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Guias e Dicas
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Revista - biotecnologia ed 31, Notas de estudo de Química

REVISTA BIOTECNOLOGIA - ED 31

Tipologia: Notas de estudo

2010

Compartilhado em 04/12/2010

Jambu98
Jambu98 🇧🇷

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Baixe Revista - biotecnologia ed 31 e outras Notas de estudo em PDF para Química, somente na Docsity! Sementes sintéticas - Entrevista Biodiesel Cultivares e genes Receptores de Bacillus thuringiensis em insetos Aprendendo com as agrobactérias As ômicas: integrando a bioinformação Criptosporidiose em camundongos Micotoxinas em alimentos Produção de fator FVIII por engenharia genética Açúcares funcionais Malária em camundongos imunodeficientes Biotecnologia aplicada ao valor nutricional dos alimentos ano VII • número 32 • janeiro/junho de 2004 2 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 EM MAIO DE 1997 PLANTAMOS A PRIMEIRA SEMENTE DE BIOTECNOLOGIA NA IMPRENSA BRASILEIRA Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 5 BC&D- O que são exatamente as sementes sintéticas, ou encapsu- ladas? Barrueto – O desenvolvimento de sementes sintéticas é uma modalida- de da cultura de tecidos de plantas, que consiste em encapsular embriões somáticos, ápices caulinares ou ge- mas axilares. O encapsulamento se faz com uma matriz de alginato de cálcio na qual os explantes ficam completa- mente envolvidos e protegidos, pare- cendo exatamente uma semente. Tudo isto é claro, realizado sob condições estritamente assépticas. O material encapsulado permanece por 30 dias em geladeira a 15ºC. Depois, é retira- do e colocado em estantes na sala de cultura para germinação a 27ºC. Após essa fase, vai para o tubo de ensaio, onde continuará se desenvolvendo in vitro até o campo. Os testes de germinação feitos com o material após esse período de 30 dias têm sido muito satisfatórios e já comprovaram que o alginato de cálcio não é tóxico às plantas. Mas ainda não é o tempo ideal de armazenamento. Vamos iniciar os testes com 60 dias e depois passare- mos para 90 dias, que é o tempo ideal. BC&D – E quais são as principais vantagens dessa nova técnica? Barrueto - Hoje em dia, a redução de custos é uma das nossas maiores pre- ocupações. E é aí que se encontra um dos pontos principais de benefício dessa técnica. O encapsulamento, ou as sementes sintéticas, nos permitirão usar menos espaço em laboratório e racionalizar melhor a produção de mudas, reduzindo os custos do proces- so de cultivo in vitro. No caso de troca de germoplasma livre de patógenos com outros países, as sementes sinté- ticas possibilitam a redução nos custos de transporte aéreo, já que podem ser enviadas em grandes quantidades (mi- lhares) em pequenas embalagens. Além disso, a técnica beneficia tam- bém a conservação das espécies ve- getais, pois o material fica armazenado sem germinar e sem precisar ser repi- cado. Para algumas culturas agrícolas, que não se propagam por sementes ou que tenham problemas de armazenamento, essa técnica pode ser bastante vantajosa. BC&D – Com que culturas agríco- las vocês estão trabalhando? E por quê? Barrueto – Nós começamos a traba- mostrado que gemas axilares de man- dioca são perfeitamente encapsuláveis e o que é melhor, os testes de germi- nação com essas “sementes”, em con- dições de laboratório, têm demonstra- do excelentes resultados mesmo de- pois de 30 dias a 15º C, o que é muito positivo, considerando o caráter tropi- cal da planta. Já iniciamos também o processo de desenvolvimento de se- mentes sintéticas de café, através do encapsulamento de embriões somáticos, e de feijão, a partir de embriões zigóticos – oriundos de re- produção sexual – e os resultados também têm sido muito favoráveis. Figura 01: Aspecto de micro-estaca de mandioca contendo uma gema axilar após ser encapsulada numa matriz de alginato de cálcio- “semente sintética” Figura 02: A semente sintética da Fig. 1 brotando após cinco dias a 27ºC, depois de um período de 30 dias a 15ºC. “as sementes sintéticas podem ser enviadas em grandes quantidades(milhares) e em pequenas embalagens” lhar com mandioca, o que é uma experiência absolutamente inovadora no Brasil e no mundo. A técnica de encapsulamento é muito eficiente para a conservação e propagação dessa cultura porque as variedades comerci- ais não se propagam por sementes e sim pela forma vegetativa, ou repro- dução assexuada. No caso da mandi- oca, são usadas gemas (brotos), mas em outras culturas, podem ser usados embriões somáticos – aqueles que repetem as características iguais aos pais e, por isso, dão origem a clones – ou ápices caulinares. Até agora os nossos resultados experimentais têm Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 5 6 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 Para o café, essa metodologia é espe- cialmente importante porque as se- mentes não podem ser armazenadas por muito tempo pois perdem rapida- mente o poder germinativo. BC&D- Como surgiu a idéia de desenvolver sementes sintéticas? Barrueto - Bem, na literatura referen- te à cultura de tecidos, existem relatos de sementes sintéticas em banana, morango, etc. Diante da relevância e das possibilidades favoráveis de utili- zação dessa técnica, a nossa equipe na Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia resolveu tentar desenvolvê-la com mandioca. Mas, além disso, outro fato me chamou a atenção para o desenvolvimento des- sa nova modalidade de cultura de tecidos. Quando estive na Califórnia em 2003, por ocasião do meu pós- doutorado, soube que uma grande empresa de biotecnologia estava inte- ressada em comercializar mudas de mandioca através de embriogênese somática, porém estava se defrontan- do com sérios problemas de vitrificação, um distúrbio funcional de plantas in vitro, que causa anomalias em sua estrutura. Além de ameaçar a sobrevi- vência da planta, esse fenômeno pre- judica e, às vezes, até anula o seu valor comercial. Pois bem, a vitrificação não ocorre no caso de sementes sintéticas via gemas axilares e, por isso, percebi que poderia ser uma ótima opção para o mercado de comercialização de mu- das de mandioca. Trouxe a idéia para a Embrapa e começamos a trabalhar. Até agora, os resultados têm sido mui- to positivos. BC&D – Como é uma técnica nova, vocês têm enfrentado problemas técnicos para o desenvolvimento dessa tecnologia? Barrueto – Não. Até o momento não nos defrontamos com problemas téc- nicos. Mas, como em toda pesquisa, há sempre novos parâmetros a serem testados como, por exemplo, testes de armazenamento mais longos, ou- tras temperaturas e cultivares, etc. BC&D – Essa é uma pesquisa bási- ca ou aplicada? Barrueto - Essa é uma pesquisa de caráter aplicado porque não busca expandir o leque de conhecimento por puro diletantismo, como nos tempos de Newton ou Mendel. Estamos em busca de soluções. Nessa, como em outras pesquisas desenvolvidas pela Embrapa, a produção de conhecimento tem que estar amarrada a uma solução tecnológica, dentro de um prazo. Não podemos esquecer que a Embrapa é uma instituição publica que tem como preocupação aumentar a eficiência Figura 04: Aspecto de semente sintética de café: embrião somático encapsulado num estágio bastante imaturo Figura 03: O broto da Fig. 2 crescendo e enraizando em tubo de ensaio contendo meio SP e dando origem a uma nova muda de mandioca com 20 dias de idade “o material fica armazenado sem germinar e sem precisar ser repicado. Para algumas culturas agrícolas, essa técnica pode ser bastante vantajosa.” 6 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 7 Figura 05: Germinação de embrião da Fig. 4 em meio básico SP, após 25 dias a 27ºC e depois de 30 dias a 15ºC Figura 06: Aspecto de embrião zigótico de feijão logo após ter sido encapsulado produtiva do setor agropecuário e reduzir a dependência externa de tecnologias, dentre outras atribuições. BC&D – A pesquisa de sementes sintéticas é desenvolvida isolada ou faz parte de outras atividades relacionadas à cultura da mandi- oca? Barrueto – O desenvolvimento de sementes sintéticas de mandioca está inserido dentro de um projeto maior de pesquisa de mandioca desenvolvi- do pela equipe de pesquisadores da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, liderada pelo Dr. Luiz Joaquim Castelo Branco, que tem como objetivo enriquecer a raiz da planta como alimento básico das populações de baixa renda. A raiz da mandioca é constituída basicamente de amido e o que o projeto pretende é torná-la mais nutritiva, através da incorporação de proteínas e carotenóides(vitamina. A). Essa é apenas uma das pesquisas de- senvolvidas pela Embrapa hoje para atender e melhorar a qualidade de vida das populações mais carentes. Dessa forma, a Embrapa transforma o dinheiro público em conhecimento competitivo. BC&D – De que forma essa pesqui- sa pode beneficiar o mercado no Brasil? Barrueto - Com o fim da guerra fria, surge uma nova economia, sensivel- mente dependente do conhecimento científico renovado. Hoje, os setores empresariais do agronegócio não só no Brasil como no mundo estão bas- tante conscientes acerca dessa nova realidade e prontos para encarar em melhores condições a lógica do custo/ beneficio e da competição. Prova dis- so é que atualmente há muito interes- se dos empresários em conhecer os novos caminhos que a ciência lhes proporciona. Esse mês de setembro, por exemplo, tenho marcada na mi- nha agenda uma reunião com dois empresários do agronegócio, que vêm em busca de novos subsídios tecnológicos dentro da área da cultura de tecidos. Pois então, é a ciência criando novas expectativas para a so- ciedade. A mandioca é uma cultura “Estamos em busca de soluções. A produção de conhecimento tem que estar amarrada a uma solução tecnológica, dentro de um prazo.” agrícola com muito potencial para des- pertar o interesse do empresariado brasileiro, já que além de ser um ali- mento nutritivo e saboroso, é também uma verdadeira fábrica de produção de amido com inúmeras possibilida- des de derivações industriais. BC&D - Com tanta apologia feita hoje aos produtos naturais e orgâ- nicos, você teme que possa haver alguma reação negativa da socie- dade a essa pesquisa, por se tratar de “sementes sintéticas”? Barrueto – Essa é uma questão im- portante e é fundamental que fique claro que, apesar do nome, esse é um processo natural, que tem como único objetivo facilitar a conservação e a propagação das espécies vegetais, especialmente daquelas de importân- cia alimentar para a população brasi- leira. Não há nada nesse trabalho que possa comprometer a ética. Mas é sempre bom salientar que o conheci- mento cientifico é neutro. Eu reco- nheço e endosso a preocupação da sociedade civil em impor limites éti- cos às descobertas científicas. Por isso mesmo é que acho importante que se utilize dos mecanismos de controle que tem à disposição, como a impren- sa, as ONG’s, o poder judicial, etc. O problema é que muitas vezes as dis- cussões científicas tendem para o lado emocional, o que só resulta em sensa- cionalismo e mais confusão para o público em geral. Nas discussões entre ciência e sociedade, é premente que ambos os lados tenham o mesmo espaço na mídia, para que o debate possa ser saudável e equilibrado. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 7 10 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 Açúcares funcionais GalactooligossacarídeosPesquisa Fotos cedidas pelas autoras Mareci Mendes de Almeida Prof. Dr. Depto de Engenharia de Alimentos, Universidade Estadual de Ponta Grossa, UEPG mareci@uepg.br Gláucia Maria Pastore Prof. Titular, Depto de Ciência de Alimentos Universidade Estadual de Campinas -UNICAMP glaupast@fea.unicamp.br Produção de galactooligossacarídeos por β-galactosidase utilizando metodologia de superfície de resposta 1. Introdução s oligossacarídeos são açúcares encontrados naturalmente em muitos alimentos como frutas, vegetais, leite e mel. Alguns destes não apresentam só a função nutricional ou de adoçante, mas também exibem atividade fisiológica, sendo assim denominados de alimentos funcionais (Nakano, 1998). Eles melhoram a qualidade dos alimentos, promovendo uma modificação no “flavor”, nas características físico-químicas apresentam propriedades benéficas para a saúde do consumidor (Crittenden e Playne, 1996). Nos últimos anos o interesse e consumo de oligossacarídeos têm crescido muito, particularmente no Japão e Europa. Em 1991 o governo japonês criou o termo FOSHU (food for specified health use) para os alimentos funcionais. Em 1996 havia 58 alimentos listados, e entre estes 34 incorporavam oligossacarídeos (Crittenden e Playne, 1996), em 2003 foram mais de 300 alimentos relatados como FOSHU, sendo que 30% destes apresentavam oligossacarídeos em sua formulação (Taniguchi, 2004). Os açúcares dos alimentos são determinantes para a composição da microflora intestinal (Sako et al., 1999). Os carboidratos que participam da dieta podem ser classificados com base nas propriedades fisiológicas de digeríveis ou não-digeríveis, havendo três principais tipos de carboidratos não-digeríveis: os polissacarídeos não- amídicos, os amidos resistentes e os oligossacarídeos não-digeríveis (Voragen, 1998), estando neste grupo incluídos os galactooligossacarídeos (GOS). Os GOS apresentam configuração β e as enzimas digestivas gastrointes- tinais humanas são principalmente específicas para ligações α, sendo então resistentes à digestão e absorção no intestino atingindo o cólon, onde são fermentados, promovendo um aumento das bifidobactérias (Sako, 1999) e redução das bactérias deteri- oradoras, consequentemente ocasio- nando efeitos benéficos para a saúde humana com a redução de metabóli- tos tóxicos (Modler, 1994; Tomomat- su, 1994). A ingestão de GOS aumen- ta a mineralização óssea e a resistên- cia contra fraturas, devido à estimu- lação da absorção de cálcio (Brouns e Vermmer, 2000). Ainda são usados em confeitos, gomas de mascar, iogurtes e bebidas como açúcares de baixa cariogenicidade, pois não são me- tabolizados pela microflora bucal para formar ácidos e poliglucanas. A formação de GOS a partir da lactose é influenciada por diversos fatores como a fonte e concentração da enzima, pH, temperatura e concentração do substrato (Mahoney, 1998; Rustom et al., 1998). Quanto mais lactose houver no sistema maior será a produção de GOS (López-Leiva e Gusman, 1995; Albayrak e Yang, 2002; Roy et al., 2002). Os GOS são compostos de lactose e unidades de galactose, produzidos comercialmente por reação enzimática onde resíduos de galactose são ligados na lactose (Zaraté e López-Leiva, 1990). Para se estudar os efeitos dos fatores por análise univariável, além de necessitar de um grande número Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 11 de experimentos a avaliação só pode ser feita individualmente, onde um fa- tor é fixado num valor e varia-se o outro até descobrir o valor que produz o maior rendimento, sem se levar em conta que ocorre interação entre as variáveis (Barros Neto et al., 1995). Utilizando-se da metodologia de su- perfície de resposta pode-se obter como resultado a interação dos fator- es e uma faixa de melhor atuação. 2. Materiais e métodos A enzima β-galactosidase foi sin- tetizada pelo fungo Scopulariopsis sp isolado por Pastore e Park (1979). O microrganismo foi produzido por fer- mentação semi-sólida, cultivado em farelo de trigo e água na proporção de 1:1 (p/v). Em frasco erlenmeyer de 500 mL contendo 20g de substra- to, foi adicionada uma suspensão de esporos (108 esporos/mL) e incubado a 30ºC por 7 dias. Após o crescimento foi adicionada água destilada e o meio triturado com bastão de vidro para lib- eração da enzima, obtendo-se após fil- tração o extrato enzimático, que foi tratado com sulfato de amônio a 80%. O precipitado obtido (enzima bruta) foi dialisado contra água, centrifugado e liofilizado. A atividade da β-galactosidase (EC 3.2.1.23 β-galactosídeo galactohidro- lase) foi determinada usando o-nitro- fenil-β-D-galactopiranosídeo (ONPG) como substrato. O meio de reação constou de 1,55 mL de ONPG 0,25% em tampão acetato de sódio 0,1M a pH 5,0; 0,15 mL de solução enzimáti- ca, sendo a mistura incubada a 60ºC por 15 minutos, a reação foi paralisa- da com 0,15 mL de carbonato de só- dio a 10%. Para analisar o produto da reação foi utilizado espectrofotômetro e a absorbância medida a 420 nm, contra branco. Uma unidade de ativ- idade de β-galactosidase foi definida como a quantidade de enzima que lib- era 1µmol de o-nitrofenol por minuto em 1 mL, nas condições de ensaio. O sistema de reação para a produção de galactooligossacarídeos consistiu na mistura da enzima β-ga- lactosidase com solução de lactose a 40% (p/v), preparada em tampões com valores de pH preestabelecidos. Foi utilizado um planejamento fatorial Tabela 1 – Fatores e níveis estudados no planejamento experimental fatorial de 2 níveis Tabela 2 – Matriz dos experimentos para planejamento experimental fatorial de dois níveis e a porcentagem de área de 4’gal-lactose formados Figura 1 – Estrutura do galactooligossacarídeo 4’galactosil lactose soiasnE amiznE Hp arutarepmeT )%(esotcal-lag'4 1 1- 1- 1- 31,02 2 1+ 1- 1- 18,81 3 1- 1+ 1- 52,02 4 1+ 1+ 1- 29,02 5 1- 1- 1+ 38,81 6 1+ 1- 1+ 73,61 7 1- 1+ 1+ 03,02 8 1+ 1+ 1+ 54,91 9 86,1- 0 0 65,02 01 86,1+ 0 0 02,81 11 0 86,1- 0 58,71 21 0 86,1+ 0 00,12 31 0 0 86,1- 54,02 41 0 0 86,1+ 58,71 51 0 0 0 65,91 61 0 0 0 91,91 71 0 0 0 13,91 serotaF sievíN 86,1- 1- 0 1+ 86,1+ amiznE )Lm/U( 46,2 4 6 8 63,9 Hp 23,4 5 6 7 86,7 arutarepmeT )Cº( 6,13 53 04 54 4,84 12 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 completo 23, os níveis de estudo estão apresentados na tabela 1. Foram analisadas as variáveis independentes: pH, temperatura e concentração de enzima, e a variável dependente: síntese do galactoligossacarídeo 4’galactosil-lactose (Figura 1). Após 24 horas o experimento foi interrompido pela inativação da enzima em banho fervente por 10 minutos e os produtos foram analisados por cromatografia líquida de alta eficiência (cromatógrafo Waters) com coluna SupelcogelTM Ca (300x7,8mm), tendo como fase móvel a água com fluxo de 0,5 mL/min a 80ºC e detectados por índice de refração. A análise estatística dos resultados foi realizada através do soft- ware STATISTICA utilizando Experi- mental design. 