Relatorio-escurecimento enzimatico

Relatorio-escurecimento enzimatico

Universidade Federal do Rio Grande do Norte

Centro de Ciências da SaúdeDepartamento de NutriçãoDisciplina de Bioquímica dos Alimentos

ESCURECIMENTO ENZIMÁTICO POR POLIFENOLOXIDASE(PFO)

Discentes:

Ana Gabriella Costa Lemos da Silva Hoziana Cunha de MedeirosRamon Morais Lopes 

Docente:Nély Holland

Natal/RN2010.2

1 – INTRODUÇÃO

No escurecimento enzimático, as oxidases (polifenoloxidase, ascorbato oxidase, lipoxidase, etc) são ativas somente nos primeiros passos da reação, na conversão de fenol, enediol ou grupos funcionais dienos conjugados para compostos carbonilas ativos. As reações que seguem as oxidações enzimáticas não são enzimáticas.

O escurecimento enzimático devido à PFO é de importância comercial particularmente em tecidos vegetais. Normalmente, os substratos fenólicos naturais (ácido caféico, ácido protocatechico, ácido clorogênico, etc) estão separados da PFO em tecidos intactos e o escurecimento não ocorre.

A exposição das superfícies de frutas e vegetais cortados ao ar resultam em rápido escurecimento devido à oxidação enzimática dos compostos fenólicos presentes para ortoquinonas, que por sua vez polimerizam-se rapidamente para formar pigmentos marrons de melaninas. Na reação catalisada PFO, o substrato fenólico é oxidado e o oxigênio serve como aceptor de hidrogênio. Assim, operações como corte, descascamento e contusão são suficientes para causa escurecimento enzimático.

A polifenoloxidase contém o cobre como produto prostético, podendo este ser removido, tornando a enzima inativa.

A fenolase ou a polifenoloxidase catalisa dois tipos de reação:

a) Hidroxilação de monofenóis para difenóis, referido como fenol hidrolase ou cresolase, monofenol ou terosinase.

b) Oxidação de difenóis para ortoquinona, referida como atividade de catecolase ou polifenoloxidase.

2 – OBJETIVOS

Inativar termicamente a polifenoloxidase (método do branqueamento); verificar o efeito do ácido ascórbico e do bissulfito de sódio na atividade da polifenoloxidase e verificar o efeito do ácido ascórbico, ácido cítrico, bissulfito de sódio e cloreto de sódio na atividade da polifenoloxidase da berinjela.

3 – METODOLOGIA

3.1- Inativação térmica da PFO – tratamento térmico (branqueamento)

No procedimento foram utilizados os seguintes componentes, respectivamente, como amostra: batata, banana, maçã e berinjela. Foram adicionadas 30 g de batata em água fervente por 1 minuto e outras 30 g por 2 minutos. Em seguida cada amostra foi resfriada em água fria e homogeneizada, em liquidificador com 300 ml de água destilada. Foram pipetados 4 ml de catecol 0,2% em tampão fosfato 0,05 M pH 6,0 e em seguida adicionados 0,5 ml de água destilada e 0,5 de amostra obtida anteriormente. Os tubos de ensaio foram encubados em banho-maria termostatizado a 40 °c durante 20 minutos, para que em seguida a coloração obtida pudesse ser observada. O processo foi seguido com as três amostras seguintes.

3.2 - Efeito do ácido ascórbico na atividade da polifenoloxidase

Foram adicionados 4 ml de solução de catecol 0,2% em tampão fosfato 0,05M pH 6,0 em 5 tubos de ensaio. A partir de soluções de ácido ascórbico 0,5%, foram preparadas soluções de ácido ascórbico de concentrações de 0,25%, 0,1%, 0,05% e 0,02%, as quais foram adicionadas, inclusive a 0,5%, nos 5 tubos de ensaio. Foram adicionados também 0,5 ml de extrato de PFO e deixados em repouso por 10 minutos, para que então pudessem ser observadas as colorações e a ocorrência ou não de escurecimento enzimático em cada concentração de inibidor.

