Apostila de Bioquímica

Apostila de Bioquímica

(Parte 1 de 7)

FACULDADE ESTÁCIO DE SÁ DE CAMPO GRANDE-MS

BIOQUÍMICA – PRÁTICA

PROFESSOR Dr. JOAQUIM CORSINO

APOIO TÉCNICO –Rafael e Euler

Campo Grande – MS 2008

INTRODUÇÃO

A – Objetivos Gerais das Aulas Práticas de Bioquímica

As aulas práticas de Bioquímica tem como objetivo criar condições para que os estudantes sejam capazes, ao final do curso, de:

  1. Manipular os equipamentos freqüentemente utilizados em laboratório de bioquímica.

  2. Conhecer por meio de reações efetuadas no laboratório, as propriedades químicas das substâncias que compõem os organismos vivos.

  3. Interpretar resultados experimentais.

B – Normas do Laboratório de Bioquímica

  1. Espectrofotômetro, centrifuga, banho-maria ou quaisquer outros aparelhos, somente deverão ser manuseados pelos alunos após instruções, a fim de se evitar danos irreparáveis.

  2. Em dias e hora pré-determinados, os alunos terão à sua disposição professores e técnicos encarregados de orienta-los na execução e interpretação dos referidos trabalhos.

  3. Após o uso de um bico de gás, ou de água, não deixa-los aberto, tomando o cuidado de fechar as torneiras completamente.

  4. Não lançar nas pias quaisquer materiais, com exceção de água, para evitar a corrosão dos encanamentos.

C – Prevenção de Acidentes

  1. Trabalhar sempre protegido por avental.

  2. Não fumar dentro do laboratório.

  3. Ao acender o bico de gás, ter o cuidado de não abrir a torneira de gás, antes que tenha a mão o palito de fósforo acesso.

  4. Não operar com substâncias inflamáveis (álcool, éter) nas proximidades de uma chama. Usar banho de água ou areia.

  5. Os reagentes tóxicos ou corrosivos, álcali ou ácidos fortes (quando concentrados), não deverão ser pipetados com a boca.

TRABALHO PRÁTICO

IDENTIFICAÇÃO DE AMINOÁCIDOS

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

No final desse trabalho prático, o estudante deverá saber:

1. Executar testes qualitativos em tubos de ensaio para reconhecimento de aminoácidos.

2. O significado de seguintes reações particulares.

  • Reação xantoprotéica

  • Reação de Sakaguchi

  • Reação de aminoácidos que contém enxofre.

1. Reações Gerais dos Aminoácidos

a.Formação de sais com ácidos e bases devido à natureza de íon dipolar dos aminoácidos

O conhecimento das propriedades ácido-básicas dos aminoácidos, é extremamente importante para o entendimento de muitas propriedades das proteínas. Além disso, separar, identificar e quantificar os diferentes aminoácidos, que são passos necessários para a determinação da composição e seqüência aminoácidos das proteínas, é baseada no comportamento característicos de cada um destes monômeros.

Os aminoácidos são cristalizados a partir de soluções aquosas neutras em sua forma totalmente ionizada como íons dipolares ou zwitterions. Embora tais íons dipolares sejam eletricamente neutros e não se movam em um campo elétrico, eles possuem cargas opostas nos seus dois pólos. Quando um aminoácido neutro é dissolvido em água, ele pode se comportar como um ácido (doador de prótons) ou como uma base (aceptor de prótons).

OH- OH-

R-CH(+NH3)-COOH R-CH(+NH3) COO- R-CH(NH2)-COO-

H+ H+

[ A-]

Sabendo-se que: pH = pK1 + log -------- onde HA é um ácido qualquer

[ HA]

Podemos, por uma curva de titulação, calcular os diferentes pK, s de um determinado aminoácido bem como o seu ponto isoelétrico, a partir da relação:

PK, 1 + pK,2

pI = ----------------------

2

Dessa maneira, podemos, a partir dos valores de pK e pI identificar qualquer dos 20 aminoácidos protéicos.