3. Resultados e discussão Os resultados da análise correspondentes ao planejamento fatorial de dois níveis são apresentados na tabela 2, toda a análise foi realizada com os valores das variáveis dependentes codificados. A resposta considerada foi a porcentagem de área do galactooligossacarídeo 4’galactosil-lactose (4’gal-lactose). As variáveis pH, temperatura e concentração de enzima e suas interações foram significativas a nível de 10%. Conforme demonstrado na tabela 3, o efeito da concentração de enzima, do nível –1 para +1, foi negativo, indicando que 4U/mL (-1) de enzima apresentou melhor produção de 4’gal- lactose do que 8U/mL (+1), o que pode ser comprovado analisando as figuras 3 e 4, onde se observa a tendência de aumentar a síntese de galactooligossacarídeos com a diminuição da concentração de enzima. O efeito do pH, quando houve aumento do nível –1 para +1, foi positivo, assim na faixa estudada o valor de pH 7,0 foi melhor, para a síntese do galactooligossacarídeo, que o valor de pH 5,0, havendo uma tendência de se trabalhar com valores de pH menos ácidos (figuras 2 e 4). Quando analisada a variação da temperatura o efeito foi negativo indicando que a temperatura no nível Figura 2 – Efeito do pH e da temperatura na produção de 4’gal-lactose, utilizando 6U/mL de β-galactosidase Figura 3 – Efeito da temperatura e da concentração de β-galactosidase na produção de 4’gal-lactose em pH 6,0 Tabela 3 – Efeito da concentração da enzima, pH e temperatura na síntese de galactooligossacarídeos sotiefE oruporrE )2(t p aidéM 473,91 650,0 704,043 900000,0 )L(amiznE)1( 099,0- 331,0 614,7- 796710,0 )L(Hp)2( 596,1 331,0 896,21 441600,0 arutarepmeT)3( )L( 092,1- 331,0 466,9- 835010,0 )2(e)1( 009,0 331,0 247,6 692120,0 )3(e)1( 566,0- 331,0 289,4- 700830,0 )3(e)2( 085,0 331,0 543,4 590940,0 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 15 As agrobactérias e a colonização genética Os mecanismos de interação plan- ta-patógeno são extremamente com- plexos e diversificados. Entre os dife- rentes tipos de parasitismo, o que utiliza a transferência de material ge- nético como estratégia de colonização é um dos mais intrigantes, tendo sido descritos nos vírus e agrobactérias. Os vírus utilizam o sistema de transcrição e tradução da célula hospedeira para produzir suas próprias proteínas, o que permite a sua multiplicação, debi- litando o hospedeiro e culminando, geralmente, em sua morte. As agrobactérias, por sua vez, transferem parte de seu material genético para o genoma da planta hospedeira, meca- nismo este denominado de Coloniza- Aprendendo com as AgrobactériasPesquisa Leila Maria Gomes Barros PhD.Biologia Molecular Pesquisadora Embrapa – Recursos Genéticos e Biotecnologia leila@cenargen.embrapa.br Antônio Américo Barbosa Viana M.Sc. em Biologia Molecular Consultor Embrapa – Recursos Genéticos e Biotecnologia aamerico@cenargen.embrapa.br Mauro Carneiro Ph.D. Biologia Molecular Pesquisador Embrapa – Recursos Genéticos e Biotecnologia mauro@cenargen.embrapa.br ção Genética (Schell et al., 1979). Os genes transferidos são replicados, trans- critos e traduzidos como se fossem da própria célula vegetal, resultando no desenvolvimento de tumores ou raízes adventícias no sítio de infecção, co- nhecidos como galha de coroa (“crown gall”) ou raízes em cabeleira (“hairy root”), respectivamente (Figura 1). As células neoplásicas sintetizam e excretam compostos derivados de aminoácidos e açúcares, denominados opinas, que servem de nutrientes ape- nas para a agrobactéria (Petit et al., 1983). Em outras palavras, a célula vegetal é “subjugada” para produzir nutrientes para a agrobactéria invasora que, desta forma, obtém carbono e nitrogênio sem competir com as de- mais bactérias do solo. Os primeiros estudos sobre agrobactéria datam do início do século XX quando Smith e Townsend (1907) isolaram uma bactéria de galha de coroa de Chrysanthemum frutescens (margarida) e demonstraram que ela também causa tumores em vários ou- tros vegetais, sendo denominada de Bacterium tumefaciens. Riker e cola- boradores (1930) demonstraram que a proliferação de raízes em cabeleira, também é causada por uma bactéria, por eles nomeada Phytomonas rhizogenes. Mais tarde, Conn (1942) agrupou as duas espécies em um novo gênero denominado Agrobacterium. Hoje, o gênero Agrobacterium encontra-se agrupado na família Rhizobiaceae, juntamente com o gê- nero Rhizobium, que são bactérias de solo, Gram-negativas, causadoras de neoplasias em plantas (Buchanan & Figura 1. Plantas de Nicotiana tabacum infectadas com (A) Agrobacterium tumefa- ciens, onde pode ser vista uma galha de coroa, e (B) A.rhizogenes, com raízes em cabeleira in vitro. Das plantas transgênicas aos mecanismos de crescimento e desenvolvimento vegetal 16 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 Gibbons, 1975). O gênero Rhizobium é composto por bactérias fixadoras de nitrogênio que estimulam nódulos nas raízes de leguminosas, diferentemen- te das neoplasias causadas por agrobactérias. As agrobactérias infectam inúme- ras dicotiledôneas e algumas monocotiledôneas (De Cleene & De Ley, 1976; Porter,1991) apresentam temperatura ótima de crescimento entre 25-30 ºC e somente se estabele- cem, em condições naturais, em locais injuriados da planta (Buchanan & Gibbons, 1975). Devido a estas carac- terísticas, as galhas de coroa e raízes em cabeleira são doenças importantes em regiões de clima temperado, es- pecialmente em viveiros de fruteiras (parreiras, amendoeiras, ameixeiras, macieiras e pessegueiros) que são propagadas vegetativamente ou por enxertia. Os ferimentos, resultantes da manipulação das plantas, favorecem a instalação da agrobactéria (Hildebrand, 1934; Kerr, 1969a). No Brasil, segundo Beriam e cola- boradores (1996), os primeiros traba- lhos sobre infecção de plantas por agrobactéria foram feitos por Costa Neto em 1937, que relata ser a galha bacteriana do pessegueiro (Prunus persica) uma doença comum no Esta- do do Rio Grande do Sul. Nos anos seguintes, as galhas de coroa foram citadas em muitas culturas tais como castanheiro (Castanea sativa), videira (Vitis vinifera), ameixeira (Prunus domestica), alface (Lactuca sativa), chuchu (Sechium edule), mandioca (Manihot esculenta), urucum (Bixa orellana), etc. (Beriam et al., 1996). Romeiro e colaboradores (1994) re- portam que nas culturas de roseiras (Rosa spp.) na região de Barbacena, Estado de Minas Gerais, as galhas agrobacterianas são responsáveis pela queda de 20 a 100% da produção de botões florais comercializáveis. O mecanismo molecular de interação Agrobacterium-Planta O fato de a agrobactéria alterar o programa de desenvolvimento das plantas hospedeiras, induzindo a for- mação de tumores ou raízes, atraiu a curiosidade dos cientistas, resultando em avanços do conhecimento nesta área. O primeiro grande passo no sentido de elucidar o mecanismo de infecção foi dado quando White & Braun (1943) demonstraram que as galhas de coroa poderiam crescer in- definidamente in vitro, na ausência da bactéria, lançando a hipótese da existência de um princípio indutor de tumor (“tumour-inducing principle - t.i.p.”). Desde então, várias outras im- portantes descobertas somaram-se no sentido de solucionar este intrigante mecanismo de infecção. Kerr (1969b) observou que a virulência de uma cepa de Agrobacterium fitopatogênica poderia ser transferida para uma cepa saprofítica (A. radiobacter). Petit e colaboradores (1970) demonstraram que a cepa que induz a síntese da opina Octopina nas células tumorais usa esse produto, seletivamente, como fonte de carbono e nitrogênio, mas não uma outra opina como a Nopalina, sugerindo que a informação genética para a síntese da opina seja transferida da agrobactéria para a planta. Mais tarde, foi demonstrado que um ele- mento não cromossomal é responsá- vel pela virulência das agrobactérias, sendo denominado de plasmídeo Ti (“Tumor inducing”) em A. tumefaciens (Van Larebeke et al., 1974) e plasmídeo Ri (“Root inducing”) em A. rhizogenes (Moore et al., 1979). Essas descobertas culminaram na elucidação do mecanismo de infec- ção: a transferência de um segmento do plasmídeo Ti ou Ri (T-DNA) da Agrobacterium para o genoma vege- tal (Chilton et al., 1977; Chilton et al., 1982; White et al., 1982). O Ti e o Ri são plasmídeos gran- des, variando de 200 a mais de 800Kb, apresentando estrutura modular, onde genes de função similar encontram-se agrupados, resultando em cinco regi- ões definidas (Zhu et al., 2000) (Figura 2): (i) T-DNA (“transfer DNA”): região do plasmídeo transferida para a planta, codifica os genes indutores de tumo- res ou raízes e genes responsáveis pela síntese das opinas (octopina, nopalina, manopina, agropina etc.). (ii) região vir: dirige o processamento e transferência do T-DNA para a célula hospedeira; (iii) região rep: responsá- vel pela replicação do plasmídeo; (iv) regiões tra e trb: dirigem o mecanis- mo de conjugação entre agrobactérias; e (v) região opc: envolvida na absor- ção e catabolismo das opinas. O mecanismo de transferência do T-DNA para a célula vegetal já está quase totalmente elucidado. A Figura 3 apresenta todos os passos para o estabelecimento da infecção. Quando um vegetal sofre uma injúria, um exudado composto de fenóis e açuca- res é secretado, servindo de proteção e início da cicatrização do ferimento. A agrobactéria, atraída por estes com- postos, chega ao local do ferimento. Os seus genes cromossomais conheci- dos como chvA, chvB, chvD, chvE, chvG, chvI, pscA, att, miaA, ros, e acvB codificam proteínas envolvidas no re- conhecimento do exudado e no con- tato entre a agrobactéria e a célula hospedeira (Matthysse et al., 1981; Douglas et al., 1982; Tzfira et al., 2000). Os compostos fenólicos pre- sentes no exudado, principalmente a acetosseringona, também ativam a re- gião de virulência “vir” através da estimulação da proteína VirA, uma quinase localizada na membrana da agrobactéria que fosforila outra prote- ína bacteriana, a VirG que, por sua vez, estimula a transcrição das proteínas de todos os seis operons Vir (A, B, C, D, E e G) (Stachel et al., 1986b; Winans et al., 1989; Joubert et al., 2002). Sugere- se, ainda, que a transferência do T- DNA para a célula vegetal ocorra por Figura 2. Plasmídeo Ti ou Ri de Agrobacte- rium tumefaciens ou A. rhizogenes, respecti- vamente. T-DNA: região transferida, que pode se apresentar como um único segmen- to ou em dois segmentos, T L e T R -DNA; tra e trb: regiões responsáveis pela conjugação bacteriana; OPC: região responsável pelo catabolismo de opinas, e vir: codifica proteí- nas associadas ao processo de transferência do T-DNA para a célula hospedeira. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 17 mecanismo semelhante à conjugação bacteriana. Inicia-se com a clivagem das bordas de uma das fitas do T-DNA pelas endonucleases sítio específicas VirD1 e VirD2 (Wang et al., 1987). Subseqüentemente, uma nova fita de DNA é sintetizada, iniciando na borda direita e prosseguindo na direção da borda esquerda (Stachel et al., 1986a; Yanofsky et al., 1986). Um T-DNA de fita simples, chamado de fita T, é liberado no processo, no qual a prote- ína VirD2 permanece covalentemente ligada até seu destino final, que é o núcleo da célula vegetal (Herrera- Estrella et al., 1988). A fita T, com a proteína VirD2 e outra proteína a VirE2, são translocados da agrobactéria para a célula vegetal através de um canal semelhante ao “pilus” conjugativo es- tabelecido entre a agrobactéria e a célula vegetal por proteínas codifica- das no operon VirB (Baron & Zambryski, 1996; Christie PJ, 1997). No citoplasma da célula vegetal, várias proteínas VirE2 juntam-se à fita T formando um com- plexo T-DNA/proteínas (complexo T) que é transportado para o núcleo, com ajuda das proteínas da célula vegetal carioferina alfa e cicloferinas (Zupan et al., 1996; Gelvin, 2000). Uma vez no núcleo, o T-DNA é integrado no genoma vegetal por recombinação Figura 3. Interação molecular agrobactéria-planta. A planta que sofreu injúria produz compostos fenólicos e açúcares que são captados pela proteína VirA, que fosforila a VirG que, por sua vez, ativa os demais genes vir. A VirD2 cliva as bordas do T-DNA e o direciona para a célula hospedeira através de canais formados pela VirB. Já na célula vegetal, as proteínas VirE2 se ligam à fita-T formando o complexo T. Este complexo, então, entra no núcleo da célula vegetal com o auxílio das carioferinas e cicloferinas do próprio hospedeiro, e integra no genoma da planta. Desta forma, a planta passa a produzir fitormônios e opinas que servem de nutriente para a agrobactéria. Adaptada de Zhu et al., 2000, por Marlene T. De-Souza e Antônio Américo B.Viana. 20 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 No entanto, sabemos que os genes rol atuam de maneira sinergística e que, quando expressos em pares, provo- cam efeitos mais acentuados do que quando expressos isoladamente (Spena et al., 1987). Isto sugere uma certa redundância funcional, que pode ser interpretada como um modo de garantir o sucesso no processo de infecção. O gene rolB (ORF11) é o mais eficiente na indução das raízes e o único gene do T-DNA que, quando inativado, suprime a indução de raízes nas plantas infectadas pela A. rhizogenes, exceto em plantas de fumo (White et al., 1985). De fato, A. rhizogenes contendo apenas o gene rolB é capaz de induzir raízes tão bem quanto cepas selvagens (Spena et al., 1987; Capone et al., 1989). O gene rolB expresso em plantas promove alterações na morfologia das folhas e flores, o desenvolvimento de raízes adventícias no caule (Schumülling et al., 1988)e a indução de raízes em segmentos foliares cultivados, in vitro, na ausência de auxina. Essas observa- ções levaram a conclusão de que plan- tas transformadas com rolB apresen- tam um estado hiperauxínico (Capone et al., 1989). A proteína RolB contém 259 aminoácidos com massa molecular de 30KDa, não possuindo nenhum moti- vo típico ou similar a proteínas conhe- cidas. Primeiramente, foi sugerido que RolB provocaria um aumento da con- centração de auxina, resultado da hidrólise dos conjugados inativos do ácido indol acético (AIA), liberando auxina ativa na célula (Estruch et al., 1991b). Porém, plantas de fumo ex- pressando o gene rolB sob controle do promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV35S) (Odell et al.,1985) não apresentam níveis alte- rados de AIA ou AIA-conjugado (Nilsson et al., 1993). A segunda hipótese é que RolB aumentaria a sensibilidade da célula para o AIA, e não a sua disponibilidade, como sugerido ante- riormente. Protoplastos de plantas transgênicas de fumo expressando RolB são até 100000 vezes mais sen- síveis à auxina do que plantas controle (Maurel et al., 1991). Corroborando este resultado, foi observado que pre- parações de membrana plasmática de células transformadas com rolB são capazes de ligar mais auxina do que membranas de plantas controle, e que esta ligação é completamente abolida na presença de anticorpos anti-RolB (Filippini et al., 1994). Além disso, protoplastos 35S::rolB se dividem e formam calos na ausência de auxina (Walden et al., 1993), e calos gerados a partir de raiz de plantas 35S::RolB tornam-se necróticos em um terço da concentração de auxina necessária para induzir a mesma resposta em calos controle (Schmülling et al., 1993). Os efeitos de rolB na organogênese fo- ram estudados utilizando cultura de camada fina de células (TCL), onde foi observado que rolB não somente in- duz a formação meristemas radiculares, mas também meristemas florais (Altamura et al., 1994). Recentemen- te, Altamura (2004) propôs um mode- lo no qual rolB induziria a formação de meristemas, sendo que o tipo de meristema resultante depende do ba- lanço hormonal local. Apesar dos efei- tos da proteína RolB serem bem co- nhecidos, ainda existem controvérsias quanto ao seu modo de ação. Filippini e colaboradores (1994) demonstra- ram que a proteína RolB possui ativi- dade tirosina fosfatase, e a localizaram em membrana plasmática das células transformadas, sugerindo uma função de receptor ou transdutor de sinal da via do hormônio AIA. No entanto, Moriuchi e colaboradores (2004) loca- lizaram a proteína quimérica GFP::RolB no núcleo de células transformadas, o que favorece a função de transdutor de sinais. O gene rolC (ORF 12), cuja pro- teína possui 180 aminoácidos com massa molecular de 20 KDa, também não possui homologia com proteínas conhecidas. A proteína RolC foi imunolocalizada no citosol das células transformadas (Estruch et al., 1991a; Oono et al., 1987). As plantas transgênicas de fumo expressando RolC são menores, ramificadas, com folhas afiladas e redução do conteúdo de clorofila. A floração ocorre mais cedo com flores pequenas e redução do número de grãos de pólen (Oono et al., 1987; Schmülling et al., 1988). A função da proteína RolC ainda não foi determinada, tendo sido descrito um aumento de citocinina ZR nas regiões apicais (Nilsson et al., 1996), sugerin- do que RolC influencia positivamente a síntese de citocinina em folhas jo- vens. Foi observado, ainda, uma dimi- nuição dos níveis de giberilina (GA) em plantas expressando o gene rolC devido, provavelmente, à inibição da conversão do GA 19 para o GA 20 (Nilsson et al., 1993, 1996). No entanto, a aplicação de GA exógeno em plantas expressando a proteína RolC reflete somente no aumento do tamanho das plantas, não revertendo os outros fenótipos, tornando evidente que o decréscimo de GA é um efeito secun- dário (Schmülling et al., 1993). O gene rolD (ORF15) codifica uma proteína de 344 aminoácidos (Slightom et al., 1986). A. rhizogenes contendo no locus rol apenas o gene rolD é incapaz de induzir a formação de raízes em plantas de fumo (Mauro et al.,1996). Por outro lado, A. rhizogenes contendo mutações ape- nas no gene rolD induz o desenvolvi- mento de raízes, porém, as raízes resultantes são pequenas (White et al., 1985). A proteína RolD provoca a floração precoce em plantas de fumo e a potenciação da organogenese flo- ral em culturas de células (Mauro et al., 1996; Altamura, 2004). Em 2001, Trovato e colaboradores demonstra- ram que o produto protéico deste gene é a enzima ornitina ciclodesaminase (OCD), que conver- te ornitina em prolina. Existem evi- dências de que a prolina atue como um indutor da floração. O gene rolA (ORF10) é, entre os genes rol, o que causa maiores altera- ções