3.3 - Efeito do bissulfito de sódio na atividade da polifenoloxidase

Foram adicionados 4 ml de solução de catecol 0,2% em tampão fosfato 0,05M pH 6,0 em 5 tubos de ensaio. A partir de soluções de bissulfito de sódio 0,5%, foram preparadas soluções de ácido ascórbico de concentrações de 0,25%, 0,1%, 0,05% e 0,02%, as quais foram adicionadas, inclusive a 0,5%, nos 5 tubos de ensaio. Foram adicionados também 0,5 ml de extrato de PFO e deixados em repouso por 10 minutos, para que então pudessem ser observadas as colorações e a ocorrência ou não de escurecimento enzimático em cada concentração de inibidor.

3.4 - Efeito do ácido ascórbico, ácido cítrico, bissulfito de sódio e cloreto de sódio na atividade da polifenoloxidase da berinjela

Foram preparadas 30 ml de solução de ácido ascórbico a 0,5%, ácido cítrico a 0,5% e 1,0%, bissulfito de sódio a 0,5%, 0,25%, 0,1%, 0,05% e 0,02% e cloreto de sódio a 1,0% e 0,5%. 30 ml de cada concentração foram colocadas em placas de Petri numeradas. Uma berinjela foi descascada e cortada em fatias de 0,7 cm de espessura e foi colocada uma fatia sobre cada placa de Petri. As amostras foram trituradas com bastão de vidro em suas respectivas placas, para que em seguida fossem observadas suas colorações diante de cada solução.

4 – RESULTADOS E DISCUSSÕES

4.1- Inativação térmica da PFO – tratamento térmico (branqueamento)

A mudança de cor de acordo com tempo em que as amostras foram imersas em água fervente pode ser observada na tabela 1.

Tabela 1: Mudança de cor das amostras de acordo com o tempo de imersão em água fervente

PFO

1 minuto

2 minutos

Batata

-

-

Banana

++

-

Maça

-

-

Berinjela

++

+

Legenda:

- : incolor

+: marrom de intensidade muito leve

++: marrom de intensidade leve

O branqueamento é um processo bastante utilizado na indústria de alimentos. Consiste na promoção de um choque térmico no alimento, onde esse é exposto à água em temperatura de pré-fervura e em seguida exposto a uma baixa temperatura. Esse processo inativa a enzima polifenoloxidase (PPO), uma vez que a exposição da mesma a altas temperaturas pode causar mudanças na sua forma dimensional (desnaturação) tirando sua capacidade de catalisar reações de oxidação dos compostos fenólicos, as quais são responsáveis pelo escurecimento das frutas.

O resultado mostrou que o a exposição da mistura contendo extrato da batata, catecol e água destilada ao calor é eficiente para inativar a PPO em apenas 1 minuto, conclui-se isso pela ausência de cor do líquido. Para inativação do PPO da banana foi necessário 2 minutos na água em temperatura de fervura, pois ao fim desse tempo a mistura contendo catecol, água destilada e extrato de banana gerou uma solução incolor. A exposição da mesma mistura durante 1 minuto na água em temperatura de fervura resultou em um líquido de cor classificada como marrom de intensidade média. Isso indica que a enzima não foi inativada e desenvolveu sua atividade catalítica da oxidação dos fenóis, gerando escurecimento. Assim como na batata, a exposição da mistura contendo catecol, água destilada e estrato de maçã durante 1 minuto foi o suficiente para inativar a enzima PPO, pois o resultado foi um líquido incolor. A exposição da mistura contendo catecol, água destilada e extrato de berinjela à água em temperatura fervente durante 1 e 2 minutos não foi suficiente para inativar a enzima PPO, a mistura gerou respectivamente uma coloração classificada como marrom de intensidade média e marrom de intensidade leve, indicando que houve atividade enzimática de escurecimento realizado pela PPO.

