Relatório Extração e purificação de DNA e Eletroforese

Relatório Extração e purificação de DNA e Eletroforese

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PIAUÍ – UFPI

BACHARELADO EM BIOMEDICINA

RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA

EXTRAÇÃO DE DNA E ELETROFORESE

LUCAS BRITO; RAYARA MARQUES; SANSARA SANNY; TEREZA CRISTINA E THIAGO LOPES.

PARNAÍBA

2010

LUCAS BRITO; RAYARA MARQUES; SANSARA SANNY; TEREZA CRISTINA E THIAGO LOPES.

RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA

EXTRAÇÃO DE DNA E ELETROFORESE

Relatório apresentado ao curso de Bacharelado em Biomedicina da Universidade Federal do Piauí - UFPI, para a obtenção de nota, sob orientação do Professor Jefferson Oliveira.

PARNAÍBA

2010

ÍNDICE

1. INTRODUÇÃO 4

2. OBJETIVOS 6

3. MATERIAIS 7

4. PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS 8

5. CONCLUSÃO 10

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 11

  1. INTRODUÇÃO

É fato que as aplicações das técnicas de DNA recombinante em laboratórios de análises clínicas estão se tornando altamente evidentes, especialmente para a análise do diagnóstico das várias doenças genéticas, realização de testes de paternidade e outras mais. Este campo de estudo está rapidamente se expandindo e novas análises estão sendo desenvolvidas.

Existem várias técnicas para extração do DNA, que utilizam diferentes metodologias e espécimes biológicos. O sangue é muito utilizado para extração de DNA porque é fonte abundante de informação genética e por fornecer amostra fresca para análise (a maioria dos testes de DNA para o diagnóstico envolve a extração de DNA dos leucócitos humanos). No entanto, muitos outros materiais podem ser efetivamente analisados: células epiteliais da mucosa oral; unhas, pêlos e fios de cabelo (região do bulbo capilar); manchas de material biológico (líquido seminal, urina, saliva) em vidro, faca, têxtil; ossos carbonizados, ossadas ou dentes; material anatomopatológico; e inclusive células deixadas por impressão digital em selos, filtros de cigarro, copos, talheres e telefone.

A extração do DNA a partir de sangue periférico consiste de uma série de etapas, que se baseiam na eliminação do material não passível de ser analisado, até a obtenção do ácido nucléico em questão. Portanto, parte-se do princípio de que devem ser lisados os eritrócitos (anucleados), os leucócitos, o RNA e as proteínas, para obtenção do DNA.

O passo seguinte, depois de extraído o DNA é a análise. Esta pode ser feita através de eletroforese em gel de poliacrilamida posteriormente corado pela prata ou em gel de agarose, corado por brometo de etídio. Em qualquer uma delas, o material amplificado é visualizado como uma banda, a ser analisada de acordo com o seu peso molecular.

A eletroforese consiste na separação de moléculas ionizadas, de acordo com suas cargas elétricas e pesos moleculares em campo elétrico. Moléculas orgânicas como RNA, DNA e proteínas são separadas pela migração destas em um gel durante a aplicação de um potencial elétrico. O princípio da eletroforese utilizada para separação de DNA, por exemplo, baseia-se na carga total negativa do DNA (conferida pelos grupamentos fosfatos). Sendo assim, as moléculas de DNA tendem a migrar em direção ao pólo positivo (cátodo).

Uma molécula de DNA, quando exposta a um campo elétrico, migra para o eletrodo na velocidade ou mobilidade eletroforética, proporcional a força do campo e a carga líquida da molécula. A mobilidade eletroforética é também inversamente proporcional ao coeficiente friccional da molécula, que, por sua vez, é em função do tamanho e forma da molécula, e da viscosidade do meio.

Nessa técnica é utilizada uma cuba com dois compartimentos, eletrodos e solução salina para condução de eletricidade. Entre os compartimentos da cuba é encaixado o gel que deve ficar submerso. Pequenos poços são feitos no gel durante sua preparação com pentes. As amostras são pipetadas nesses poços. Essas amostras devem ser previamente misturadas a um corante, chamado gel loading buffer (GelRed). Esse corante é uma solução composta de azul de bromofenol (e/ou xileno cianol) e glicerol e é utilizado para aumentar a densidade das amostras, impedindo que elas saiam dos poços, além de dar a coloração que serve como indicador do progresso eletroforético. Para a migração, aplica-se voltagem e corrente elétrica ao sistema.