morfológicas em plantas, sendo este objeto de estudo em nosso labo- ratório. A. rhizogenes contendo ape- nas o gene rolA é capaz de induzir raízes em N. tabacum, mas não em outras plantas testadas (Spena et al., 1987). Plantas de fumo transformadas com o gene rolA apresentam redução do porte, folhas enrugadas, arredonda- das e verdes escuras, atraso na floração, (Figura 5), sistema radicular pobre, reduzido número de flores e retardo na senescência (Schmülling et al., 1988; Sinkar et al., 1988; Slightom et al.,1986; Carneiro & Vilaine, 1993). Da mesma forma, foram observadas alte- rações fisiológicas tais como redução de giberilina GA 1 (Dehio et al., 1993; Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 21 Moritz & Schmülling 1998) e redução da síntese de poliaminas, através de interferência na via da ornitina (Burtin et al., 1991; Sun et al., 1991; Ben- Hayyim et al.,1996). Plantas de fumo expressando rolA, quando tratadas com giberilina, não revertem completamen- te o fenótipo (Dehio et al., 1993; Schmülling et al., 1993), o que sugere que esta redução de giberelina repre- sente um efeito secundário. Curiosa- mente, plantas transgênicas com re- duzido nível de AIA apresentam fenótipo semelhante a plantas rolA (Romano et al., 1991), sendo especu- lado que o fenótipo rolA seja o resul- tado de um aumento da relação citocinina/auxina. Em consonância com esta hipótese, nanismo, folhas enrugadas e verdes escuras são fenótipos típicos de plantas com alta produção de citocininas (Eklöf et al., 1996). A expressão do gene rolA em plantas transgências mostrou que seu promotor é ativo, essencialmente, em todos os órgãos (Schmülling et al., 1989). Carneiro & Vilaine (1993) mos- traram que o nível do RNA mensageiro é maior no caule, cinco vezes menor na folha e cinqüenta vezes menor na raiz, e que, além disso, o promotor do gene é composto por módulos que determinam a expressão tecido espe- cífica. A proteína RolA possui 100 aminoácidos com massa molecular es- timada em torno de 11,4 KDa e ponto isoelétrico de 11,2 (Slightom et al., 1986). Análises computacionais mos- traram que não existe similaridade da RolA com proteínas conhecidas. Devi- do à sua natureza extremamente bási- ca e à presença do motivo SPXX en- contrado em proteínas regulatórias, a possibilidade de interação com ácidos nucléicos foi proposta (Levesque et al.,1988; Hansen et al., 1994). Alterna- tivamente, foi sugerido uma função de receptor ou transdutor de sinal de auxinas na membrana plasmática (Maurel et al.,1991; Vansuyt et al. ,1992). Experimentos de fracionamento celular de plantas de fumo transformadas com o gene rolA::gus indicam que a proteína RolA estaria associada, preferencialmente, à fração da membrana plasmática, em- bora a atividade do gene repórter gus tenha sido detectada em outras fra- ções celulares (Vilaine et al.,1998). Sendo assim, as informações quanto à localização da proteína RolA na célula vegetal e sua provável função são contraditórias, e, apesar das alterações hormonais detectadas nas plantas rolA explicarem parcialmente os fenótipos resultantes, faz-se necessário um aprofundamento das investigações para se chegar a sua verdadeira função biológica. Estratégia adotada para estudar a função da proteína RolA em plantas A capacidade de RolA alterar vá- rios aspectos do crescimento e desen- volvimento de plantas tem atraído a atenção dos cientistas, pois decifrar a função de RolA pode levar ao enten- dimento de como os fenótipos baixo porte, enrugamento foliar, crescimen- to deficiente de raízes, retardo na floração e senescência são gerados. Estas informações podem resultar em avanços na Fisiologia Vegetal e Biolo- gia do Desenvolvimento, possibilitan- do ainda, o controle de características agronômicas desejáveis em uma de- terminada cultura. Tendo como base as hipóteses existentes na literatura, de localização da proteína RolA na membrana plasmática ou no núcleo, desenhamos algumas estratégias com o objetivo de testar essas duas hipóteses. Estudos de modelagem molecular da proteína RolA, realizados por Rigden e Carneiro (1999) culminaram com a proposição de um modelo para a pro- teína RolA, no qual esta estaria atuan- do na forma dimérica e interagindo com seqüências de DNA em dois pon- tos específicos de sua estrutura, os resíduos lisina 24 e arginina 27, via pontes de hidrogênio. Para testar este modelo, experimentos de mutação sítio-dirigida foram realizados, substi- tuindo os aminoácidos lisina 24 e arginina 27 por asparagina 24 e 27 e por glutamina 24 e 27 (Assis, 2003). Asparagina e glutamina foram escolhi- dos por apresentarem tamanhos simi- lares aos aminoáciodos lisina e arginina, mas diferentes quanto às característi- cas físico-químicas, o que poderia alte- rar a especificidade de ligação de RolA com os promotores, sem alterações consideráveis na estrutura da proteína. Os genes rolA mutados foram inseri- dos em plantas de fumo, e análises fenotípicas estão sendo realizadas em nosso laboratório. Para testar a hipótese de que Figura 5. (A) Planta de N. tabacum expressando o gene rolA sob controle do seu próprio promotor, à esquerda, e uma planta não transformada, à direita. Ambas possuem a mesma idade. (B) Detalhe da planta expressando o gene rolA. 22 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 RolA atue como regulador da expres- são de genes, DNA de Arabdopsis thaliana foi digerido com enzimas de restrição de corte freqüente, gerando, assim, um banco de fragmentos de DNA. Estes fragmentos foram então incubados com a proteína de fusão GST::RolA (Santos, 2002) e, concomitantemente, com a proteína GST isolada. A A. thaliana foi escolhi- da como modelo experimental, dado à disponibilidade da seqüência do seu genoma completo em bancos de da- dos, o que facilita os estudos posterio- res. Por análise diferencial, foi possível isolar trinta fragmentos de DNA com os quais RolA se ligou. Para verificar se esses fragmentos são promotores de genes regulados pela proteína RolA, eles foram clonados adjacentes à se- qüência codante do gene repórter uidA (gus), que codifica a enzima β- Glucuronidase (Jefferson et al., 1986), em vetores de planta, de forma a tornar possível a verificação da capaci- dade dos fragmentos de promover a expressão da Gus. Esses vetores fo- ram então transferidos por eletroporação para protoplastos de fumo, onde foi observada atividade promotora em alguns fragmentos (Barreto et al.,1998). Dois destes frag- mentos, quando expressos em plantas de fumo, foram capazes de promover a expressão de Gus nos grãos de pólen de plantas de fumo (Viana, 2003). Alternativamente, uma outra es- tratégia foi estabelecida para possibili- Figura 6. Perfil de hidrofobicidade e seqüência primária de RolA. Destacada em verde, a região hidrofóbica com 22 resíduos de aminoácidos, e em vermelho, uma região hidrofílica de 14 resíduos. As cores representam as propriedades físico-químicas dos resíduos de aminoácidos: verde – apolares, e vermelho – carregados positivamente. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 25 the hairy-root organism in relation to its pathogenesis on nursery apple trees. J. Agr. Sci., 48: 857- 885. Holsters M, Silva B, Van Vliet F, Genetello C, De Block M, Dhaese P, Depicker A, Inzé D, Engler G, Villarroel R, Van Montagu M, Schell J (1980). The functional organization of the nopaline A. tumefaciens plasmid pTiC58. Plasmid, 3: 212-230. Hong SB, Hwang I, Dessaux Y, Guyon P, Kim KS, Farrand SK (1997). A T- DNA gene required for agropine biosynthesis by transformed plants is functionally and evolutionarily related to a Ti plasmid gene required for catabolism of agropine by Agrobacterium strains. J. Bacteriol., 179: 4831-4840. Hooykaas PJJ, den Dulk-Ras H, Schilperoort RA (1988). The Agrobacterium tumefaciens T- DNA gene 6b is an onc gene. Plant Mol. Biol., 11: 791-794. 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Informações sobre interação antígeno-anticorpo são disponíveis no IMGT – International Immunogenetics Database (imgt.cines.fr) (Lefranc, 2004). Cada vez mais se torna evidente que a aplicação de dados de seqüên- cias de DNA, utilizando informações sobre a relação entre a seqüência de DNA do gene e a função protéica, não sustenta a atribuição infalível de função para as proteínas. Muitas evidências mostram a fragilidade das con- statações feitas puramente a partir de seqüências genômicas, sugerindo que (i) embora a seqüência genômica pos- sa ser usada para predizer “open read- ing frames” (ORFs), tais predições são ainda muito grosseiras e passíveis de erro, principalmente em eucariotos. (ii) O processamento do mRNA tem uma influência importante no produ- to final da expressão gênica; o pro- teoma. É o caso do splicing alternati- vo, em que, pela montagem de difer- entes combinações de exons, um pré- mRNA dá origem a dois ou mais mR- NAs diferentes, que codificam para produtos protéicos diferentes. Como resultado, as modificações advindas do processamento do mRNA permitem que seja produzida uma variedade de proteínas superior ao número de genes do genoma. (iii) Existe uma enorme diversidade de modificações pós-tra- ducionais que uma proteína pode so- frer, influenciando a sua função, loca- lização celular e atividade. A infor- mação da seqüência de DNA ainda não dá um discernimento claro sobre mod- ificações pós-traducionais a que cada produto protéico está sujeito, sendo difícil, se não impossível, estabelecer um número de proteínas produtos que cada gene codifica. (iv) Os mecan- ismos de controle da expressão gêni- ca envolvem uma rede complexa e variável de interações moleculares, cujo entendimento é ainda bastante rudimentar. Esses mecanismos não são prontamente evidentes a partir do conhecimento da seqüência de DNA do genoma, havendo ainda grandes limitações em se utilizar a informação da seqüência de DNA com o intuito de conhecer o conteúdo e a dimani- cidade das proteínas codificadas por um determinado genoma. Fotografia versus filme Certos grupos de proteínas inter- agem entre si para realizar determi- nados trabalhos celulares. Um exem- plo bem típico são as proteínas orga- nizadas em vias metabólicas como a glicólise, o ciclo de Krebs, e outras, em que os produtos gênicos chama- dos enzimas precisam trabalhar em harmonia. Outro exemplo bem con- hecido é o caso das proteínas estru- turais que devem estar juntas e orga- nizadas precisamente para exercer a sua função, como exemplo, os com- ponentes de uma unidade ribossom- al, as histoproteínas que são essenci- ais para manter a estrutura da croma- tina etc. Desse modo, em estudos de expressão gênica é habitual assumir que grupos de genes cujos modelos de expressão são similares entre si, sejam provavelmente funcionalmente relacionados. Um problema com as técnicas de agrupamento de dados de expressão gênica (ESTs, SAGE, Microarrays), no entanto, é que elas são baseadas na suposição de que os genes que apre- sentam modelos de expressão simi- lares são de fato relacionados funcio- nalmente, isto é, eles têm funções que são relacionadas. Essa interpretação geralmente leva a erros na tentativa de entender a relação real entre os genes [através dos seus produtos]. Existem razões para pôr em dúvi- da essa suposição: primeiro, ainda é muito inconsistente o conhecimento de quão discretamente trabalham os grupamentos funcionais de genes na maquinaria celular. Pode ser que produtos gênicos individuais tenham tantos papéis diferentes em diferentes circunstâncias, que vários deles par- ticipem de papéis essenciais em mais de uma função. Por exemplo, os pro- cessos de defesa contra estresses bióti- cos (originados do ataque de agentes patogênicos), ou estresses ambientais, podem ser extremamente complex- os e envolverem diferentes mecanis- mos atuando em conjunto. Segundo, o termo “relacionados funcional- mente” é por si só mal especificado. Se o modelo de expressão de um gene é similar ao de um outro gene, isso pode significar vários tipos de re- lacionamento, desde “dois genes ten- do produtos que interagem fisica- mente”, “um gene que codifica para um fator de transcrição para outro gene”, “dois genes ambos com se- qüências promotoras ligadas por re- pressores que são liberados quando um receptor nuclear é ativado, mes- mo que os dois genes tenham funções muito distantes”. É claro que existe um nível de abstração no qual todos os genes são funcionalmente relaciona- dos no trabalho de manter a célula viva e produzindo todos os componentes necessários para o organismo como um todo. Mas abaixo desse nível de ab- stração existem muitos alternativos, pela sua natureza, favorecendo a definição de agrupamento. Portanto, é perfeitamente questionável a atri- buição indistinta de que similaridade em expressão corresponde à similar- idade em função. Além disso, o que constitui real- mente um modelo de expressão si- milar é ainda pouco preciso, ou pelo menos existem múltiplas definições alternativas. Por exemplo, similaridade poderia significar ter um modelo de mudança similar ao longo do tempo. Pode significar também níveis absolu- tos de expressão a qualquer dado momento, ou pode significar a per- feita oposição, mas bem coreografa- da no modelo de expressão. Pensan- do em métodos comparativos, qual medida de discrepância exatamente escolhida para medir os modelos de expressão influenciará o tipo de agru- pamento funcional esperado. Méto- dos confiáveis e exeqüíveis em esca- la genômica para medição absoluta da expressão gênica precisam ainda ser desenvolvidos. Corretamente interpretados ou não, dados de expressão gênica vêm sendo acumulados em volume e var- iedade cada vez maior. Um ensaio iso- lado de hibridação com DNA Microar- rays, por exemplo, fornece na me- lhor das hipóteses uma visão estática do nível de expressão comparativo en- tre os genes amostrados. Seria como a fotografia do evento. Mas dificil- mente uma fotografia consegue mos- trar todo o panorama. Uma nova fo- tografia, tomada de um outro ângulo, Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 31 Fig.6: Germinação de sementes de mamão sob condições in vitro, após ter-se retirado a sarcotesta e realizado sua assepsia pode mostrar nuances que não havi- am sido captadas anteriormente, e assim por diante. Conhecer as mudanças é diferente de percorrer o caminho que leva aos estados difer- enciados. Por exemplo, entender a trajetória da ocorrência de vários RNAs mensageiros em vez de conhecer apenas valores absolutos ou compar- ativos em um dado momento, pro- porciona muito mais informação so- bre a operacionalidade do sistema. A vida é essencialmente dinâmi- ca. Apenas o filme, isto é, a análise dinâmica do sistema, pode dar supor- te para o entendimento completo dos processos biológicos. E aí está o grande desafio da bioinformática. A integração comparativa dos dados precisa ser realizada in silico, trans- formando o conjunto de imagens es- táticas no filme da vida. As ômicas Antes da era da bioinformática, somente duas maneiras de fazer ex- perimentação em biologia eram dis- poníveis: utilizando um organismo vivo (também chamado in vivo) ou em um sistema artificial (também chama- do in vitro). Seguindo essa analogia, podemos dizer que a bioinformática é de fato a biologia in silico. A bioin- formática veio para facilitar o uso de computadores no sentido de organizar e analisar integradamente uma mon- tanha de dados complexos e variados, possibilitando enfrentar o desafio de decifrar componentes importantes dentro de um universo crescente de informações. Isso somado ao desen- volvimento de equipamentos podero- sos para a miniaturização e automação da aquisição de dados biológicos em A genômica se caracteriza pelo estudo dos genes e suas funções. A sua chegada, com o projeto genoma humano no final da década de 1980, alavancou toda a revolução atual no campo da biologia. Muitas expectativas e investimentos têm sido empregadas na genômica, visando aplicações nas áreas da indústria farmacêutica, agricultura, produção de energia e proteção do meio ambiente. Mas a determinação da seqüência completa de vários genomas não é o final da história. É apenas o começo, principalmente pelo fato de que mecanismos biológicos não podem ser inferidos simplesmente a partir do conhecimento da seqüência sem o auxílio de outras estratégias de estudo, as ômicas em geral. Genômica comparativa. Esse novo ramo da genômica, que vem se tornando cada vez mais comum dada a quantidade de seqüências de genomas sendo produzidas, tem o objetivo de comparar todo o conteúdo de DNA do genoma de um organismo particular com outros genomas já conhecidos. Através dessa análise pode ser possível identificar diferenças, tanto no conteúdo gênico quanto não-gênico, que podem ser responsáveis por importantes propriedades fenotípicas ou evolutivas, como patogenicidade, reações a condições ambientais adversas, proximidade taxonômica entre grupos e até mesmo a aquisição (ou manifestação?) de determinados comportamentos individuais. larga escala, deu campo para o surgi- mento de uma lista de novos termos, que não pára de crescer. Estamos en- trando na era das ômicas (Pals- son,2002). Com centenas de milhares de proteínas para identificar, correla- cionar e entender, por exemplo, não é suficiente estudar um gene, um produto gênico ou um processo de cada vez. Por outro lado, estudar em larga escala um conjunto de molécu- las com o objetivo de entender mecan- ismos celulares, dificilmente podem responder questões interessantes sem a assistência da informação gerada pela pesquisa tradicional dirigida por hipó- teses. Por isso, os dois tipos de ciên- cia atualmente disponíveis, as ômicas e as pesquisas dirigidas por hipóteses (Weinstein, 2001), são sinérgicas e devem ser utilizadas de modo a se complementarem. O produto inicial da expressão gênica em um organismo é conhecido como transcriptoma e se caracteriza por uma coleção de moléculas de RNA mensageiro cuja informação biológica é requerida pela célula em um determinado momento. Essas moléculas de mRNA são sintetizadas a partir de genes que codificam proteínas e, assim, direcionam a síntese do produto final da expressão gênica, o proteoma, que especifica a natureza das reações bioquímicas que a célula está apta a realizar. Um ponto importante a notar é que o transcriptoma nunca é sintetizado de novo, isto é, não começa do zero. Cada célula recebe parte de seu