4.2 - Efeito do ácido ascórbico na atividade da polifenoloxidase

A mudança de cor das amostras de acordo com as diferentes concentrações de ácido ascórbico pode ser observada na tabela 2.

Tabela 2: Mudança de cor das amostras de acordo com as concentrações de ácido ascórbico

Ácido ascórbico

PFO batata

PFO banana

PFO maçã

PFO berinjela

0,50%

-

-

-

-

0,25%

-

-

-

-

0,10%

-

+

-

-

0,05%

+

++

+

+

0,02%

++

+++

++

++

Legenda:

- : incolor

+: marrom de intensidade muito leve

++:marrom de intensidade leve

+++:marrom de Intensidade intermádiária

O ácido ascórbico é um potente antioxidante que atua de duas formas na manutenção das cores naturais das frutas. A propriedade já citada desse ácido, conhecido popularmente por Vitamina C, atua reduzindo as ortoquinonas ao fenol anterior, impedindo-as de se polimerizarem formando as melaninas, responsáveis pela coloração amarronzada dos frutos injuriados mecanicamente ou cortados. Outra ação desse ácido é a sua capacidade de diminuir o pH do meio, essa ação favorece a inibição da atividade da polifenoloxidase, a qual tem máxima atividade por volta de pH 6, sendo assim a reação de hidroxilação dos fenóis em orto-difenóis não será iniciada e as frutas permanecerão com a cor de colheita por um bom tempo.

Como se pode perceber através da análise da tabela 2, a mínima concentração do ácido ascórbico capaz de não permitir a reação de escurecimento enzimático é igual a 0,10%. Essa mínima concentração permaneceu para manutenção da cor de colheita da maçã e da berinjela. Já na banana a concentração de 0,10% foi responsável por uma coloração classificada como marrom de intensidade leve, isso indica que essa concentração não foi capaz de inibir a reação de escurecimento. Para a banana a mínima concentração foi 0,25%.

4.3 - Efeito do bissulfito de sódio na atividade da polifenoloxidase

A mudança de cor das amostras de acordo com as diferentes concentrações de bissulfito de sódio pode ser observada na tabela 3.

Tabela 3: Mudança de cor das amostras de acordo com as concentrações de bissulfito de sódio

Bissulfito de sódio

PFO batata

PFO banana

PFO maçã

PFO berinjela

0,5%

-

-

-

-

0,25%

-

-

-

-

0,10%

-

-

-

-

0,05%

-

+

-

-

0,02%

++

+++

++

++

Legenda:

- : incolor

+: marrom de intensidade muito leve

++:marrom de intensidade leve

+++:marrom de Intensidade intermádiária

Comparando a ação do bissulfito sobre a conservação da coloração natural dos frutos com a ação do acído ascórbico, podemos perceber, pela análise da tabela 3, que aquele é mais eficaz. Essa alta eficácia é garantida pela capacidade que esse composto de fórmula NaHSO3 tem de se complexar ao grupo prostético da enzima polifenoloxidase, o cobre. Quando isso ocorre essa enzima perde sua capacidade de hidroxilação dos fenois, não ocorrendo o escurecimento enzimático. Ela também atua revertendo a reação de hidroxilação dos fenóis em orto-difenois e reação de oxidação dos orto-difenois em orto-quinonas. Ou seja, mesmo se o escurecimento tiver sido iniciado e estiver nas fazes citadas, o bissulfito tem a capacidade de reverter.

A menor concentração desse composto responsável pela inativação da polifenoloxidase foi igual a 0,02% para batata, maçã e berinjela. Essa mesma concentração usada na banana gerou uma coloração classificada como marrom de intensidade leve. Isso demonstra que ela não foi inativada. Para que a inativação ocorrese foi necessário uma mínima concentração de 0,10%.

