína precipitasse. Transferiu-se todo o conteúdo para um tubo de centrífuga plástico com tampa e centrifugou-o a 2000rpm durante cinco minutos. Em um tubo de ensaio adicionou-se 1mL do sobrenadante do centrifugado à 9mL de água destilada e em um tubo de ensaio com tampa adicionou-se 1mL desta solução diluída (tubo 7).

Posteriormente, em um tubo de ensaio adicionou-se 0,1mL de leite e 9,9 mL de água destilada e desta solução pipetou-se 0,5mL para um outro tubo de ensaio (tubo 9).

Antes de levar as amostras ao espectrofotômetro, preparou-se tubos para a construção de uma curva de calibração (ou curva analítica), como descrito na tabela abaixo:

Tab. 1.: Esquema de dosagens para preparação da curva de calibração.

Tubos

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Solução mãe de caseína

(5mg/mL)

-

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

-

-

-

Água destilada (mL)

1,0

0,8

0,6

0,4

0,2

-

-

5,5

0,5

Amostra (mL)

-

-

-

-

-

-

1,0

0,5

0,5

Reagente de Biureto (mL)

5

5

5

5

5

5

5

-

5

Os tubos 1 ao 6 são utilizados na construção da curva de calibração. Após a adição de todos os componentes nos respectivos tubos, agitaram-se os mesmos e marcou-se vinte minutos de repouso para que a análise espectrofotométrica fosse então feita.

4. RESULTADOS E DISCUSSÕES

Após análise no espectrofotômetro, obtiveram-se os seguintes valores de absorbância para os respectivos tubos:

Tab.2: Valores de Absorbância

Tubos

Absorbância

1

0,0001

2

0,0242

3

0,0390

4

0,0541

5

0,0742

6

0,0912

7

0,1851

8

9

0,0604

O reagente de Biureto é usado pelo fato de que a espectrofotometria é baseada na absortividade de moléculas no espectro visível, ou seja, a substância em questão deve encontrar-se em meio colorido para que seja possível a análise espectrofotométrica. Por isso que o tubo 1 da curva de calibração e adotado como branco, pois o valor do mesmo é descontado dos outros tubos pelo espectrofotômetro, resultando na absorbância apenas da substância, pois o Biureto forma uma complexo estável com a proteína, por isso as diferentes colorações nos tubos, quanto maior a concentração de proteínas mais forte é a coloração do tubo.

A curva de calibração é função da absorbância versus massa de caseína, o cálculo da massa de caseína presente nos tubos de 1 ao 6 é feito a partir da concentração da solução mãe de caseína pela seguinte proporção:

5mg _____ 1mL

X mg ____ Y mL

Como o valor do volume em mililitros é conhecido (já descrito na tabela 1), obteve-se as seguintes massas nos respectivos tubos:

Tubos

Massa (mg)

1

0,0

2

1,0

3

2,0

4

3,0

5

4,0

6

5,0

Tab. 3: Massa em miligramas de Caseína.

De posse dos valores de absorbância e massa dos tubos de 1 a 6, construiu-se um gráfico, que pode ser observado abaixo:

Gráfico 1.: Curva de Calibração de Absorbância por Massa de Caseína.

Conhecendo-se o valor da média das absorbâncias e das massas da curva de calibração, a determinação a quantidade de proteínas dos tubos 7 e 9 consiste em montar uma relação direta entre a absorbância conhecida no tubo em questão para massa X que deseja-se descobrir, com as citadas anteriormente. É possível fazer essa relação, também pela lei de Lambert-Beer que diz que a absorbância é diretamente proporcional a concentração, então mesmo que haja alguma perda de massa durante o procedimento não haverá interferência no resultado final, pois a concentração dentro do tubo não muda. Contudo, para isso a curva de calibração deveria ser feita em função da concentração.

Procedendo-se com o cálculo descrito acima, obteve-se:

Tubo 7:

Massa Asorbância

2,5 0,047133

x 0,1851

x = 9,818 mg = 0,009818g

C = 0,009818 g/ 0,001L = 9,818g/L

Considerando a diluição

Tubo 9:

Massa Absorbância

2,5 0,047133

y 0,0604

y = 3,202 mg = 0,003202g

C = 0,003202/ 0,0005 = 6,404g/L

A massa encontrada corresponde a quantidade diluída adicionada ao tubo, para determinar a quantidade na amostra deve-se considerar as diluições da maneira demonstrada abaixo.

Tubo 7 - Com os valores encontrados anteriormente, a percentagem (m/v) das proteínas do sobrenadante seria:

9,818.0,001 = C.0,01

C = 0,9818 g/L

0,9818g/L = 0,09818 g/100mL

0,09818%

Tubo 9:

6,404.0,0005 = C.0,0001

C = 32,02g/L

32,02 g/L = 3,202g/100mL

3,202%

A quantidade encontrada no tubo 7 é correspondente as proteínas do sobrenadante da precipitação da solução de caseína (PS) e a quantidade encontrada no tubo 9 é correspondente as proteínas totais do leite (PT). A quantidade de caseína pode ser determinada pela seguinte relação:

PT – PS = proteína precipitada = caseína.

3,202 – 0,09818 = 3,1038%

O valor encontrado acima, expressa que o procedimento foi executado com certa coerência, contudo a caseína compõe aproximadamente 80% das proteínas do leite, valor este que foi ultrapassado. Esta incompatibilidade de resultados práticos com teóricos provém de algum erro técnico. Um muito comum é o erro da diluição em um dos tubos, o tubo 7 provavelmente teve sua diluição feita de forma errônea ficando mais diluído que o esperado e alterando o valor da caseína. O valor das proteínas totais está bem próximo do valor real (6,2g/200mL), confirmando o fato de que o erro das proteínas do sobrenadante não está embutido na amostra e sim na execução do método.

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

  • CISTERNAS, Josè Raul; VARGA, José; MONTE, Osma / Fundamentos da Bioquímica Experimental / 2°edição – São Paulo. Editora Atheneu, 2001.

  • www.autismoinfantil.com.br/gluten-e-caseina.html

  • aspergerautismo.wordpress.com

  • www.cepde.rj.gov.br/autismo_sd.htm

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