transcriptoma materno quando é formada pela divisão celular, e depois é responsável pela manutenção e adaptação do transcriptoma conforme os diferentes estágios de sua vida e o tipo de diferenciação tomado. Como regra geral, RNAs mensageiros bacterianos têm meias-vidas de não mais de poucos minutos e em eucari- otos a maioria dos mRNAs são degradados poucas horas após a sua síntese. O “turnover” rápido significa que a com- posição do transcriptoma não é fixa e pode ser rapidamente reestruturada pela mudança no nível de síntese de mRNAs específicos. Assim, a transcrição não resulta na síntese do transcriptoma, mas apenas o mantém pela reposição de mRNAs que foram degradados, e promove mudanças na composição do transcriptoma ligando ou desligando os difer- entes genes ou conjuntos de genes. Avanços tecnológicos baseados na PCR, intenso sequenciamento de cDNA e síntese de novo de ácidos nucléicos, têm contribuído para o desenvolvimento de técnicas de quantificação de mRNA em larga escala, em muitos casos em escala genômica, possibilitando que centenas ou milhares de genes sejam estudados em paralelo em vez de um gene de cada vez. Métodos como Differential Display (DD), Serial Analysis of Gene Expression (SAGE) e DNA array hibridization ou DNA microarray, todos trouxeram benefícios significativos em relação ao Northern blotting em termos de sensibilidade e número de ensaios. Entre essas tecnologias, a que vem ganhando preferência para estudar a composição de um transcriptoma, e fazer comparações entre diferentes transcriptomas, é a técnica de DNA microarray, Transcriptômica (ou genômica funcional) Genômica 32 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 que se baseia na hibridação em paralelo de ácidos nucléicos. Experimentos de expressão gênica com DNA microarrays vêm sendo largamente utilizados para explorar o modelo de expressão simultânea e em paralelo de milhares de genes. Isso requer ferramentas poderosas de correlação computacional. Um DNA microarray consiste de uma coleção de sequências parciais de genes (normalmente cDNAs) que são espotados individualmente em locais específicos de uma lâmina. Essas sequências geralmente variam de 500 a 4000 bases (idealmente 500 a 2000 bases) e podem ser escolhidas a partir de diferentes regiões do gene dependendo do objetivo do projeto. Uma variação da técnica, chamada DNA chip, é baseada na deposição ou síntese in situ de oligonucleotídeos para a geração de alvos. Esses chips contêm oligômeros curtos variando de 25 a 80 bases como seqüências-alvo. Enquanto essas sequências curtas podem conferir alta sensibilidade, elas podem apresentar baixa especificidade de ligação comparada com DNA microarrays, uma vez que as seqüências são curtas e usualmente não representam genes conhecidos. O uso de DNA microarrays para o estudo do modelo de expressão gênica baseia-se em dois princípios. Primeiro, considera-se que cada gene é expresso ou não e as diferenças no seu nível de expressão em uma célula ou tecido, em determinado momento, são um reflexo de quais mRNAs estão presentes e a sua abundância, e; segundo, as fitas de DNA podem hibridar-se com seqüências complementares formando uma molécula estável em fita dupla. Tipicamente, a primeira face dos dados experimentais de DNA microarrays é uma lista de genes/sequências ou números de identificação e o seu perfil de expressão. Modelos de correlação dentro do conjunto massivo de dados de pontos não são óbvios por uma inspeção visual. Diferentes algoritmos de agrupamento computacional precisam ser usados simultaneamente para reduzir a complexidade dos dados e para encurtar a relação entre genes de acordo com o seu nível de expressão ou mudanças nos níveis de expressão. Problemas relacionados com as técnicas de agrupamen- to são considerados na seção anterior. Uma das maiores vantagens da utilização da técnica de DNA microarray, comparando-a com outros métodos, é a facilidade da análise simultânea e em paralelo de um grande número de genes e de um grande número de amostras. Deve ser notado, entretanto, que todas essas técnicas usadas para a quantificação de mRNA proporcionam um nível de informação empírica e não uma condição estável absoluta. Além disso, sabe-se que a detecção de uma diferença na abundância de um mRNA específico entre duas amostras biológicas não é necessariamente refletida por uma diferença quantitativa equivalente no nível de abundância da proteína, o que muitas vezes está implícito nos estudos. Existem, portanto, limitações intrínsecas da técnica, entre as quais (i) a abundância do mRNA nem sempre é bem correlacionada com a abundância da proteína, (ii) a sensibilidade e variação dinâmica dos métodos existentes são tais que os mRNAs menos abundantes, potencialmente codificando as proteínas regulatórias mais importantes, não são facilmente medidos como acontece com os mRNAs mais abundantes, e (iii) a atividade das proteínas codificadas pelos mRNAs é regulada a vários níveis após a sua expressão. Por exemplo, a localização subcelular e/ou a extensão em que as proteínas são pós-traducionalmente modificadas, não são reveladas pela medição da abundancia do mRNA. Para entender a função de todos os genes em um organismo, é necessário conhecer não só quais genes são expressos, quando e onde, mas também quais são os produtos da expressão e em que condições esses produtos (proteínas) são sintetizados em certos tecidos. A proteômica tenta descrever o conjunto completo de proteínas produto da expressão do genoma (James, 1997), e fornece informações importantes para complementar os estudos de tran- scriptômica e metabolômica. Os organismos podem sintetizar muitos milhares de proteínas ao mesmo tempo, e a diversidade potencial de tipos de proteínas no proteoma certamente excede o número estimado de genes no genoma. Isso ocorre porque os produtos de um gene podem diferir devido a splicing alternativo e uma variedade de modificações pós-traducionais possíveis, como apresentado acima. O crescente interesse no campo da proteômica vem concentrando esforços para acelerar o desenvolvimento e implementação de estratégias mais apropriadas para a análise de expressão e função de proteínas em escala genômica. Esse interesse tem ocorrido, em parte substancial, devido ao sucesso dos projetos de sequenciamentos genômi- cos, considerando que a realização bem sucedida desses projetos tem resultado em uma apreciação mais extensa de que, por si só, eles revelam menos do que se esperava sobre a biologia do organismo. Os dados de sequências genômicas proporcionam uma plataforma essencial para um conhecimento mais amplo das estratégias experimentais complementares que darão suporte à caracterização dos genes contidos nos genomas. A utilização integrada dessas ferramentas possibilitará o entendimento de como os produtos desses genes atuam conjuntamente para regular as atividades do organismo. A proteômica depende da extração, separação, visualização, identificação e quantificação das proteínas presentes em um organismo ou tecido, em um determinado momento. Todos esses estágios têm limitações. Portanto, atualmente, é impossível descrever o proteoma completo de um organismo. Atualmente, o ponto de partida para muitas tentativas na investigação das mudanças na expressão protéica envolve a resolução das proteínas de uma mistura complexa por eletroforese 2-D e a sua subsequente identificação usando métodos analíticos cada vez mais precisos e poderosos. Eletroforese 2-D, complementada com HPLC, permite Proteômica Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 35 o mais impressionante avanço foi a emergência da bioinformática e o tre- inamento dos cientistas em tecnolo- gias modernas de pesquisa. Inicial- mente a bioinformática teve como aplicação principal facilitar o manuseio da grande quantidade de dados gera- dos pelos projetos genoma, como a montagem de contigs e fechamento de seqüências genômicas, além de dar suporte para outras estratégias exper- imentais no campo da biologia mo- lecular. De lá para cá, muitas informações foram disponibilizadas em bancos de dados públicos de seqüências gênicas, proteínas, estruturas de macromolécu- las, perfil metabólico, filogenia e ou- tros, cujo valor ainda não pode sequer ser estimado. Hoje não é mais possí- vel avançar em biotecnologia sem a integração da tecnologia da infor- mação com a tecnologia experimen- tal. As abordagens de estudos biotec- nológicos atualmente buscam resol- ver questões específicas, optando-se normalmente por fazer uma análise computacional inicial com a utilização dessas informações para direcionar e selecionar as estratégias experimen- tais, com considerável economia finan- ceira e de tempo, sem considerar a efetividade de tais procedimentos na aceleração da obtenção dos resultados e descobertas científicas. Além disso, muitas descobertas estão sendo feitas simplesmente pela análise sistematizada dessas fontes de dados, que não param de crescer tan- to em volume como em complexi- dade e variabilidade. A tendência atu- al é para descobertas científicas e sín- tese sendo dirigidas pela informação emergindo intrinsecamente a partir da biologia em si e a partir da diversidade e heterogeneidade das observações experimentais. Um projeto típico de pesquisa pode começar com a coleção de sequências genômicas conhecidas ou não conhecidas. Para sequências não conhecidas, pode-se conduzir uma busca em bancos de dados por sequên- cias similares ou usar algoritmos com- putacionais procurando predizer as suas possíveis identidades e funções. Isso requer o acesso à versão mais atual da coleção de dados, em bancos de dados mundiais, e as ferramentas fundamentais da bioinformática agora são cada vez mais parte dos métodos experimentais. Entretanto, essas infor- mações estão espalhadas em múltiplas fontes, impossibilitando que os cien- tistas obtenham direta e eficiente- mente a informação requerida para converter os dados complexos e het- erogêneos em dados úteis, informação organizada e sistematizada conforme as linhas de pesquisa específicas. Nesse ambiente, para responder uma simples questão pode ser necessário acessar várias fontes de dados e utilizar ferramentas de aná- lise sofisticadas, como alinhamento de sequências, agrupamento, modela- gem molecular etc. Enquanto a inte- gração dos dados é uma área de pes- quisa dinâmica, necessidades especí- ficas dos biocientistas têm levado ao desenvolvimento de numerosos siste- mas que acabam desconectando o acesso aos dados em um ambiente direcionado por resultados. O resulta- do é o crescente número de bancos de dados e web sites representando uma coleção confinada de dados, gov- ernada por sistemas próprios de ger- enciamento e formatos particulares de input e output dos dados, apresen- tações gráficas dos resultados, e pro- blemas sérios de compatibilidade e interoperabilidade com outros siste- mas. Uma evidência disso é o núme- ro crescente de novos bancos de da- dos relatados a cada ano na edição de janeiro da Nucleic Acids Research (http://nar.oupjournals.org/). A edição atual lista 548 bancos de dados, 162 a mais em relação ao ano anterior (Gal- perin, 2004). Boa parte desses ban- cos ainda são construídos com en- foques extremamente limitados para aplicações restritas, sem a preocu- pação com relação à compatibilidade e troca de informações com outros sistemas. Adaptações são lentas e muitas vezes difíceis de implementar quando a filosofia básica do banco pre- cisa ser mantida. O acesso a esses dados precisa melhorar em termos de eficiência, velocidade e facilidade. Para facilitar o entendimento dos processos biológi- cos, é necessário fazer novos arranjos aos recursos de dados disponíveis. Por exemplo, o que se faz inicialmente em uma rota metabólica, uma rede de interações moleculares etc., é necessário generalizar para outros sistemas biológicos; a partir de E. coli para levedura, e chegar à biologia de organismos mais complexos, como o homem, animais e plantas economi- camente importantes. Trabalhar toda essa informação conjuntamente é fun- damental para a geração de novos in- sights. O rápido crescimento do vo- lume de dados é um desafio para cada um, e com a produção de dados mais diversos e em larga escala (por e- xemplo, dados de DNA microarrays) esse crescimento está apenas começando. As atividades de bancos de da- dos e desenvolvimento de algoritmos computacionais precisam estar integra- das para produzir uma infra-estrutura de informação coesiva delimitando toda a biologia. Para isso é necessário o desenvolvimento de ferramentas para disseminar e analisar massivas quantidades de dados, inclusive lite- ratura, e a construção de comunidades de bancos de dados baseadas em princípios operacionais padronizados e com padrões interoperacionais. Muitos dos problemas da bioin- formática são genéricos, por isso soluções em um domínio podem ser naturalmente aplicáveis para outros. O entendimento da informação mo- lecular até a célula, órgão e o sistema biológico do organismo será o maior desafio (fenomenoma). A passagem do genótipo para o fenótipo requer- erá um novo conjunto de ferramentas computacionais altamente robustas. O principal enfoque da bioinformática para os próximos anos será integrar esses dados de modo a permitir bus- cas transparentes através dos dados. Fazer isso de forma robusta abrangen- do todo o conjunto de dados é um desafio real. Apesar do avanço já feito, é necessário continuar a pesquisa no campo da genômica, principalmente para microrganismos associados a plantas economicamente importantes, incluindo fungos, e buscar entender as interações hospedeiro-microrganis- mo ou planta-patógeno. No caso da medicina, a necessidade atual é por dados clínicos bem estruturados e con- sistentes sobre grandes populações. Tais dados, que são difíceis de coletar e caros, serão críticos para ligar os 36 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 dados moleculares com o fenótipo. Embora exista um crescente número de centros de bioinformática, a maior tendência é que ela esteja presente nos centros de pesquisa e nas univer- sidades, em cada departamento de biologia ou biotecnologia, em cada faculdade na área das ciências biológi- cas em todo o mundo. Todos os grandes centros de pesquisa terão que ter profissionais especializados em bio- informática/biologia computacional. Hoje é consenso geral que essas insti- tuições necessitam de pessoas com esse entendimento em seus departa- mentos de biologia e necessitarão for- mar os seus estudantes de graduação em biologia quantitativa em vez de somente biologia experimental. Os experimentos precisam ser feitos no contexto do conhecimento corrente, e os dados gerados precisam ser ra- pidamente armazenados e explorados computacionalmente juntamente com o universo de informação disponível. Nunca na história da ciência as informações foram tão democratica- mente acessíveis como hoje. Especial- mente as informações e ferramentas disponibilizadas pela bioinformática. Não importa quem e onde. O mesmo tipo de informação pode ser acessada por qualquer pessoa, em qualquer lugar do mundo. Praticamente todas as ferramentas de bioinformática e bancos de dados disponíveis podem ser dispostos de modo que possam ser acessadas e utilizadas na web. Basta fazer a pergunta correta e buscar a resposta. Conclusão O debate que está emergindo atualmente é se existe uma pletora ou escassez de dados experimentais proveitosos derivados pala plataforma das ômicas. O grande desafio, no en- tanto, é o que se pode fazer com es- ses dados. Não há dúvida de que a tecnologia da informação precisa ser tomada como parte integral do pro- cesso de descoberta pelos pesquisa- dores no campo da biologia. Este é o problema fundamental que precisa ser resolvido pela bioinformática, promo- vendo um profundo impacto no pro- cesso de descobertas biológicas. É necessário que ocorram discussões freqüentes entre todos os especialis- tas participantes de estudos relacio- nados, visando um emprego mais ad- equado da cultura científica dos par- ticipantes, já que, de modo simplifi- cado, os biólogos querem entender como os organismos funcionam e os cientistas da computação querem fazer ferramentas que resolvam problemas. O estabelecimento de uma linguagem comum entre os especialistas em difer- entes áreas, o monitoramento de quais ferramentas são mais usadas e impor- tantes para o escopo do estudo, uma filosofia orientada para novas descobertas, não orientada por dog- mas, são recomendações importantes para o sucesso dos empreendimen- tos científicos. Treinamentos cons- tantes e workshops devem fazer parte dos investimentos previstos nos pro- jetos. O bom entendimento entre os pesquisadores de diferentes áreas é fundamental. Por exemplo, os cien- tistas da computação devem ser pa- cientes com o biólogo, já que este geralmente não sabe exatamente onde quer chegar ou o que espera dos dados (o que é natural nos estudos biológicos). Deve ensinar pelo menos os conceitos básicos de computação para estabelecer uma plataforma co- mum de comunicação, encorajar os biólogos a mostrar como eles estão realmente usando as ferramentas dis- ponibilizadas e buscar sempre propor- cionar o máximo de acesso aos da- dos. A retenção longa dos dados inibe o espírito de comunidade. Por parte do biólogo, espera-se que não espere muito ou tente fazer as coisas sozi - nho, fale com uma variedade de cien- tistas da computação, encontre aque- les mais interessados no seu proble- ma, encontre aqueles com quem gos- ta de trabalhar, faça perguntas com freqüência e logo que surjam, use uma variedade de novas ferramentas, fa- zendo comentários/sugestões assim que puder e busque entender os de- safios da computação para solucionar problemas novos. A obtenção de no- vos conhecimentos acelera quando todos contribuem. Agradecimentos Aos colegas Dr. Francisco Pros- docimi, Dr. Newton Portilho Carneiro e Dr. Alexandre Lima Nepomuceno pela revisão crítica deste artigo. Referências Bassingthwaighte JB. Strategies for the physiome project. Ann Biomed Eng. 2000, 28(8):1043-58. PMID: 11144666 Bernal A, Ear U, Kyrpides N. Genomes OnLine Database (GOLD): a monitor of genome projects world- wide. Nucleic Acids Res. 2001, 29(1):126-127. 