Apesar dos resultados bastante efetivos na inativação da polifenoloxidase, o bissulfito de sódio tem seu uso limitado pela legislação por ser tóxico e seu resíduo causar vários problemas ambientais (Oga, 1996).

4.4 - Efeito do ácido ascórbico, ácido cítrico, bissulfito de sódio e cloreto de sódio na atividade da polifenoloxidase da berinjela

A mudança de cor das amostras de acordo das diferentes concentrações de ácido ascórbico, ácido cítrico, bissulfito de sódio e cloreto de sódio pode ser observada na tabela 4.

Tabela 4: Mudança de cor das amostras de acordo das diferentes concentrações de ácido ascórbico, ácido cítrico, bissulfito de sódio e cloreto de sódio

PLACAS

AMOSTRA

RESULTADO

1

Berinjela + 30 mL água

+ + + + + +

2

Berinjela + 30 mL ác. ascórbico 0,5%

+ +

3

Berinjela + 30 mL ác. cítrico 1,0%

+ + +

4

Berinjela + 30 mL ác. cítrico 0,5%

+ + + +

5

Berinjela + 30 mL NaHSO3 0,5%

+

6

Berinjela + 30 mL NaHSO3 0,25%

+

7

Berinjela + 30 mL NaHSO3 0,1%

-

8

Berinjela + 30 mL NaHSO3 0,05%

-

9

Berinjela + 30 mL NaHSO3 0,02%

+ +

10

Berinjela + 30 mL NaCl 1,0%

+ + + + +

11

Berinjela + 30 mL NaCl 0,5%

+ + + +

Legenda:

-: incolor

+: marrom de intensidade muito leve

++: marrom de iIntensidade leve

+++: marrom de intensidade intermediária

++++: marrom de intensidade forte

+++++: marrom de intensidade muito forte

++++++: marrom super intenso

Agentes acidulantes são freqüentemente usados para manter o pH do meio mais baixo que o pH ótimo para a ação catalítica das enzimas em alimentos. Exemplos de acidulantes que podem inibir o escurecimento enzimático são os ácidos cítrico, málico e fosfórico (ZEMEL et all. 1990). Na prática experimental foi utilizado o ácido cítrico que age de duas formas para o cancelamento do escurecimento enzimático. Ele pode agir como redutor do pH ou como quelante do cobre da enzima polifenoloxidase. Segundo Macedo (2005) as polifenoiloxidases são enzimas que possuem os íons Cu2+. A remoção desses íons do sítio ativo por quelação inativa a enzima. No entanto, para a prática experimental, o ácido cítrico não foi um bom inibidor do escurecimento enzimático nas concentrações 0,5% e 1,0%, os mesmos apresentaram respectivamente uma coloração classificada como marrom de intensidade forte e marrom de intensidade intermediária, com isso pode se concluir que o aumento da concentração desse ácido provoca diminuição da atuação da polifenoloxidase da berinjela.

O bissulfito de sódio pode agir diretamente nas enzimas pela diminuição do número de pontes dissulfeto no centro catalítico (SAYAVEDRA-SOTO e MONTGOMERY, 1988; WALKER e FERRAR, 1998), ou nos compostos de reação, formando sulfonatos sem coloração, ou reduzindo-os aos fenóis precursores (WONG, 1995; ARAÚJO, 1999). Na prática experimental a melhor concentração para inativação da polifenoloxidase foi 0,1% e 0,05%, pois o resultado foi um líquido classificado como incolor. As concentrações 0,25% e 0,5% garantiram uma coloração para o líquido que circundava a berinjela classificado como marrom de intensidade muito leve e a concentração 0,02 uma cor marrom de iIntensidade leve. As concentrações 0,05% e 0,1% geraram uma líquido incolor, indicando a inativação da enzima. No entanto na literatura os resultados para essa prática não são coerentes com esse resultado, normalmente com o aumento da concentração do bissulfito de sódio ocorre diminuição da atividade da polifenoloxidase, que resulta em um líquido incolor.