A distância que o fragmento percorreu a partir do ponto de aplicação, é comparada com a distância que outros fragmentos de tamanhos conhecidos percorreram no mesmo gel. Esses fragmentos são os ladders (marcadores de peso molecular), misturas de segmentos de DNA de tamanhos variáveis e eqüidistantes entre si, e que são aplicados em um poço no gel no início do processo.

A eletroforese pode ser conduzida em solução com gradiente de densidade ou em diferentes meios-suportes, tais como papel de filtro, sílica gel, membranas de acetato de celulose, gel de agarose, amido ou poliacrilamida, entre outros. O suporte deve ser química e fisicamente inerte, de modo a não interferir na mobilidade das moléculas. No caso de eletroforese em géis, como poliacrilamida e agarose, a migração das moléculas é profundamente influenciada pelas malhas porosas. Em relação a géis de poliacrilamida ou agarose, a porosidade do gel determina o poder de resolução das bandas, sendo este geralmente decorrente do grau de polimerização entre os monômeros. Géis de poliacrilamida são freqüentemente usados para análises de alta resolução (seqüenciamento de DNA/RNA) em análises protéicas e isoenzimáticas que requeiram maior definição das bandas. Géis de agarose também são amplamente usados na separação de DNA/RNA, especialmente para fragmentos maiores.

A eletroforese em gel de agarose é o método padrão usado para separar, identificar, analisar, caracterizar e purificar fragmentos de DNA. A técnica é capaz de separar misturas de fragmentos de DNA que não podem ser separados por outros meios, tais como centrifugação com densidade de gradiente ou por velocidade de sedimentação. A localização do DNA no gel pode ser determinada diretamente.

Os géis de agarose são, geralmente, corados com soluções de brometo de etídio (EtBr), uma substância intercalante que revela os ácidos nucléicos ao emitir fluorescência sob luz ultravioleta. Concentrações de até 1ng de DNA podem ser visualizadas por exame direto do gel na luz ultravioleta.

  1. OBJETIVOS

    1. . Geral

  • Isolar amostras de DNA a partir de células sanguíneas para a análise dos fragmentos por meio da técnica de eletroforese em gel de agarose.

2.2. Específicos

  • Realizar a técnica de extração e purificação de DNA; e eletroforese em gel de agarose;

  • Conhecer os materiais necessários para a realização destas técnicas;

  • Obter conhecimento sobre a realização da técnica de extração e purificação de DNA; e eletroforese em gel de agarose.

  1. MATERIAIS

    1. . Extração de DNA:

  • Amostra: sangue (300µl);

  • Microtúbulos Eppendorf estéreis de 1,5 ml (para amostras de sangue 300µl);

  • Isopropanol, à temperatura ambiente (25 ºC);

  • Etanol 70%, em temperatura ambiente (25 ºC);

  • Banho Maria, 37 ° C;

  • Banho de água, 65 ° C (opcional, para realizar a re-hidratação rápida do DNA);

  • Pipeta automática;

  • KIT Wizard® Genomic DNA Purification (PROMEGA).

    1. . Eletroforese:

  • Amostra de DNA;

  • Cuba de eletroforese;

  • Fonte de eletroforese;

  • Gel de agarose;

  • Marcador de alto peso molecular;

  • Tampão de carregamento (GelRed);

  • Pipeta automática;

  • Suporte com filme de PVC;

  • Transluminador.

  1. PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS

    1. . Extração do DNA:

Foi coletado um volume de amostra de sangue (300 µl), este foi coletado em EDTA (anticoagulante) para prevenir a coagulação. O tubo de sangue foi agitado suavemente para que o mesmo ficasse bem homogeneizado e, depois o sangue foi transferido para o tubo de microcentrífuga (Eppendorf) de 1,5 ml contendo 900μl de Cell Lysis Solution. O tubo foi invertido algumas vezes para que a solução ficasse homogênea. A solução foi incubada por 10 minutos em temperatura ambiente (invertendo pelo menos três vezes durante o período de incubação) para lisar os eritrócitos. Àquela foi centrifugada a 13.000-16.000 × g por 20 segundos à temperatura ambiente de 25ºC. O sobrenadante foi removido e descartado o máximo possível sem agitar o sedimento visível branco. Alguns microlitros de líquido sobrenadante permaneceram sobre o precipitado.