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PMID: 11911893 40 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 lhorando as propriedades físicas dos combustíveis para o motor a diesel (Clark et al., 1984). Assim, ésteres etí- licos ou metílicos de ácidos graxos (conhecidos por biodiesel) obtidos por alcóolise de óleos vegetais podem ser usados como combustíveis alternati- vos para os motores a diesel. As propriedades do biodiesel e diesel são comparadas na tabela 1 (Sri- vastava and Prasad, 2000; Yamane et al., 2001; Varese and Varese, 1996). O biodiesel produzido a partir de vários óleos vegetais possui visco- sidade próxima ao do diesel conven- cional. Os valores de poder calorífico inferior são menores, mas possuem número de cetano e ponto de flash altos. Uma vez que as características do biodiesel são geralmente similares às do diesel, teoricamente, este é um forte candidato a substituir parcialmen- te o diesel, caso sua produção a se viabilizar economicamente. Dentre as vantagens da utiliza- ção do biodiesel podem ser citadas: (I) É um combustível não- derivado do petróleo, mas proveniente de plan- tas, portanto sua combus- tão não aumenta o nível atual de CO 2 na atmos- fera, (II) Pode ser produzido local- mente e em pequenas escalas, reduzindo impor- tação de petróleo, (III) É biodegradável, (IV) Comparativamente, sua combustão produz redu- zidos níveis de CO, NO e material particulado. Trata-se de um fato estabeleci- do que a queima de biodiesel reduz substancialmente a emissão de SO x óxidos de enxofre e hidrocarbonetos. Existe um pequeno aumento atribuí- do à adaptação dos motores a diesel (Yamane et al., 2001-Sams, 1998). Yamane et al., 2001; recente- mente publicaram que um biodiesel com boa taxa de ignição, assim como alta concentração de metil oleato, gera menores níveis de NO, hidrocarbone- tos, HCHO, CH 3 CHO e HCOOH. She- ehan et al, 1998, publicaram um estu- do mostrando que o benefício ambi- ental de utilizar o biodiesel é propor- cional ao nível de mistura com o die- sel comum.A queima do biodiesel (100%) pode reduzir em 78,45% as emissões de CO 2 . Misturado na faixa de 20% ao diesel comum, reduz 15,66% a emissão de CO 2 . As conseqüências disto podem ser vantajosas tanto do ponto de vista ambiental como do ponto de vista econômico, o que justifica o crescen- te interesse no desenvolvimento das tecnologias referentes à produção de biodiesel. Este trabalho busca sintetizar os processos de transesterificação de óle- os existentes para a produção de bio- diesel, enfatizando a importância da transesterificação enzimática. A reação de transesterificação Como já foi mencionado, o bi- odiesel pode ser produzido por piró- lise, microemulsões ou transesterifica- ção. A transesterificação (também chamada de alcóolise) é a reação de formação de ésteres a partir de óleos e álcoois, resultando em glicerol. Dentre os álcoois que podem ser empregados neste tipo de reação o metanol e o etanol são os mais em- pregados, principalmente pelo custo e suas propriedades físico-químicas (menor cadeia carbônica). Estes po- dem reagir rapidamente com os trigli- cerídeos e o catalisador NaOH é facil- mente dissolvido. Para completa tran- sesterificação estequiométrica é ne- cessário ter uma relação molar de 3:1, no mínimo, entre o álcool e triglicerí- deos. A reação de transesterificação pode ser catalisada por álcalis, ácidos ou enzimas, e é o processo usado para produção de biodiesel nos Estados Unidos e na Europa. Essa reação tam- bém é usada na produção de ésteres metílicos para outras aplicações como detergentes e cosméticos. Os parâme- tros importantes na reação de transes- terificação são: a) A concentração de ácidos gra- xos livres nos óleos é fator importante na reação quan- do catalisada por NaOH, pois será maior seu requerimento para a neutralização. O con- teúdo de água nos reagentes deve ser baixo, pois podem ser formados sabões no pro- cesso, o que aumenta a vis- cosidade final do produto e dificulta a separação do gli- cerol. (Bradshaw and Meuly, 1944; Freedman et al., 1984; Feuge and Grose, 1949). b) O efeito da relação molar entre os reagentes é outro fator importante no rendi- mento da reação. Este fator está associado ao tipo de ca- talisador utilizado, por exem- plo: Na catálise ácida neces- sita de 30:1 de butanol e óleo de soja, enquanto na alcalina só foi requerido 6:1 para atin- gir a mesma taxa de esterifi- cação, por exemplo (Freed- man et al., 1986). c) Os tipos de catalisadores pos- síveis são os ácidos (H 2 SO 4 , HCL, derivados H 2 PO 4 ), alca- linos (KOH, NaOH) ou enzi- mas (lipases). A catálise alca- lina é muito mais rápida do que a ácida, contudo, quan- do se utilizam óleos usados com alto teor de água e áci- dos graxos livres, a catálise ácida é mais indicada (Spru- les and Price, 1950- Freed- man et al., 1986). Os estu- dos empregando lipases como biocatalizadores come- çaram a ser publicados no início da década de 90. d) O efeito do tempo de rea- ção: normalmente o grau de esterificação aumenta com o tempo. As reações são rápi- das se a dispersão é boa, du- ram até 15 minutos nas catá- lises químicas. e) O efeito da temperatura é variável em função dos tipos de óleos e do catalisador. A metanólise alcalina de óleo de mamona ocorreu bem entre 20-35ºC (Smith, 1949). Cinética das reações de transesterificação Existem muitos estudos rela- tados na literatura sobre a cinética da Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 41 catálise ácida (Freedman et al., 1986- Eckey, 1956) e básica (Freedman et al., 1986; Noureddini and Zhu, 1997) das reações de transesterificação. Du- fek et al., 1972; estudaram a esterifi- cação e transesterificação por catálise ácida do ácido 9(10)-carboniesteráti- co e seus mono e di ésteres metílicos. Freedam et al., 1986; relatam a rea- ção de transesterificação de óleo de soja e outros vegetais com álcoois, examinando o efeito do tipo de álco- ol, a relação molar entre os reagentes, tipo e concentração do catalisador e temperatura de reação na ordem e curso da reação. Tanto na presença de ácido, quanto na presença de base como catalisadores, a reação apresen- tou-se como sendo de pseudo-primei- ra ordem para o butanol e óleo de soja na proporção de 30:1. Na proporção de 6:1 de butanol e óleo de soja com catalisador alcalino, a reação apresen- tou cinética de segunda ordem. Para metanol e óleo de soja (6:1) com 0,5% de metóxido de sódio, a cinéti- ca foi combinada de segunda e quarta ordem. Serão discutidos brevemente a seguir os efeitos da presença de áci- dos graxos livres, da relação molar entre os reagentes e do tipo de cata- lisador no processo de transesterifica- ção. Efeito da relação molar entre os reagentes: Uma variável importante na taxa de esterificação é a relação mo- lar entre o álcool e o óleo. A estequiometria da reação de transesterificação requer 3 moles de álcool por mol de triglicerídeos, para render 3 moles de éster e um mol de glicerol (veja a Fig.1a). Alta relação molar resulta em maior obtenção de ésteres em menor tempo de reação. Na reação de alcóolise de óleo de amendoim com etanol, na proporção de (6:1), foi liberada maior quantida- de de glicerol do que na proporção (3:1). Freedman et al.1984, estudaram ainda, o efeito da relação molar (de 1:1 para 6:1) na conversão de óleos vegetais em ésteres metílicos. Os óleos de soja, girassol, amendoim e algodão apresentaram comportamento similar, com maior taxa de conversão atingi- da na proporção 6:1. Krisnangkura e Simamaharunop, 1992, estudaram a transesterificação de óleo de palma a 70ºC em presença de solvente orgâ- nico com metóxido de sódio como catalisador. Observaram que a taxa de conversão aumentou com o aumento da relação molar entre o metanol e o óleo de palma. Assim, a relação molar de 6:1 é geralmente a mais emprega- da em processos industriais para ob- ter ésteres metílicos em taxas de 98% de conversão (Feuge and Grose, 1949; Fillieres and Delmas, 1995). Efeito do tipo de catalisador: O metóxido de sódio tem se mostrado mais efetivo do que o hidróxido de sódio, provavelmente por produzir menor concentração de água durante a reação, do que NaOH e MeOH (Freedman et al., 1984; Hartman, 1956). Alcântara et al., 2000; reagiram três óleos – óleo de soja, óleo de fritura, e gordura de porco - com metóxido de sódio em dois tipos di- ferentes de reação: a transesterificação e a amidação, com metanol e dietilamina, respectivamente. As amidas aumentam as propriedades de ignição do óleo diesel. Como, tanto o hidróxido de sódio, quanto o de po- tássio são capazes de catalisar a transesterificação, e sendo ambos muito baratos, são extensivamente aplicados na produção de biodiesel industrialmente. Catalisador químico: A reação de tran- sesterificação com álcool pode ser re- presentada pela equação geral ilustra- da na Figura 1a. A Figura 1b mostra as reações consecutivas e reversíveis que sofrem os triglicerídeos na transeste- rificação. O primeiro passo é a con- versão dos triglicerídeos em diglicerí- deos, que é seguida pela conversão dos últimos em monoglicerídeos e fi- nalmente em glicerol, rendendo uma molécula de éster etílico em cada pas- so (Freedman et al., 1986; Noureddi- ni and Zhu, 1997). Catalisador enzimático: A cinética de transesterificação de triglicerídeos com metanol (metanólise) catalisada por lipase de Rhyzopus oryzal parece estar de acordo com o modelo teóri- co proposto (Kaieda et al.,2001), ou seja, inicialmente os triglicerídeos são hidrolisados pela lipase em glicerídeos parciais e ácidos graxos livres, e de- pois são sintetizados os ésteres metílicos com metanol e os ácidos graxos livres (veja Fig. 1b). Isso suge- re que, diferentemente da catálise al- calina, ácidos graxos livres contidos em óleos usados podem ser converti- dos facilmente em ésteres na catálise enzimática. Tabela 2. Comparação entre catálise alcalina e catálise enzimática com lipases para a produção de biodiesel anilaclAesilátaC acitámiznEesilátaC oãçaeredarutarepmeT 07-06 ºC 04-03 ºC oãnoelóonservilsoxargsodicÁ odanifer sodacifinopassotudorP seretséliteM amirp-airétamanaugÁ oãçaeranaicnêrefretnI aicnêulfnimeS seretsélitemedotnemidneR lamroN otlA lorecilgodoãçarepuceR licífid licáF seretsélitemedoãçacifiruP savitucesnocsnegavaL amuhneN 42 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 Transesterificação catalisada por ácidos in situ Os ácidos utilizados para tran- sesterificação incluem sulfúrico, fosfó- rico, hidroclórico e ácidos sulfônicos orgânicos. Embora a transesterificação por catálise ácida seja mais lenta que a alcalina (Ma and Hanna, 1999; Sri- vastava and Prasad, 2000; Freedman et al., 1984), a transesterificação áci- do é melhor quando o óleo usado tem alta concentração de ácidos graxos li- vres e água, como é o caso de óleos já utilizados para frituras e etc. (Free- dman et al., 1984; Aksoy et al., 1988). Aksoy et al. 1988, relatam que foi necessário realizar a reação de tran- sesterificação em catálise ácida quan- do o óleo utilizado foi de oliva com muitos compostos de enxofre. Em geral, os ésteres etílicos de ácidos gra- xos monossaturados ou de cadeia cur- ta, com 2% de ácido sulfúrico podem ser bons combustíveis alternativos (Klopfenstein, 1983). Transesterificação in situ dife- re do processo convencional porque se utiliza de óleo cru, diretamente com álcool acidificado, em vez de óleo e álcool purificados. Ou seja, a extração e transesterificação ocorrem no mes- mo processo com o álcool atuando em dois papéis: o de solvente extra- tor e na esterificação. A transesterifi- cação in situ do óleo de girassol com metanol acidificado produz ésteres metílicos com rendimento maior do que os obtidos com óleo pré-extraído (Harrington and D’Arey-Evans, 1985; Harrington and D’Arey-Evans, 1985). Kildiran et al., 1996; propuseram a transesterificação in situ do óleo de soja, enquanto Özgul e Türkay, 1993, relataram a esterificação in situ de óleo de arroz com diferentes álcoois mo- nohidratados, explorando a vantagem de extração simultânea dos lipídeos neutros de sementes, quando a tran- sesterificação in situ é empregada. Transesterificação catalisada por alcalina. As bases empregadas na catáli- se do processo de transesterificação incluem NaOH, KOH, carbonatos e alcóxidos como metóxido de sódio e butóxido de sódio. A transesterifica- ção alcalina ocorre, aproximadamen- te, 4000 vezes mais rápido do que a ácida (Formo, 1954), e é a mais em- pregada comercialmente. No caso da transesterificação alcalina, os glicerídeos e o álcool de- vem ser anidros, pois a presença de água favorece a reação de saponifica- ção dos ácidos com o sal, formando sabões (Wright et al., 1944). O sabão consome o catalisador reduzindo a eficiência catalítica e aumentando a viscosidade. As conseqüências são a formação de gel e a dificuldade de separação do glicerol. Ma et al. 1998, sugeriram que a concentração livre de ácidos graxos no óleo refinado deve ser a menor possível, abaixo de 0,5%. Feuge e Grose, 1949, também reforçaram a importância dos óleos estarem livres de água e de ácidos graxos. Freedman et al. 1984, reportam que as taxas de transesterificação são significativamen- te reduzidas se os reagentes não se- guirem os requerimentos acima. Transesterificação utilizando fluidos supercríticos Com o objetivo de desenvol- ver um novo processo de metanólise de óleos sem qualquer catalisador, Saka e Kusdiana, 2001, fizeram um estudo fundamental para produção de biodiesel em metanol supercrítico. Demonstraram que o pré-aquecimen- to a 350ºC por 240s em metanol su- percrítico, foi suficiente para conver- ter óleo de semente de colza em és- teres metílicos. Os ésteres metílicos produzidos em metanol supercrítico foram os mesmos obtidos em catálise alcalina, mas com taxa de conversão maior. As análises cinéticas das reações demonstraram que a conversão de ésteres metílicos é muito mais rápida em condições supercríticas. As melho- res condições foram a 350ºC e rela- ção molar de 42:1 entre metanol e óleo (Kusdiana and Saka, 2001). Uma hipótese para a acelera- ção da reação é que metanol super- crítico tenha natureza hidrofílica com baixa constante dielétrica, dessa for- ma, os triglicerídeos não polares po- dem ser bem solvatados pelo meta- nol supercrítico, formando um siste- ma unifásico de metanol/óleo. Além disso, o metanol líquido é um solven- te polar e apresenta pontes de hidro- gênio entre o OH-oxigênio e OH-hi- drogênio formando clusters de meta- nol, dificultando o acesso do triglicerí- deo. Estas podem ser algumas razões para a transesterificação supercrítica apresentar maior velocidade de rea- ção. Assim como na transesterifi- cação enzimática, e ao contrário da alcalina, os ácidos graxos livres conti- dos no óleo também podem ser este- rificados em metanol supercrítico. Além deste aspecto positivo, adicio- na-se o fato de não utilizar catalisado- res químicos, o que torna mais fácil a separação dos produtos dessa reação em relação à catálise alcalina. Deve- se observar que neste novo processo são requeridas altas temperaturas (350ºC) e pressões (45 MPa), além de grandes quantidades de metanol, e que, para aplicação industrial, são ne- cessárias mais investigações do pro- cesso. Transesterificação enzimática de óleos vegetais Nelson et al., 1996; foram os primeiros a estudar a alcóolise enzi- mática de triglicerídeos com o objeti- vo de produzir biodiesel. Quando a alcóolise de vários óleos e gorduras com metanol e etanol foi conduzida usando lipase imobilizada de R. mi- chei na presença de hexano, mais de 95% dos triglicerídeos foram conver- tidos em metil ou etil ésteres. A me- tanólise de gordura de carne atingiu 65% de conversão, sem adição de sol- ventes orgânicos. Foi observado que, quanto maior a cadeia carbônica do álcool empregado, maior foi a conver- são da gordura de carne. Embora a transesterificação quí- mica, empregando catálise alcalina, resulte em altas taxas de conversão de triglicerídeos em seus respectivos ésteres, quando se trata de curtos tem- pos de reação, existem alguns incon- venientes ou desvantagens: 1) tem altos gastos energéticos, 2) a recuperação do glicerol é difícil e demorada, 3) remoção do catalisador é ne- cessária, Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 45 Conclusão Os estudos de transesterificação enzimática ainda são muito recentes, mas já demonstram o potencial desta tecnologia na transesterificação de óleos vegetais. As vantagens da reação enzimática frente às tecnologias químicas são evidentes, e justificam o investimento em pesquisas e desen- volvimento de tecnologia nacional para implantação no Brasil. Tomando como exemplo o que ocorreu com a indústria de gor- duras e óleos na década de oitenta, tendo sido substituído o processo de hidrólise química pelo enzimático com aumento de qualidade e de pro- dutividade, a indústria do biodiesel deve conhecer e testar as tecnologias enzimáticas para este processo. Referências bibliográficas Abigor, R., Uadia, P., Foglia, T., Haas, M., Jones, K., Okpefa, E., Obibuzor, J., and Bafor, M.: Lipase-catalysed production of biodiesel fuel from Nigerian lauric oils. Biochem. Soc. Trans., 28, 979- 981 (2000). Aksoy, H. A., Kahraman, I., Karaosmanoglu, F., and Civelekoglu, H.: Evaluation of Turkish sulphur olive oil as an alternative diesel fuel. J. Am. Oil Chem. Soc., 65, 936-938 (1988). Alcantara, R., Amores, J., Canoira, L., Fidalgo, E., Franco, M. J., and Navarro, A.: Catalytic pro- duction of biodiesel from soy-bean oil, used frying oil to diesel and tallow. Biomass Bioenerg., 18, 515- 527 (2000). 