A imersão do tecido vegetal em água após injúria mecânica ou corte faz com que a reação de escurecimento enzimático não seja realizada, pois para ela ocorrer é necessário, além da enzima polifenoloxidase se ligar ao seu substrato, os compostos fenóis, é preciso o oxigênio. Na água a concentração do O2 é muito limitada quando comparada com a concentração do ar, por esse motivo na água a reação de escurecimento enzimática é mais lenta, no entanto ela ainda se processa e na prática experimental a imersão da berinjela em água destilada resultou na coloração mais intensa do estudo, a qual foi classificada como marrom super intenso.

O ácido ascórbico, ou vitamina C, além de atribuir valor nutricional aos alimentos, também apresenta ação redutora. Juntamente com seus sais neutros compõe um dos principais grupos de antioxidantes empregados em produtos vegetais com o intuito de prevenir o escurecimento e outras reações oxidativas de duas maneiras: (1) agindo diretamente na enzima, complexando o cobre do grupo prostético da PPO, causando sua inibição; (2) reduzindo as quinonas a sua forma anterior de fenóis, impedindo a formação dos pigmentos escuros (SAPERS e MILLER, 1998). O ácido ascórbico foi usado na presente prática experimental para inativação da polifenoloxidase da berinjela em dois momentos, no primeiro a concentração de 0,5% resultou em um líquido incolor, no segundo a mesma concentração promoveu uma coloração classificada como marrom de iIntensidade leve. Esse fato pode ser explicado por duas causas; no primeiro experimento contendo ácido ascórbico e berinjela, a enzima foi obtida através do extrato de berinjela, isso pode ter resultado em uma melhor extração da polifenoloxidase, que ficou em maior concentração, podendo agir com maior eficácia, quando comparado com o segundo experimento, onde as únicas enzimas que estavam agindo eram provenientes da superfície do tecido vegetal que tinha sido cortado da berinjela. Outro motivo pode ter sido advindo de erros na legenda, já que grupos diferentes realizaram os experimentos.

O NaCl não apresentou um bom resultado para o bloqueio da reação de escurecimento enzimático. A concentração de 0,05% foi responsável pela coloração do líquido que circundava a berinjela classificada como marrom de intensidade forte e a concentração 0,1% gerou uma coloração marrom de intensidade muito forte. Isso indica a fraca ação do NaCl para o bloqueio dessa reação.

REFERÊNCIAS

1 - ARAÚJO, J. M. A. Química de alimentos: teoria e prática. 2. ed. Viçosa: UFV, 1999. p. 319-329.

2 – CARNEIRO, Cristine et al. Estudo das atividades de peroxidades e polifenoloxidase de guariroba (Syagrus oleracea Becc) sob a ação de diferentes inibidores. Goiás: Acta Scientiarum: Biological Sciences, 2003.

3- LUPETTI, Karina et al. Análise da imagem em química analítica: empregando metodologias simples e didáticas para entender e prevenir o escurecimento de tecidos vegetais. São Paulo: Química Nova, 2005.

4 - OGA, S. Aditivos alimentares, In: Fundamentos de toxicologia. São Paulo: Atheneu, 1996. parte 5, p. 405-440.

5 - SAPERS, G. M.; MILLER, R. L. Browning inhibition in fresh-cut pears. J. Food Sci., v. 63, n. 2, p. 342-346,1998.

6 - SAYAVEDRA-SOTO, L. A.; MONTGOMERY, M. W. Response contour diagrams to describe effects of moisture, storage, temperature, and sulfur dioxide on color of dried apples. J. Food Sci., v. 53, n. 2, p. 643-644, 1988.

7 - WONG, D. W. S. Química de los alimentos: mecanismos e teoria. Zaragoza: Acríbia, 1995. p. 233-236, 365, 372.

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