Procedimento experimental

  • Suspender uma pitada de tirosina em 1 mL de água

  • Acrescentar uma gota de indicador de cor (vermelho cresol), observar que a tirosina não se dissolve.

  • Adicionar, gota a gota, NaOH 2N e acompanhar a dissolução da tirosina precipitada.

  • Adicionar, gota a gota, HCl 10% e notar a formação de precipitado. Prosseguir a adição de HCl até dissolução da tirosina.

  • Escrever as reações envolvidas nos diversos passos da experiência, usando a estrutura da tirosina e explicar cada etapa do processo.

TIROSINA

OBSERVAÇÃO: O vermelho de cresol apresenta os seguintes pontos de viragem:

pH 0,0 – 2,5 – rosa; pH 2,5 – 6,5 – amarelo; pH acima de 7,0 - roxo

pK, s da tirosina: pK1 = 2,20; pK2 = 9,11; pK3 = 10,07

Responda:

  • Qual é o pI da tirosina?

  • Se em lugar da tirosina tivesse sido empregada a glicina, os mesmos resultados seriam observados? Por que?

b. Reação com Ninhidrina

A ninhidrina (hidrato de triceto-hidrindeno) é um composto heterocíclico que forma um derivado corado, após reagir com aminas, com os amingrupos dos aminoácidos livres ou de terminações de proteínas e peptídeos. A ninhidrina oxida o aminoácido, produzindo CO2 , NH3 , e um derivado aldeídico com um átomo de carbono a menos e, conseqüentemente, reduzindo. Posteriormente, a ninhidrina oxidada e reduzida reage com a amônia liberada formando um complexo violeta ou púrpura. Exceto o derivado da prolina, que é amarelo.

As reações podem ser equacionadas da seguinte maneira:

Ninidrina oxidada

Ninidrina reduzida

Complexo colorido

Como a intensidade da coloração do complexo formado é proporcional à concentração de aminoácidos ou peptídeos pequenos, esta reação é freqüentemente utilizada para determinação quantitativa de aminoácidos em solução.

Procedimento experimental

Tubo

Amostra/Concentração

Volume - mL

Ninhidrina 0,1% - (gotas)

1

Água

1,0

5

2

Glicina 0,5 mM

1,0

5

3

Prolina 0,5 mM

1,0

5

4

Leucina 0,5 mM

1,0

5

5

Aspartame 0,19%*

1,0

5

6

Solução protéica

1,0

5

* Aspartame (L-aspartil-fenilalanina metil éste ), adoçante 200 vezes mais potente do que o açúcar. Dissolver o conteúdo de um envelope em 20 mL de água destilada.

Após a adição da ninhidrina, aquecê-los em banho-maria a 100º C por 3 minutos. Compare os resultados com o branco (tubo 1). Anote os resultados e explique-os.

2. Reações específicas de identificação de aminoácidos

a. Aminoácidos com grupos guanidina: Reação de Sakaguchi

Os aminoácidos com grupo guanidina [ ] desenvolvem em meio alcalino

Um complexo verde com o a – naftol ( ) que, em presença de

hipoclorito de sódio (NaClO) passa a avermelhado. Identifique o (s) aminoácidos (s) contendo o grupo guanidina.

Procedimento experimental

Tubos

Amostra/Concentração

Volume mL

NaOH 2,5 N gotas

α – Naftol gotas

NaClO - 0,5% mL

1

Água

1,0

3

3

1

2

Arginina 0,5 mM

1,0

3

3

1

3

Glicina 0,5 mM

1,0

3

3

1

4

Triptofano 0,5 mM

1,0

3

3

1

5

Solução Protéica

1,0

3

3

1

Misturar e observar a cor, que desaparece após alguns minutos, usando o tubo 1 como controle. Anote os resultados e explique-os.

b. Reação xantoprotéica

Específica para aminoácidos que apresentam anel aromático. O precipitado branco que se forma é devido à ação do HNO3 (ácido mineral forte), e o desenvolvimento da cor amarela ocorre por formação de nitrocompostos (anel aromático + NO2 ). Relacione os aminoácidos aromáticos e suas respectivas estruturas.

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