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Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 47 Biotecnologia aplicada ao valor nutricional dos alimentos Pesquisa Neuza Maria Brunoro Costa PhD em Nutrição Humana, professora do Departamento de Nutrição e Saúde, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, MG nmbc@ufv.br Biofortificação biotecnologia baseia-se na habilidade de introduzir, com precisão, construções gênicas em um organis- mo, usando a tecnologia do DNA recombinante ou técnicas de engenharia genética para alterar os seus processos metabólicos favoravel- mente. A maioria das pesquisas de me- lhoramento de plantas das duas últi- mas décadas tem sido direcionada para aumentar a produtividade e resistência a doenças e pragas. Atualmente, a aplicação de biotecnologia às plantas tem sido direcionada para aumentar sua qualidade nutricional (Zimmermann e Hurrel, 2002). Segundo Kishore e Shewmaker (1999), o desenvolvimento da biotec- nologia pode ser dividido em três fa- ses. A primeira fase consistiu na intro- dução de características agronômicas. Desde 1995, alguns produtos com melhores aspectos culturais têm sido lançados no mercado, com a soja Roun- dup Ready, tolerante ao glifosato, um ingrediente ativo do herbicida Roun- dup. Outro exemplo de produto com melhores aspectos culturais é o milho YieldGard. Este milho possui um gene que codifica para uma proteína inseti- cida que ocorre naturalmente na bac- téria Bacillus thuringiensis e confere resistência à broca no milho, inseto que infesta a cultura e reduz sua produção de 6% a 20%. A segunda fase da biotecnologia visa à produção de culturas de melhor qualidade. O melhoramento genético clássico tem produzido alimentos dife- renciados, como a canola com alto teor de ácido erúcico e glicosinolato, milho ceroso com alto teor de amilose, arroz com grão longo e trigo durrun. Vários produtos para ração animal estão sen- do desenvolvidos, entre os quais aque- les com grãos com alta densidade caló- rica, devido ao elevado conteúdo de óleo; e os de grãos com alta densidade de nutrientes, principalmente teor de proteína, aminoácidos essenciais ou micronutrientes. O milho com alto teor de óleo (6% ou mais) e/ou alto teor de proteína é resultado do melhoramento molecular. Outro exemplo da biotec- nologia, introduzindo genes que alte- ram vias metabólicas, é a produção de gordura sólida ou semi-sólida sem áci- dos graxos trans nas sementes oleagi- nosas. Isso é possível, inibindo-se a conversão de ácido esteárico para oléi- co em soja e canola. A melhoria de atributos como flatulência, flavor do feijão, propriedades de textura e emul- sificação da soja também são exem- plos de novos produtos da biotecnolo- gia da segunda fase. A terceira fase da biotecnologia Fotos cedidas pela autora 50 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 mento de fitossideróforos, que por sua vez eleva o conteúdo de ferro nessas plantas. Para aumentar o conteúdo mine- ral em algum tecido específico das plantas através da manipulação trans- gênica, é necessário não somente au- mentar a absorção do mineral pela raiz, mas também conduzi-lo aos diversos órgãos da planta (Grusak, 2002). Com o objetivo de elevar o teor de ferro do arroz branco ou polido, foi realizada a inserção de genes que ex- pressam três proteínas no endosper- ma central: fitoferrina de Phaseolus, proteína semelhante à metalotioneína, rica em cisteína endógena, e uma fita- se de Aspergillus fumigatus termorre- sistente. A proteína semelhante à me- talotioneína, rica em cisteína, superex- pressa em arroz aumentou o conteúdo de resíduos de cisteína sete vezes e o nível de fitase 130 vezes. Isso possibi- lita uma atividade da fitase suficiente para degradar o ácido fítico completa- mente. Entretanto, a proteína fitase do fungo perde sua atividade após a coc- ção do arroz. A expressão de fitoferrina pode dobrar o conteúdo de ferro do endosperma do arroz, variando de 1,15 a 2,21 mg/100 g, em comparação com arroz-controle, que apresenta de 1,0 a 1,1 mg/100 g. Os peptídios ricos em cisteína melhoram a absorção de ferro no intes- tino, pois são considerados os princi- pais contribuidores na absorção de fer- ro. Outra opção para aumentar o con- teúdo de ferro em plantas é a introdu- ção de ácido ascórbico, hemoglobina e peptídeos contendo cisteína no tecido vegetal (Zimmermann e Hurrel, 2002). O consumo extra de ferro no arroz transgênico parece ser de significância nutricional, considerando-se um con- sumo diário de 300 g de arroz por um adulto, o que representaria elevar de 3mg para 6 mg de ferro provenientes do arroz, o equivalente a 20% das recomendações diárias de ferro. Beta caroteno e vitamina A A deficiência de vitamina A é problema de saúde pública em mais de 70 países. Duzentos e cinqüenta milhões de crianças são deficientes de vitamina A, e a cada ano três milhões de crianças desenvolvem xeroftalmia (FAO/WHO, 1998). A vitamina A é requerida para visão, crescimento, reprodução, proli- feração e diferenciação celular e inte- gridade do sistema imune. É fornecida na dieta como retinol pré-formado, principalmente como éster de retinol, pelos alimentos de origem animal e pelos carotenóides, pró-vitamina A, presentes em alimentos de origem vegetal. O consumo de micronutrientes deve ser suficiente para prevenir defi- ciências e manter boa saúde. Em con- dições normais, uma dieta bem balan- ceada fornece quantidades suficientes de todos os nutrientes para o funciona- mento adequado do organismo. Em condições fisiológicas específicas, o consumo de nutrientes por meio de alimentos naturais pode, entretanto, ser inadequado. Em tais casos, suple- mentos ou produtos fortificados po- dem prevenir a inadequação. A aplica- ção da biotecnologia em alimentos para aumentar o teor de β-caroteno (biofortificação) tem sido considerada uma opção atrativa (Winter e Rodri- gues, 1997). Em mandioca, o conteúdo de b- caroteno atinge mais de 20 mg/kg em algumas variedades. A intensidade da cor da raiz está altamente correlaciona- da com a concentração de caroteno, a qual parece ser determinada por dois genes, um que controla o transporte de intermediários para a raiz e outro responsável pelo processo de estoca- gem. O cultivar de tomate Caro-Red possui 10 vezes mais caroteno que cultivares normais, entretanto ele teve problemas de aceitação devido a cor menos vermelha (Graham et al., 1999). Nos países tropicais, o arroz é beneficiado para remover a camada de aleuroma rica em óleo, para reduzir a rancificação durante a estocagem. Na porção restante, assim como no farelo, Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 51 a provitamina A é deficiente (Zimmer- mann e Hurrel, 2002). A engenharia genética foi usada para produzir grãos de arroz ricos em β-caroteno. O endos- perma de arroz imaturo pode sintetizar o composto intermediário geranilgera- nil difosfato, uma molécula isoprenói- de de 20 carbonos. A condensação de duas moléculas de geranilgeranil difos- fato produz o fitoeno, uma molécula com 40 carbonos. O fitoeno é o primei- ro carotenóide precursor na via bios- sintética para a produção de β-carote- no, pela expressão da enzima fitoeno sintase. Entretanto, alterando o precur- sor geranilgeranil difosfato para a pro- dução de β-caroteno, pode reduzir os níveis de outros compostos. A síntese de β-caroteno a partir do fitoeno requer complementação com três enzimas: a dessaturase fitoeno, a dessaturase β-caroteno e a licopeno β- ciclase (Zimmermann e Hurrel, 2002). O fitoeno é precursor do licopeno, o qual é convertido a caroteno (Dunwe- ll, 1999). A introdução simultânea desses genes foi um dos maiores avanços tecnológicos, e 1,6 a 2 µg de β-carote- no/g de arroz fresco foram expressos (Zimmermann e Hurrel, 2002). O Go- den rice, o arroz-dourado e genetica- mente modificado para expressar alto conteúdo de carotenóide, tem recebi- do atenção da mídia pelo seu potencial em suprir provitamina A para milhões de indivíduos. Foi desenvolvido em 1990 por pesquisadores alemães e suíços, com financiamento da Funda- ção Rockefeller, e tende a ser cruzado com variedades locais de arroz. Três genes tirados do narciso-silvestre e da bactéria Erwinia sp foram introduzidos no arroz para produzir um grão amare- lo, com altos níveis de β-caroteno, que é convertido em vitamina A no orga- nismo. Esforços iniciais com o Golden rice têm-se concentrado na Índia, mas esta tecnologia deverá se estender a outros países da Ásia, África e América do Sul. O arroz com vitamina A produzi- do geneticamente tem sido indicado como importante alternativa no com- bate à cegueira. Mais de dois milhões de crianças estão sob o risco de ceguei- ra devido à deficiência de vitamina A. Trata-se, portanto, de um esforço para melhorar a saúde de milhões de pesso- as, a maioria na Ásia, visto que é difícil obter uma grande abrangência aos mal- nutridos do mundo inteiro com o uso de pílulas. Projeto similar ao Golden rice está sendo realizado para introduzir a enzi- ma fitoene sintase na canola (Brassica napus). A concentração de caroteno obtida foi de 1.000 a 1.500 µg/g de semente. Essa tecnologia foi também transferida para a mostarda (Brassica juncea), cultivada em muitas partes do mundo, incluindo Índia, Nepal e Ban- gladesh, sendo o segundo maior óleo consumido na Índia. O óleo de mostar- da deverá conter β-caroteno suficiente para reduzir a deficiência de vitamina A na população indiana e, visto tratar- se de óleo, é esperado que tenha alta biodisponibilidade (Mackey, 2002). Vitamina C Vitamina C, cujos nomes químicos são ácido ascórbico ou ascorbato, é um doador de elétrons, antioxidante ou agente redutor. A vitamina C promove a absorção de ferro não-heme, redu- zindo, assim, a anemia. As pessoas que possuem esto- ques máximos (20 mg/kg) de vitami- na C podem viver durante dois meses, sem o consumo de vitamina C, sem que os sinais clínicos de deficiência apareçam. Com um consumo abaixo de 30 mg/dia, as concentrações plas- máticas ficam em 11 µmol/L. Acima desse consumo, as concentrações au- mentam rapidamente para 60 µmol/L (FAO/WHO, 1998). Uma justificativa para o aumento do teor de vitamina C em alimentos é o fato de esta conferir proteção contra cataratas, câncer e lesões oxidativas no DNA do esperma. Segundo Ames (2001), os fumantes deveriam ingerir muito mais vitamina C que os não- fumantes para alcançar o mesmo nível de vitamina C no plasma. O risco de câncer para descendentes de pais fu- mantes é maior quando o consumo de antioxidante da dieta é baixo. O nível de vitamina C pode ser aumentado, expressando-se o gene que codifica a enzima L-galactona-α- lactona desidrogenase (Dunwell, 1999). Em plantas e alguns animais, mas não no homem, o ácido ascórbico é sintetizado a partir da glicose. Genes codificando sorbose desi- drogenase e sorbosone desidrogenase de Gluconobacter oxydans inseridas no mesmo organismo possibilitam a conversão de sorbitol a 2-ceto-L-gulo- nato. Erwinia herbicola contendo o gene de Corynebacterium sp. conver- te glicose em ácido 2-cetogulônico, o qual pode ser facilmente convertido em ácido ascórbico (Demain, 2000). Fitato O fitato, uma molécula de açúcar/ álcool ligado a seis grupos fosfato, é uma fonte de fósforo para a semente, necessária para a germinação (Raboy, 2001). Uma redução no teor de fitato pode ser inaceitável, já que reduziria o teor de fósforo total. Além disso, altos conteúdos de fitato estão associados com altos conteúdos de ferro e zinco (Grahan et al., 1999). Entretanto, na alimentação, o fitato é um fator antinu- tricional porque quela ferro, cálcio, zinco e outros íons divalentes, tornan- do-os indisponíveis para absorção. Tal efeito negativo do ácido fítico tem maior impacto em países em desen- volvimento, onde grande parte da população tem como principais fontes de zinco os cereais, tubérculos e as leguminosas e acesso limitado a ali- mentos de origem animal. Os efeitos benéficos do mioinositol na saúde, como agente anticancerígeno e antio- xidante, têm maior impacto nos países desenvolvidos, onde a maior preocu- pação é com patologias associadas ao envelhecimento, como dano oxidati- vo e câncer (Brinch-Pedersen et al., 2002). A adição de fitase de Aspergillus ninger em soja e canola, via transgêne- se, levou a uma menor excreção de fósforo nas fezes de frangos e de suínos, indicando maior biodisponibili- dade de fósforo e de outros minerais normalmente quelados ao fitato, como ferro e zinco. Além disso, a menor liberação de fósforo no ambiente re- duz seu arraste pela água, reduzindo o impacto ambiental. O uso de fitase em vez da remoção do fitato do alimento tem a vantagem de não reduzir o teor de fósforo do alimento, além de au- mentar a sua biodisponibilidade (Brin- ch-Pederson et al., 2002). 52 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 Para melhorar o valor nutritivo mineral, a biotecnologia (biofortifica- ção) pode ser aplicada de três formas: para elevar a concentração de minerais em tecidos apropriados, como en- dosperma de cereais; para elevar os níveis de compostos que aumentam o uso do mineral e reduzir os fatores antinutricionais, como mioinositol. Em humanos, milho com baixo teor de fitato, contendo 73% do fosfato dispo- nível, teve a absorção de zinco aumen- tada em 76% (Raboy, 2001). Produtos de origem animal O melhoramento genético, as téc- nicas de reprodução e a manipulação da alimentação animal têm levado a melhorias na produção e valor nutriti- vo da carne de suínos, aves, peixes e ruminantes em geral. A manipulação da composição da carne de suínos tem possibilitado alte- rações. Por exemplo, o aumento do teor de ácidos graxos monoinsatura- dos, a redução da relação de ácidos graxos ω-6/ω-3 de 7 a 10 para 4 a 5 e o aumento do conteúdo de ácidos graxos polinsaturados de cadeia longa (EPA e DHA), elevando, assim, a sua qualidade nutricional e propiciando maiores benefícios à saúde. A qualidade da carcaça e a homo- geneidade dos animais quando abati- dos poderiam ser melhoradas com o uso da clonagem ou da produção in vitro de embriões em larga escala. Em médio prazo, é possível a integração da biotecnologia da reprodução com a genética quantitativa e molecular. No longo prazo, a competitividade das carnes de ovelha e cabrito poderia ser amplamente aumentada pelas novas técnicas reprodutivas e genéticas. En- tretanto, ainda não está claro se esses avanços serão bem aceitos pelos con- sumidores nos países desenvolvidos. Pesquisa no Reino Unido apontou os organismos geneticamente modifica- dos (OGM) como a principal preocu- pação do consumidor, entretanto téc- nicas de manipulação na criação de peixes, como a ginogênese, a andro- gênese e a transgênese, têm sido usa- das rotineiramente. Existem previsões de uso de carnes com baixos teores de gordura e de colesterol obtidas de animais transgênicos. Questiona-se, entretanto, se a obtenção dessas carac- terísticas desejáveis só será possível por meio da modificação genética, utilizando-se transgênicos. O papel da biotecnologia será, num primeiro momento, limitada à preservação da biodiversidade e à au- tenticidade do produto, mas desem- penhará um papel importante em ter- mos de desenvolvimento sustentável da produção animal extensiva. O número e as condições das fibras musculares são parâmetros fisio- lógicos importantes no animal vivo e determinantes-chave da qualidade e quantidade da carne. A interação entre genes e fisiologia pode determinar a qualidade e quantidade da carne. Isso pode beneficiar a indústria da carne pelo aumento da quantidade de tecido magro da matéria-prima, com ótimas características de qualidade e menor variabilidade do produto final (Garnier et al., 2002). A aceitação da biotecnologia ani- mal encontra-se nos dias de hoje apoi- ada em preocupações de ordem ética, segurança alimentar e ambiental, bem- estar dos animais, benefícios para os consumidores, produtores e agroin- dústria e impacto socioeconômico. A biotecnologia pode ser aplicada para melhorar a performance dos animais com uma melhor nutrição, aumento do potencial de produção, melhoria do estado de saúde e redução dos resídu- os pela melhor utilização dos recursos (Bonneau e Laarveld, 1999). A adição de enzimas pode melho- rar a disponibilidade de nutrientes de alimentos, diminuir custos de alimen- tação e reduzir os dejetos de produção no ambiente. Pré e probióticos ou suplementos imunes podem inibir microrganismos intestinais patogêni- cos ou tornar o animal mais resistente a eles. A biotecnologia pode melhorar o valor nutricional das plantas, ou in- corporar vacinas ou anticorpos na ali- mentação, o que protegerá o animal mais eficientemente contra doenças. A administração de somatotropi- na recombinante acelera o crescimen- to e proporciona carcaça mais magra e aumenta a produção de leite. Entretan- to, quando administrada em longo pra- zo, aumenta a incidência de osteocon- drose, cartilagem macia, úlcera esto- macal, resistência à insulina e estresse. Pode também reduzir a capacidade de detoxicação do fígado, reduzindo a eliminação de xenobióticos pelos ani- mais (Bonneau e Laarveld, 1999). A expressão do gene somatotro- pina em peixes e porcos proporciona crescimento mais rápido, melhor efici- ência alimentar e carcaça mais magra. A expressão do hormônio IGF-1 (fator de crescimento semelhante à insulina) no músculo aumenta o crescimento muscular em porcos. O gene c-ski em porcos e gado resulta em hipertrofia muscular (Bonneau e Laarveld, 1999). Os avanços da engenharia genéti- ca podem ser aplicados para melhorar a produção e sua eficiência, alterar a composição do leite e auxiliar na pre- venção, diagnóstico e tratamento de doenças. Algum progresso já foi alcan- çado, como o desenvolvimento de bactérias que produzem grandes quan- tidades de proteína e são importantes reguladoras do metabolismo; seleção mais rápida e melhoria no cruzamento de animais e plantas pela transferência de genes; desenvolvimento de testes de DNA no diagnóstico de doenças infecciosas; e produção de anticorpos monoclonais para o tratamento de doenças, dentre outras. A biologia molecular tem ainda o potencial de produzir animais transgênicos capazes de produzir leite com diferente com- posição; a concentração de caseína poderá ser aumentada ou modificada, visando à produção de queijo; a prote- ína β-lactoglobulina, que causa proble- mas na manufatura do leite, poderia ser suprimida; a concentração de gor- dura no leite poderia ser reduzida pela supressão da enzima CoA carboxilase, assim como a concentração de lactose poderia ser reduzida pela remoção da α-lactoalbumina ou pela introdução de uma enzima capaz de quebrar a lacto- se em glicose e galactose; e outras modificações de interesse da indústria e do consumidor (Chalupa et al., 1996). Embora sejam muitas as aplica- ções da biotecnologia para a produção animal, sua aceitação é pequena. Os benefícios podem ser grandes para a indústria de alimentos, como a melho- ria na carcaça dos animais. Também pode beneficiar tanto a indústria como a população, pela redução dos custos de tratamentos medicamentosos dos animais, menor produção de resíduos, Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 55 Criptosporidiose em camundongos imunodeficientesPesquisa Fotos cedidas pelos autores Delma Pegolo Alves Doutoranda do Depto de Parasitologia