Determinação proteína Kjeldahl

Determinação proteína Kjeldahl

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

DEPARTAMENTO DE NUTRIÇÃO – CCS

BIOQUÍMICA DOS ALIMENTOS

Determinação de Proteínas Totais

Método de Kjeldahl

PROFa. Karla Suzanne Damasceno

1. Introdução

O procedimento mais comum para a determinação de proteína é através da determinação de um elemento ou um grupo pertencente à proteína. A conversão para conteúdo de proteína é feita através de um fator. Os elementos analisados geralmente são carbonoou nitrogênio, e os grupos são aminoácidos e ligações peptídicas (CECCHI, 2003).

O método mais utilizado para dosagem de proteínas foi proposto por Kjeldahl na Dinamarca em 1883, quando estudava proteína em grãos. Este método determina N orgânico total, isto é, o N protéico e não protéico orgânico. Porém, na maioria dos alimentos, o N não protéico representa muito pouco no total. Para converter o nitrogênio medido em proteína, multiplica-se o conteúdo de nitrogênio por um fator geral que é obtido com base no fato de que, na maioria das proteínas, o teor de N é em torno de 16%. Então:

100 gproteínas -------------- 16g N

x g proteínas -------------- n g N

x = n x 100 = n x 6,25 g proteínas

16

Fator geral de conversão do N em proteínas é 6,25.

2. Método de Kjeldahl

2.1 Fundamento

Baseia-se no aquecimento da amostra com ácido sulfúrico e catalizador para a digestão até que o carbono e o hidrogênio sejam oxidados. O nitrogênio da proteína é reduzido e transformado em sulfato de amônia. Adiciona-se NaOH concentrado e aquece-se para a liberação da amônia dentro de um volume conhecido de uma solução de ácido bórico, formando borato de amônia. O borato de amônia formado é dosado com uma solução ácida (HCl) padronizada.

2.2. Amostra

- 0,2g da amostra seca

2.3 Reagentes

- Ácido sulfúrico P.A, d = 1,84 - 5mL

-Mistura catalítica – 2g (Na2SO4 e CuSO4.5H2O)

- NaOH 40% - 20mL

- Solução de ácido bórico 3% - 5mL

- Solução de HCl 0,1N

- Solução indicadora: vermelho de metila 0,2% + azul de metileno 0,2%

2.4 Equipamentos

- Tubo de Kjeldahl

- Bloco digestor

- Destilador

- Erlernmeyer 250mL

- Bureta

2.5 Técnica

O método consiste de 3 fases: a) digestão, b) destilação e c) titulação.

2.5.1. Digestão da amostra

- Pese 0,2g da amostra em papel de filtro livre de N.

- Coloque a amostra com o papel no tubo de Kjedahl.

- Adicione 2g da mistura catalítica.

- Adicione, com cuidado, 5mL de ácido sulfúrico. Agite. (Na capela).

- Coloque para digerir no bloco digestor com a chapa a 450°C.

- Deixar digerindo em aquecimento até que o conteúdo do balão fique límpido e transparente (azul ou verde claro). A digestão termina quando os gases brancos desaparecem e o material contido no tubo de Kjeldahl tornar-se límpido. Isto varia de 1 – 3h, dependendo da amostra.

- Deixe esfriar.

2.5.2. Destilação da amônia (Para operar o destilador siga as instruções em anexo)

- Coloque 15mL de água destilada no tubo até dissolver a amostra.

- Esfrie o tubo em banho de gelo ou água corrente;

- Coloque o tubo com a amostra digerida no destilador;

- Coloque 20mL de NaOH 40%, com a torneira fechada. Abrir um pouco a torneira e deixar escorrer bem lentamente;

- Ligue a chave de aquecimento;

- Coloque 10mL de ácido bórico 3% em um erlenmeyer de 250mL com 3 gotas de indicador misto.

- Coloque o erlenmeyer com o ácido bórico e indicador no bico do condensador;

- Deixe destilar até a cor verde, e espere completar um volume de cerca de 50mL para garantir o término da evaporação e condensação de toda a amônia presente na amostra.

- Retire o erlenmeyer e desligue a chave de aquecimento;

2.5.3. Titulação

- Titule o borato de amônio com solução de ácido clorídrico 0,1N

- Anote o volume gasto na titulação.

Cálculos

Proteína total (%) = V x f x 0,0014 x 6,25 x 100

P(g)

Proteína total (%) = V x f x 0,008755 x 100

P(g)

Onde:

V = volume gasto de HCl 0,1N

f = fator do HCl 0,1N

0,0014 = miliequivalente grama do nitrogênio

6,25 = fator de conversão geral do nitrogênio em proteína

P = peso

Referências

BRASIL. Ministério da Saúde. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos. Edição IV. Instituto Adolfo Lutz. Brasília: Ministério da Saúde, 2005.

CECCHI, Heloisa Máscia. Fundamentos teóricos e práticos em análise de alimentos. 2°ed.rev. Campinas: Editora Unicamp, 2003.

SILVA, Dirceu Jorge; QUEIROZ, Augusto Cézar de. Análise de alimentos. Métodos químicos e biológicos. 3 ed. Viçosa: UFV, 2002.

ANEXO

Instruções de uso do destilador

Siga os seguintes passos:

1. Ligue o aparelho:

- Verifique se todos os botões da frente estão desligados e o potenciômetro no zero;

- Ligue a água da torneira e o equipamento na tomada;

- Ligue a chave geral;

- Verifique a água da caldeira (se estiver vazia, ligar o botão “nível” e verificar o enchimento).

2. Aqueça a caldeira:

- Verifique se a torneira do copo dosador está fechada;

- Conecte um tubo vazio;

- Coloque um erlenmeyer no bico do condensador;

- Ligue a chave de aquecimento;

- Coloque o potenciômetro no n° 7;

- Quando aquecer, retirar o tubo vazio. Para iniciar a destilação da amostra

3. Inicie a destilação:

- Coloque 15mL de água destilada no tubo de Kjeldahl até dissolver a amostra.

- Esfrie o tubo em banho de gelo ou água corrente;

- Coloque o tubo com a amostra digerida no destilador;

- Coloque 20mL de NaOH 40%, com a torneira fechada. Abrir um pouco a torneira e deixar escorrer bem lentamente;

- Ligue a chave de aquecimento;

- Coloque o erlenmeyer com o ácido bórico e indicador no bico do condensador;

- Deixar até a viragem, e aguardar para que complete um volume de  50mL

- Retire o erlenmeyer e desligue a chave de aquecimento;

- Se for continuar a fazer análises, verifique o nível de água da caldeira. Se estiver vazia, aperte no botão de nível para encher (com o aquecimento desligado).

4. Limpe o equipamento:

- Antes de ser desligado, o equipamento deve ser lavado;

- Lave o copo dosador com água destilada e pisseta;

- Conecte um tubo de digestão com água destilada para fazer uma destilação.

5. Desligue o equipamento

- Desligue a chave de aquecimento;

- Desligue a chave geral e desligue da tomada;

- Feche a torneira.

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