O tubo foi colocado sobre o agitador Vortex por alguns segundos para que as células brancas do sangue fossem re-suspensas (alguns segundos). Foi adicionado 300µl de Nuclei Lysis Solution no tubo que continha as células re-suspensas. Pipetou-se de quatro a cinco vezes a solução para lisar as células brancas do sangue. A solução então ficou bem visguenta e foi incubada a 37° C até que os aglomerados fossem interrompidos. Foram adicionados 1,5µl de RNase solution para o lisado nuclear e novamente a solução foi incubada a 37°C. Adicionou-se 100µl de Protein Precipitation Solution ao lisado nuclear, e homogeneizou vigorosamente no agitador Vortex durante 10 a 20 segundos. Pequenos pedaços de proteína puderam ser visíveis após a homogeneização.

Centrifugou-se a mistura a 13, 000 a 16, 000 × g por 3 minutos em temperatura ambiente. Um pedaço de proteína marrom escuro pode então ser visto. O sobrenadante foi transferido para um tubo de microcentrífuga (Eppendorf) de 1,5 ml contendo 300ul de isopropanol à temperatura ambiente. A solução foi homogeneizada até que os fios brancos de DNA formaram uma massa visível. Esta foi centrifugada a 13, 000-16, 000 × g durante 1 minuto à temperatura ambiente. O DNA tornou-se visível como uma pequena massa redonda branca no fundo do microtúbulo.

O sobrenadante foi descartado e foi adicionado etanol a 70% a 25º C sobre o DNA. O tubo foi invertido devagar, várias vezes para lavar o precipitado de DNA e os lados do tubo de microcentrífuga e depois centrifugou-se. O etanol foi retirado usando uma pipeta. Como o precipitado de DNA fica muito solto neste momento, deve-se ter cuidado para não retirar o precipitado. Posteriormente o tubo foi invertido em papel absorvente e esperamos secar o precipitado por volta de 10 a 15 minutos. Adicionou-se 100µl de DNA Rehydration Solution no tubo com a solução para hidratar o DNA através da incubação a 65 ° C durante 1 hora.  Periodicamente, a solução foi misturada batendo no tubo. Alternativamente, pode se hidratar o DNA através da incubação da solução durante a noite em temperatura ambiente ou a 4 °C. Por fim, DNA foi guardado a uma temperatura de 2 a 8 ° C.

    1. . ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE

Foram colocadas separadamente gotas de 3 L do tampão de carregamento (GelRed – verde) em um pedaço de filme de PVC (suporte). Coletou-se 5 Lde solução de DNA e misturou com cada gota do tampão de carregamento, ficando azul, homogeneizando com cuidado para não fazer bolhas. A amostra então foi aplicada imediatamente nos poços do gel. Este procedimento foi repetido sucessivamente, com uma ponteira limpa, para cada amostra de DNA que foi colocada no poço do gel de agarose.

Após a aplicação de todas as amostras a tampa da cuba de eletroforese foi fechada e conectou-se os condutores elétricos à fonte. A fonte de eletroforese foi ligada e ajustada para 150 V.

A separação das bandas de DNA ocorreu dentro de 30 minutos. A corrida foi parada com desligamento da fonte. Os condutores foram desconectados, a cuba foi aberta e o gel foi levado ao transluminador. Foi observado então os fragmentos de DNA no gel (Figura 1.0).

Figura 1.0. Foto de um gel de agarose visualizado em um transluminador, aparelho que emite raios UV.

  1. CONCLUSÃO

A realização da prática de extração e purificação de DNA; e eletroforese em gel de agarose foi muito importante para a obtenção de novos conhecimentos. Foi possível identificar todo o material necessário para a realização das técnicas e todos os objetivos propostos foram alcançados com êxito.

  1. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ELETROFORESE – Apostila. Disponível em: <http://web.cena.usp.br/apostilas/Figueira/2008/Apostila%2006%20Eletroforese.doc>. Acesso em 19 de setembro de 2010.

ELETROFORESE – Genética molecular. Disponível em: <http://genetica.ufcspa.edu.br/biomedic/conteudo/genetica_molecular/eletroforese.pdf>.Acesso em 19 de setembro de 2010.

APOSTILA DE NOÇÕES DE BIOLOGIA MOLECULAR - Disponível em:

< http://www.ebah.com.br/apostila-de-biologia-molecular-doc-a54250.html>. Acesso em 19 de setembro de 2010.

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