IB - Unicamp Diretora Associada do CEMIB Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica delma@cemib.unicamp.br Maria Helena Seabra Soares de Britto Mestre em Imunologia - Unicamp Doutoranda do Depto de Parasitologia IB - Unicamp Professora do Depto de Farmácia da Universidade Federal do Maranhão mhssb@elo.com.br Ana Maria Aparecida Guaraldo Profa Dra do Instituto de Biologia Departamento de Parasitologia - Unicamp Diretora do CEMIB - Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica guaraldo@cemib.unicamp.br Dinâmica da eliminação de oocistos de Cryptosporidium sp em linhagens de camundongos imunodeficientes 1. Introdução Em 1907, TYZZER descreveu Cryptosporidium muris para designar um pequeno protozoário coccídio, encontrado nas glândulas gástricas de camundongo. Posteriormente, em 1912, TYZZER descreveu uma nova espécie Cryptosporidium parvum. Por meio de infecção experimental em camundongos, ele demonstrou que C. parvum desenvolvia somente no in- testino delgado, e os oocistos eram menores em relação aos oocistos do C. muris. (FAYER et al, 1997). Somente em 1976 foram relata- dos os dois primeiros casos de criptosporidiose humana, sugerindo um comportamento oportunista do parasito em indivíduos imunocompro- metidos (NIME et al, 1976). Em indivíduos imunocompe- tentes e com sistema imunólogico comprometido, a criptosporidiose é reconhecida como uma importante doença diarréica. Geralmente a in- fecção pode ser assintomática em in- divíduos imunocompetentes, enquan- to nos indivíduos portadores de HIV ou outras desordens imunológicas, freqüentemente a infecção se torna crônica (TZIPORI et al, 1986). As características clínicas da criptosporidiose são bem descritas. A doença pode apresentar quatro for- mas: assintomática, importante por causar a transmissão endêmica, transi- tória ocorrendo em indivíduos imuno- competentes, com período de incu- bação de 6 dias e uma duração de 2 a 30 dias. Na forma sintomática são freqüentes a anorexia, diarréia aquosa, desconforto abdominal e febre. A for- ma crônica é comum nos pacientes HIV positivos, levando à desidratação e agravamento clínico em indivíduos desnutridos. A forma fulminante é exclusiva de pacientes HIV positivos ou imunossuprimidos devido à te- rapêutica, apresentando-se como uma doença semelhante ao cólera (GRIF- FITHS, 1998). Morgan-Ryan et al, 2002, descreveram uma nova espécie de Cryptosporidium, designando a de genótipo humano de C. parvum, genótipo 1 ou genótipo H. Considerando as diferenças biológicas e moleculares, esta nova espécie foi denominada :Cryptospor idium hominis. Alguns estudos consideram que esta nova espécie não infecta camun- dongos, ratos, cães e bezerros. Porém, a infecção com o C. hominis foi re- portada em mamífero marinho Dug- ong dugon e ovelhas, experimental- mente foi demonstrada em ovelhas, gado e leitões (XIAO et al., 2004). Os surtos de criptosporidiose têm ocorrido devido a transmissão do C. parvum pela água, pois os oocistos não são retidos pelos sistemas de fil- tros no tratamento da água e são re- sistentes aos produtos desinfetantes (SMITH & ROSE, 1998). Um dos maiores surtos de criptosporidiose já registrado ocorreu em abril de 1993, nos Estados Unidos, na cidade de Milwaukee, onde aproximadamente 400.000 pessoas foram infectadas com oocistos de Cryptosporidium parvum veiculados pela água (MCKENZIE et al, 1994). Franco et al, 2001, realizaram uma investigação sobre a ocorrência de oocistos de Cryptosporidium e cistos de Giardia, na Região Sudeste do Bra- 56 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 sil, em água superficial do rio Atibaia. Os autores relataram que todas as amostras examinadas foram positivas para ambos os protozoários. Experimentalmente a criptospo- ridiose ocorre em animais de labo- ratório que são imunologicamente imaturos, ratos tratados com drogas imunossupressoras, camundongos atímicos, camundongos tratados com anticorpos anti-CD4, camundongos NIH-III (bg/nu/xid) e camundongos bg (TZIPORI & GRIFFITHS, 1998). Um problema associado com o estudo experimental da criptosporid- iose em mamíferos é que muitas es- pécies de hospedeiros são suscep- tíveis à infecção com C. parvum du- rante as três primeiras semanas de vida (UNGAR et al, 1990). Os camundon- gos imunocompetentes das linhagens BALB/c e C57BL/6 infectados ao na- scer, apresentam resolução da infecção no decorrer da maturação do sistema imunológico e da colonização da mi- crobiota associada (HARP et al, 1988). ENRIQUEZ & STERLING (1991) se propuseram a identificar um mo- delo animal com potencial de uso para o estudo da infecção pelo C. parvum. Para tanto, avaliaram 19 linhagens diferentes de camundongos adultos e uma de gerbil (Meriones unguicula- tus). Os resultados mostraram que somente os camundongos beige (C57BL/6J-bg j), apresentaram números significantes de oocistos no 7o dia após a infecção. O modelo scid torna-se impor- tante por se infectar cronicamente com C. parvum e desenvolver sinto- mas similares aos apresentados por pacientes com imunodeficiência (MEAD, et al, 1991). Camundongos scid tratados com anti-interferon-gama são usados para o estudo da infecção pelo C. parvum, na fase aguda du- rante os vinte primeiros dias após o desafio com o C. parvum, quando a infecção é limitada ao trato gastrointes- tinal. Na fase crônica da doença, do 32o ao 47o dias após a infecção pelo C. parvum, ocorre comprometimen- to hepatobiliar e dos ductos pancre- áticos (TZIPORI et al, 1995). Os camundongos knockout (KO) para IFN-γ (interferon-gama), são uti- lizados para o estudo da criptosporid- iose, devido ao desenvolvimento de sinais clínicos e perda de peso. Estes animais se infectam com baixas doses de oocistos de C. parvum, com ape- nas 10 oocistos o animal desenvolve a infecção, tornando-se um modelo importante para avaliação de drogas terapêuticas (GRIFFITHS et al, 1998). Com base nas diferenças imu- nológicas entre as linhagens de ca- mundongos C57BL/6 KO para IFN-γ, C.B-17 scid, C57BL/6 bg e C3H nu, o presente estudo tem como objetivo a avaliação da dinâmica da eliminação de oocistos da linhagem MMC de Cryptosporidium sp em animais adul- tos. 2. Material e métodos O protocolo experimental nº428/ 1 referente a esta pesquisa foi apro- vado pela CEEA (Comissão de Ética em Experimentação Animal) do Insti- tuto de Biologia da UNICAMP - Uni- versidade Estadual de Campinas. 2.1 Manutenção “in vivo” da linhagem MMC de Cryptosporidium sp Conforme relatado por Britto et al, 2000, a linhagem MMC foi isolada a partir de fezes humanas de um úni- co paciente HIV positivo com criptosporidiose, do Hospital das Clíni- cas da Unicamp. A manutenção desta linhagem foi realizada em camun- dongos neonatos S.P.F. (Specific Figura1: Oocistos da linhagem humana MMC de Cryptosporidium sp em esfregaço de suspensão fecal de camundongos neonatos da linhagem BALB/c/Uni. Coloração Ziehl-Neelsen. Aumento 40X Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 57 Pathogen Free), imunocompetentes isogênicos das linhagens BALB/c/Uni, C57BL/6/Uni, CBA/Uni, C.B-17/Uni e heterogênico da linhagem Swiss/Uni no período de dezembro/1999 a ju- lho/2002. A partir de novembro/2002 a fevereiro/2004, a linhagem MMC foi mantida em camundongos de 04 a 06 semanas de idade da linhagem C57BL/ 6 KO para IFN-γ. A manutenção “in vivo” do Cryptosporidium sp foi rea- lizada em ambiente controlado, no iso- lador, com manejo preconizado por Passos & Alves (1996). Os oocistos foram obtidos do intestino dos animais sacrificados no 7º dia após a infecção. Foi realizada a maceração do intesti- no em homogeneizador de Biozzi, com solução salina tamponada 0,01M pH 7.2. Em seguida foi realizada a filtração em malhas de nylon e cen- trifugação 2 a 3 vezes a 1500g, por 10 minutos a 4ºC. A camada superior do precipitado foi recolhida para de- terminação do número de oocistos (PEETERS & VILLACORTA, 1995). Foi feita a diluição da suspensão dos oo- cistos (20 µL) em solução de verde de malaquita (80 mL), contendo SDS. O nº de oocistos foi determinado em câmara de Neubauer, com microsco- pia de contraste de fase, utilizando objetiva de 40X. 2.2 Infecção de camundongos imunodeficientes com oocistos de Cryptosporidium sp Fêmeas SPF com 4 a 6 semanas de vida , provenientes do CEMIB, foram infectadas com 105 oocistos de Cryptosporidium sp por tubagem esofágica. Foram utilizados 10 animais de cada uma das seguintes linhagens imunodeficientes: - C.B-17/Uni scid; linhagem imu- nocompetente controle BALB/c/Uni - C57BL/6 KO para IFN-γ, C3H/ Uni nu, C57BL/6/Uni bg; linhagem imunocompetente controle C57BL/6/ Uni. A colônia das linhagens citadas foram monitorizadas pela Seção de Controle de Qualidade Sanitária do CEMIB, com metodologia descritas por Gilioli et al, 1996 e Gilioli et al, 2000). Os ensaios experimentais foram realizados no Departamento de Para- sitologia da UNICAMP, em unidade iso- ladora de PVC flexível tipo Trexler. Após os experimentos, os materiais retirados do isolador foram tratados antes do descarte, como padrão de biossegurança. Para a descontami- nação, os materiais de laboratório fo- ram submetidos a fervura durante 15 minutos, antes da lavagem. Os deje- tos retirados do equipamento foram enviados para inativação em equipa- mento para tratamento de resíduo de serviço de saúde mediante ondas eletromagnéticas. Foram considerados resistentes os animais que apresentaram liberação de oocistos de Cryptosporidium sp na fase aguda da doença e não apresen- taram mortalidade no período de 15 dias. 2.3 Análise morfométrica de oocistos de Cryptosporidium sp Para a análise morfométrica dos oocistos da linhagem MMC, foi utiliza- do o material obtido do intestino e fezes dos animais sacrificados no 7º dia após a infecção, conforme meto- dologia descrita (item 2.1). Foram feitos esfregaços durante as primei- sognodnumaCedsnegahniL )%(edadilatroM dicsinU/71-B.C 0 inU/c/BLAB 0 -NFIarapOK6/LB75C 04 gbinU/6/LB75C 02 uninU/H3C 04 inU/6/LB75C 0 Tabela I – Mortalidade de camundongos imunodeficientes e imunocompetentes infectados com 105 oocistos de Cryptosporidium sp. ras 28 passagens da infecção, no período de dezembro/1999 a julho/ 2000. Os esfregaços foram corados pela técnica de Ziehl-Neelsen modifi- cada (HENRIKSEN & POHLENZ, 1981). As medidas de 35 oocistos fo- ram realizadas com auxílio de ocular micrométrica, em microscópio Zeiss acoplado à câmara clara, com aumen- to de 1000X. Os resultados foram ex- pressos como índice de forma, con- forme XIAO et al, (2004). 2.4 Dinâmica da eliminação de oocistos de Cryptosporidium sp As fezes dos animais adultos in- fectados foram colhidas diariamente, durante 15 dias, individualmente e armazenadas em dicromato de potás- sio na concentração final de 2,5%, mantidas a 4ºC. Posteriormente, as amostras de fezes foram centrifuga- das a 1500 g durante 15 minutos. Em seguida, retirou-se a camada superior, para a contagem dos oocistos adicio- nando-se solução de verde de malaqui- ta a 0,16%, contendo 0,1% de SDS. O número de oocistos foi determinado em câmara de Neubauer, sob mi- croscopia de contraste de fase (PEETERS & VILLACORTA, 1995). O peso corporal individual dos camun- dongos, devidamente identificados por marcação auricular, foi registrado em balança semi-analítica, no início e ao final do experimento. 2.5 Metodologia estatística O estudo estatístico da eliminação de oocistos de Cryptosporidium sp. foi realizado mediante a comparação das médias obtidas em cada uma das amostras, referente aos 6o, 9 o, 12o e 15o dias após a infecção. Este período está associado com a mortalidade dos animais e eliminação dos oocistos nas fezes. Foi utilizado o procedimento de Análise de Variância (ANOVA) e com- parações pareadas pelo método de Tukey, com nível de confiança de 95%. As análises foram realizadas no software estatístico Minitab – Versão 13. 3. Resultados A dimensão de 35 oocistos de Cryptosporidium sp (média e desvio γ 60 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 GUES, D.M., GUARALDO, A.M.A. Parasite survey in mouse and rat colonies of Brazilian laboratory animal houses kept under diffe- rent sanitary barrier conditions. Arquivo Brasileiro de Medici- na Veterinária e Zootecnia, v.52, p.33-37, 2000. GRIFFTHS, J.K. Human Cryptosporidiosis: epidemiolo- gy, transmission, clinical disease, treatment and diagnosis. Ad- vances in Parasitology. v.40, p. 37-85, 1998. GRIFFITHS, J.K., THEODOS, C., PA- RIS, M., & TZIPORI, S. The gamma interferon gene Knockout mouse: a highly sensitive model for evaluation of therapeutic agents against Cryptosporidium parum. Journal of Clinical Microbiology. v.36, p. 2503- 2508, 1998. HARP, J.A., WANNEMUEHLER, M.W., WOODMANSEE, D.B. & MOON, H.W. Susceptibility of germ-free or antibiotic-treated adult mice to Cryptosporidium parvum. 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Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 61 Pesquisa Imagens cedidas pelo autor Cultivares e genes Entidades distintas e essenciais à agricultura Aluízio Borém Eng. Agrônomo, M.S. Ph.D., Professor da Universidade Federal de Viçosa e Presidente da Sociedade Brasileira de Melhoramento de Plantas borem@ufv.br de proteína ou se é de ciclo precoce. Os genes encontram-se na estrutura constituída de uma hélice dupla deno- minada cromossomo. Cada espécie possui um número típico de cromossomos e, o conjunto de todos os genes, distribuídos nos cromossomos, constituem o genoma do indivíduo. As células não podem produzir uma proteína pelo simples alinhamento de aminoácidos ao longo do gene (DNA), e para isso usam o RNA; os aminoácidos não se aderem ao DNA. Adicionalmen- te, o uso de um molde intermediário (RNA) na síntese protéica reduz o risco de danos ao DNA. Novamente, o dogma central da genética postula que a molécula intermediária RNAm, uma cópia do DNA, é utilizada repetida- mente para a síntese protéica,utilizando a maquinaria celular e resultando na expressão das características dos indi- víduos (Figura 01). Os genes são, portanto, a receita de cada indivíduo ser como é. Neste sentido, os genes em seu conjunto, o genoma, são a receita de cada indiví- duo. Embora um indivíduo não possa existir sem os genes, cada gene isola- damente não possui capacidade autô- noma de reprodução e não pode se multiplicar por si só. A perpetuação de um gene só é possível se ele estiver Até por volta do ano 1900 não se entendia a razão da semelhança entre pais e filhos ou entre parentes. Alguns acreditavam que o sangue era respon- sável pela semelhança entre indivídu- os aparentados. Intrigado por esta questão Gregor Mendel, em 1865, re- alizou uma série de cruzamentos entre ervilhas com diferentes tipos de grãos e cor de flor. Estudando os resultados dos seus trabalhos Mendel concluiu que uma determinada estrutura pre- sente nos órgãos reprodutivos eram responsáveis pela hereditariedade, os genes. Gene é a unidade física e funcional da hereditariedade que codi- fica uma proteína funcional ou molé- cula de RNA. Os botânicos e em geral a comunidade cientifica da época con- sideraram a argumentação de Mendel sem consistência e ele morreu sem ter seus trabalhos reconhecidos. Somente em 1900 que seus trabalhos foram descobertos, dando origem a ciência que hoje conhecemos como genética. Gene é, portanto, uma seqüência de ácidos desoxirribonucléicos (DNA), que codifica as características herdáveis dos seres vivos. Cada gene sozinho, ou em muito casos, associados a um ou mais genes determinam se uma varie- dade de milho apresenta elevado teor Pesquisa Figura 01 62 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 inserido em um indivíduo ou uma de suas partes, a exemplo das sementes ou estruturas vegetativas, como os bulbos, estolons, rizomas etc. A estru- tura mínima de reprodução de uma planta é uma célula, que no seu núcleo possui pelo menos um exemplar de cada gene da espécie. A replicação gênica ocorre dentro do núcleo da célula, com o envolvimento da enzima DNA polimerase, presente na celula (Figura 02). Para a funcionalidade do gene, ele precisa apresentar outras regiões além da região codificadora, denominada éxon. O esquema da figura abaixo ilustra um gene típico de organismos eucarióticos: animais e plantas. Nessa figura está evidenciado o promotor, que é a região do DNA que regula o local, momento e intensidade da ex- pressão do gene. A região à direita do promotor constitui a sua seqüência codificadora com seus éxons e íntrons, os quais são transcritos, ou seja, são convertidos em uma molécula de RNA durante a expressão do gene. Os íntrons funcionam com o preenchimento do loco gênico (região do DNA onde se encontra o gene), os quais, embora sejam transcritos, são eliminados no processamento do RNAm, antes de ocorrer a tradução (produção da prote- ína). Os éxons contêm a seqüência codificadora da proteína a ser sintetiza- da (Figura 03). Variedade geneticamente modifi- cada é aquela na qual foi inserido um gene isolado de um outro indivíduo, via técnicas do DNA recombinante, também conhecida como engenharia genética. O gene assim transferido, tem sido designado de transgene e possui as mesmas propriedades carac- terística dos genes, qual sejam, são essenciais para a formação do ser vivo porém não se perpetuam autonoma- mente, isto é, independentemente do indivíduo. Variedade é um grupo de plantas com características distintas, homogê- neas e estáveis, com identidade pró- pria, que a distingue das demais. Os descritores varietais que conferem iden- tidade às variedades podem ser: ciclo, cor das sementes, caracteres morfológicos, reação a doenças, pro- dução de grãos, padrões isoenzimáticos ou de ácidos nucléicos. A estabilidade da variedade é importante para sua identificação, geração após geração. O termo cultivar, que tem sido usado como sinônimo de variedade, foi cunhado a partir da contração das palavras inglesas cultivated variety (va- riedade cultivada). Há uma discussão sobre o gênero do termo cultivar. Al- guns periódicos científicos nacionais consideram-no feminino, como a Re- vista da Pesquisa Agropecuária Brasi- leira, PAB, enquanto a Revista Ceres considera-o masculino. Tipos de variedade Vários são os tipos de variedades que o melhorista desenvolve para que o agricultor possa explorar comercial- mente as plantas. Embora as varieda- des só possam ser multiplicadas se seus genes estiverem presentes na unidade de reprodução, sementes ou partes vegetativas, os genes por sua vez não podem se reproduzir isolada- mente, isto é, autonomamente. Linhas puras As linhas puras são constituídas por um grupo de indivíduos em homozigose que apresentam basica- mente a mesma constituição genética, o que as torna homozigóticas e homo- gêneas. Estatisticamente, Kempthorne (1957) definiu uma linha pura como um grupo de indivíduos homozigóticos com um coeficiente de parentesco superior ou igual a 0,87. Híbridos Os híbridos são resultantes do cru- zamento entre indivíduos genetica- mente distintos, visando à utilização prática da heterose. São heterozigóticos e homogêneos e primariamente utili- zados em espécies alógamas. Híbridos de algumas espécies autógamas, como tomate e berinjela e, de forma menos representativa, trigo e cevada, estão disponíveis em diferentes países (Carlsson e Leijon, 1986; Lehmann, 1986). Os híbridos podem ser obtidos do cruzamento de duas linhagens Figura 02 Figura 03 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 65 Figura 01 morfologia predominante de grande linfócito granular, possuem a habilidade de secretar as citoquinas INF-gama e TNF-alfa, em resposta à infecção por parasitas intracelulares e ainda respondem à indução pela IL-12. As células NK são células efetoras da resistência inata contra agentes infecciosos (Scott et al 1995). Seixas et al. (2001), compro- varam a capacidade de células den- dríticas produzirem TNF-alpha dentro de 30 minutos da exposição aos esqu- izontes de P. chabaudi chabaudi, in- dependentemente de células T ou NK. Portanto, o estágio eritrocítico deste parasita ativa células dendríticas dire- tamente, propiciando a rápida ativação de células Th1 e indução de imu- nidade. Apesar de estudos comprova- rem que as células NK e suas citocinas exercem papel importante no controle imunológico da malária, sabe-se que fatores genéticos representam um dos maiores determinantes da resistência do hospedeiro contra a malária. Estu- dos sobre o modelo P. chabaudi AS, usando análise genéti- ca, mostraram que a atividade da célula NK e a resistência a esse parasita segregam in- dependentemente (Skamene et al 1983). De acordo com Fortin et al (2002), as li- nhagens A/J, BALB/c, AKR, DBA/1, C3H/ HeJ, SJL e 129/ICR são susceptíveis ao P. cha- baudi, enquanto que as linhagens C57BL/6, B10. A, CBA, DBA/2 e C57L são resistentes ao P. chabaudi. A linhagem P. chabaudi chabaudi CR, não-letal, representa a malária ex- perimental de autocontrole, apropri- ada para estudos de imunidade em es- tágio sangüíneo (Garnica et al., 2002). Esta linhagem propicia o estudo da fase crônica da infecção em linhagens im- unodeficientes. O objetivo deste trabalho é estudar a importância das células NK no controle do P. chabaudi em ca- mundongos mediante a comparação da parasitemia, após inoculação do parasita nas linhagens de camundon- gos scid e C57BL/6 Knockout para in- terfero-gama. 2. Material e Métodos Camundongos. Quatro linhagens de camundongos machos livres de patógenos específicos (SPF), com 6 a 8 semanas de idade, provenientes do CEMIB/Unicamp foram adotadas : C.B17 scid/Uni (12 animais); BALB/c/ Uni (48 animais); C57BL/6 knockout (KO) para interferon gama (4 animais); e C57BL/6/Uni (3 animais) . Plasmodium chabaudi chabaudi CR. A linhagem de P. chabaudi cha- baudi (CR) foi cedida pelo Prof. Dr. Heitor F. Andrade Junior, do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo. Um camundongo da linhagem C57BL/6 foi a fonte de P. chabaudi. Os parasitas foram mantidos mediante passagens semanais sucessivas no camundongo BALB/c Uni por 12 semanas antes da infecção do scid e KO. Após este período um “pool” de células sangüíneas foi coletado da veia da cau- da dos animais, para o preparo do i- noculo em solução NaCl 0,15 M. A contagem destas células foi realizada em câmara de Neubauer sob mi- croscopia de contraste de fase. A manutenção do P. chabaudi chabaudi CR foi realizada mediante repiques semanais do inoculo de 107 hemácias parasitadas em camundon- gos macho BALB/c/Uni mantidos em isoladores. Amostras de esfregaços tam- bém foram coradas pelo Giemsa, para avaliação das formas de Plasmodium. Manutenção dos animais em iso- lador de PVC. Os camundongos in- fectados foram mantidos em isolador de plástico flexível (LNF – Ind. & Com. Ltda.), de pressão positiva, com 16 a 18 trocas de ar por hora, no Departa- mento de Parasitologia da UNICAMP. O material necessário para a ma- nutenção dos animais (gaiolas, tampas, ração, água, maravalha, bebedouros, pinças etc.) foi devidamente submeti- do a processos de esterilização em au- toclave, conforme normas de proce- dimentos adotados pelo CEMIB. Determinação da Parasitemia. Amostras de 20 ml de sangue foram coletadas com micropipeta da cauda do camundongo infectado. A coleta aconteceu a intervalos semanais até a 6ª semana de infecção. Após este período, os intervalos para determi- nação da parasitemia foram de 15 dias. Para a contagem de parasi- tas, o sangue foi diluí- do 1000 x em NaCl 0,15 M. As hemácias parasitadas e os para- sitas livres foram con- tados em câmara de Neubauer sob mi- croscopia de fase (Fig- ura 1). Os valores fo- ram expressos em número de hemácias parasitadas x 108/mL. Os camundongos do experimento foram in- fectados com 106 par- asitas (hemácias para- sitadas + parasitas livres) mediante injeção intraperito- neal. No decorrer do experimento foi registrada a morta-lidade dos animais. Monitoramento imunológico da linhagem C.B-17 scid/Uni. A classi- ficação dos animais homozigotos ou heterozigotos da linhagem C.B-17 scid/ Uni foi realizada pelo teste Dot-Elisa para imunoglobulinas. (Alves et al., 2002). 66 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 Mouse Antibody Production (MAP – teste). Considerando que a linhagem do Plasmodium chabaudi chabaudi (CR) foi proveniente de manutenção “in vivo” em animais com padrão san- itário desconhecido, tornou-se necessário avaliar os patógenos asso- ciados ao parasita. Desta forma, os ca- mundongos imunocompetentes foram avaliados quanto à presença de 11 antígenos de patógenos murinos (MHV-3, TMEV-GDVII, SENDAI, MVM, LCM, Ectromelia, Adenovirus, Rotavi- rus, Reovirus tipo 3, Mycoplasma pul- monis e Toxoplasma gondii). Os ca- mundongos SPF inoculados com o Plas- modium foram mantidos em isoladores por mais de 60 dias e o respectivo soro coletado para análise sorológica de patógenos murinos pelo Laboratório de Controle de Qualidade do CEMIB. Estatística. Os valores da parasitemia dos três grupos de animais (BALB/c/ Uni, C.B-17 scid/Uni, C57BL/6 KO) no intervalo das seis primeiras semanas foram submetidos a Análise de Variân- cia de Medidas Repetidas e o teste de Duncan, executados pelo progra- ma estatístico SAS (SAS Institute 1987). 3. Resultados A maior parasitemia da linha- gem C.B-17 scid aconteceu por volta da 6ª semana e uma recrudescência foi observada na 12ª semana. No con- trole correspondente, BALB/c/Uni , a maior parasitemia aconteceu na 10ª semana. A análise estatística comparati- va entre as linhagens BALB/c e scid nas primeiras 6 semanas de infecção permitiu constatar a capacidade do animal competente em controlar a parasitemia na 6ª semana (Figura 2). Os camundongos C57BL/6 KO para INF-g atingiram níveis mais ele- vados de parasitemia quando compara- dos com o seu controle C57BL/6 (Fi- gura 2) e também em relação ao mod- elo scid (Figura 2). A maior parasitemia em KO ocorreu na 10ª semana. Foi feita a comparação estatís- tica entre os valores médios de para- sitemia durante as primeiras seis sem- anas no grupo de animais C.B-17 scid, BALB/c/Uni e KO para INF-γ . Os re- sultados evidenciaram o aumento mar- cante de parasitemia em animais KO e scid, resultando em diferença signif- icativa entre a 1ª e 6ª semanas de in- fecção (Figura 2). Durante o período máximo de observação, correspondente a 23 se- manas para as linhagens KO e scid, não foi observada mortalidade em KO. Entretanto, do grupo de doze scid, quatro morreram: um, na segunda se- mana; um, na décima semana; um, na décima terceira semana; e, outro, na décima sexta. É importante ressaltar que houve mortalidade dos camundongos BALB/c/Uni (2/48), linhagem de ma- nutenção do P. chabaudi: um, na déci- ma primeira semana; e, outro, na déci- ma nona semana após infecção. Os camundongos scid são con- siderados homozigotos quando os níveis de imunoglobulina sérica forem inferiores a 5 mg/ml. O critério de seleção dos animais homozigotos scid/ scid foi adotado para seleção das ma- trizes na colônia do CEMIB/Unicamp, com o objetivo de minimizar e retar- dar a expressão do fenótipo “leaky” (capacidade de alguns camundongos scid desenvolver um limitado número de células T e B entre 3 e 9 meses de idade) (Bosma et al 1988). Todos os animais scid adotados nos experimentos apresentaram-se homozigotos. Todos os soros testados das linhagens de camundongos imuno- competentes do experimento, assim como o soro do animal infectado no Instituto de Medicina Tropical de São Paulo (fonte do P. chabaudi chabau- di linhagem CR), que foi mantido du- rante 65 semanas, revelaram-se nega- tivos para os 11 antígenos de pató- genos murinos avaliados (MHV-3, TMEV-GDVII, SENDAI, MVM, LCM, Ec- tromelia, Adenovirus, Rotavirus, Reovi- rus tipo 3, Mycoplasma pulmonis e Toxoplasma gondii). 4. Discussão O ambiente controlado – isola- dores – onde são mantidos os animais SPF (Specific Pathogen Free) permi- tiu o controle dos fatores externos evitando riscos de contaminação dos animais experimentais, o que poderia influenciar e comprometer os resulta- dos da pesquisa. Em se tratando de camundongos da linhagem C.B-17 scid, o fato de a colônia ser mantida em condições ambiente e sanitária contro- ladas colabora para o nível baixo de animais com o fenótipo “leaky”. Os últimos levantamentos sorológicos detectaram o fenótipo “leaky” em 9% da colônia com idade de 40 semanas (Alves et al 2002). Camundongos scid são desprovidos de resposta imune dependentes de linfócitos T e B. Des- ta maneira, são muito susceptíveis a patógenos oportunistas que podem ser bactérias: (Proteus mirabilis, Strep- tococcus viridans e Escherichia coli) e vírus (vírus da hepatite murina (MHV), vírus Sendai e vírus respiratório Figura 2 - Média e erro padrão dos valores de parasitemia em camundongos C.B- 17 SCID, BALB/c/Uni, C57BL/6 KO para interferon gama durante 6 semanas de infecção com Plasmodium chabaudi chabaudi (CR) e durante as semanas 1, 2, 3 e 4 nos camundongos C57BL/6/Uni. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 67 murino), e ainda o Pneumocystis car- inii. (Percy & Barta 1993). Um exemplo de co-infecção com P. chabaudi e a respectiva inter- ferência no desempenho de resposta imune foi estudado por Yoshida et al (2000) onde constataram que camun- dongos A/J susceptíveis à malária, in- fectados com P. chabaudi e coinfecta- dos com Schistosoma mansoni desen- volveram resistência ao Plasmodium. Os resultados desse estudo mostraram que, apesar de o S. mansoni na fase de oviposição, induzir resposta Th2, dentro de certas circunstâncias, a coin- fecção Schistosoma/Plasmodium pro- moveu resposta imune tipo Th1 no camundongo A/J, tornando-o resistente ao Plasmodium. Células tipo Th1 são respon- sáveis por mediar o controle da para- sitemia aguda através da ativação de mecanismos imune mediados por cé- lula, enquanto que as células tipo Th2 mediam o crescimento e diferenciação de células B para controlar a infecção através de mecanismos dependentes de anticorpos (Yap et al 1994). Skamene et al (1983) de- screveram a inexistência de relação entre resistência na infecção com Plas- modium chabaudi e atividade de cé- lulas NK. Em seu experimento mos- traram que camundongo C57BL/6 bg/ bg deficiente de célula NK obteve a resolução da infecção por P. chabau- di da mesma forma que o seu camun- dongo parental +/+. Kitaguchi et al (1996) injetaram células NK de camundongo C57BL/6 infectado com P. chabaudi em outro camundongo que também seria infectado. Essa transferência não conferiu proteção, pois o curso desta infecção foi similar ao do camundongo controle. Entretanto, tratamento de camundongos com anticorpos monoclonais anti-NK resultou no aumento da morta- lidade. Concluíram, então, que células NK podem não impedir o aumento da parasitemia, mas elas podem exibir um papel importante na recuperação da para- sitemia, provavelmente por secretar INF-γ, e conseqüentemente diminuir a mortalidade em infecções por P. chabaudi. O tratamento de camundongo susceptível A/J com IL-12 murina reduziu muito a parasitemia e melhorou a sobrevida do hospedeiro. Essa proteção induzida por IL-12 é mediada por INFγ- e TNF-α secretados por células NK durante infecção inicial (Stevenson et al 1995; Mohan et al 1997). Além disso, foi observado que em camundongos deficientes de re- ceptor para INF-γ (Balmer et al 2000; Favre et al 1997) e camundongo KO para INF-γ (Su & Stevenson 2000), infectados com P. chabaudi AS, ocorreu incapacidade para reduzir a parasitemia primária e alta mortalidade. Batchelder et al 2003, comprovaram também em seus estudos, a importância que o INF-γ exerce na imunidade celular contra P. chabaudi adami. Camundongos KO para IL-12 (gene p 40) infectados com P. chabaudi AS, tiveram os níveis de INF- g diminuídos bem como IgG2a e IgG3 Th1-dependente. Com esses resultados concluiu-se que a citocina IL-12 produzida na fase inicial do estágio sangüíneo da infecção por P. chabaudi AS é importante para indução de resposta imune INF-γ-dependente tipo Th1 responsável pelo controle da fase aguda da infecção e sobrevivência do hospedeiro, influenciando fortemente a imunidade tipo Th2 mediada por anticorpo necessária para resolução da fase crônica (Su & Stevenson, 2002; Bastos et al, 2002). Os resultados obtidos em animais KO para INF-γ corroboram os de Su & Stevenson (2000) no que se refere à incapacidade de reduzir a para- sitemia. Por se tratar de linhagem distinta de P. chabaudi, a mortalidade observada em nossos animais KO foi zero. Não foi possível observar o clear- ance do parasita. Os modelos animais utilizados em nosso trabalho, scid, KO para IFN- γ e BALB/c são considerados geneticamente susceptíveis por Fortin et al (2002). A linhagem scid, cuja única fonte de resposta imune é a célula NK, revelou-se extremamente suceptível ao P. chabaudi CR, com 25% de morte em 12 animais. Em C57BL/6 não se observou a parasitemia além das quatro semanas porque trata-se de linhagem resistente ao Plasmodium. As células NK sozinhas não con- trolam a parasitemia. Entretanto, em camundongos C57BL/6 KO para INF- γ, os picos parasitêmicos foram muito altos, levando à conclusão de que, as células NK, provavelmente devido à produção de inrterferon gama, contri- buem para a redução da parasitemia. Estudos (Prakash et al, 2003) demonstram correlação entre falência renal aguda e casos de malária severa por P. falciparum (79,6%), o que con- duz à necessidade de avaliar a ocor- rência de lesões histopatológicas renais provocadas por P. chabaudi CR em camundongos, o que possivelmente contribuiria para com a mortalidade desses animais. 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K.; LIEBERG, H.; MAN- NING, D. D.; PEPPER, B. J.; YANEZ, D. M.; van der HEYDE, H.; WEIDANZ, W. P. Plasmodium chabaudi adami: inteferon-gamma 70 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 para análise de micotoxinas (Syde- nham et al., 1996a,b), requer instru- mentação de alto custo, pessoal alta- mente treinado, uma pré-limpeza ex- tensiva da amostra, tornando cada aná- lise muito demorada. Nos últimos anos, ocorreu um grande avanço no uso de imunoensai- os na análise de micotoxinas devido à especificidade, sensibilidade e simpli- cidade aliadas à rapidez e a possibili- dade de análise de um grande número de amostras simultaneamente (Hefle, 1995). Em seguida serão descritos os princípios básicos de imunoensaios e alguns dos desenvolvimentos mais re- centes na aplicação de técnicas imu- noquímicas para a determinação de micotoxinas (aflatoxinas e fumonisi- nas). Conceitos básicos Os imunoensaios são procedi- mentos analíticos baseados na ligação não covalente entre antígeno e anti- corpo, e podem ser desenvolvidos para detectar o antígeno ou o anticor- po. Os imunoensaios utilizados na área de alimentos são baseados na pesqui- sa de antígenos. Os imunoensaios podem ser rea- lizados com anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais e anticorpos recombinantes. Anticorpos policlonais Os anticorpos policlonais são ob- tidos pela imunização de um animal (coelho, carneiro, cabra, cavalo) e pu- rificados posteriormente a partir do soro imune. A estimulação de linfócitos B in- duz a produção de anticorpos. Cada clone de linfócito produz anticorpo de uma determinada especificidade, por- tanto a estimulação de muitos linfóci- tos do organismo determina a produ- ção de muitos anticorpos diferentes, com diferentes especificidades e afini- dades. O soro obtido de um animal imunizado contém anticorpos produ- zidos por diferentes clones de linfóci- tos B e, portanto, é denominado anti- corpo policlonal (Abbas, 2000). Os anticorpos policlonais são relativamente fáceis de produzir e apresentam alta afinidade, porém po- dem apresentar reações cruzadas. Anticorpos monoclonais Os anticorpos monoclonais são produzidos por hibridomas, que são obtidos pela fusão de linfócito B com célula tumoral (mieloma). O hibrido- ma tem a capacidade de proliferar, produzindo anticorpos monoclonais em grandes quantidades (Abbas, 2000). Os anticorpos monoclonais ofe- recem vantagens como afinidade e especificidade de ligação, homoge- neidade e capacidade de serem pro- duzidos em quantidades ilimitadas (Deshpande, 1996). Anticorpos recombinantes Recentemente, foi desenvolvi- do um novo método de produção de anticorpos com grande potencial. O método é baseado em técnicas de biologia molecular e consiste no isola- mento e recombinação dos genes que codificam a região variável dos anti- corpos (Lee & Morgan, 1993). Esta técnica apresenta vantagens como baixo custo e possibilidade de mani- pulação do DNA que codifica para o anticorpo a fim de melhorar caracterís- ticas como afinidade e especificidade (Yau et al., 2003). Princípios de imunoensaio Inicialmente o radioimunoensaio foi o método mais utilizado para quan- tificação de micotoxinas, porém, devi- do a problemas relacionados à mani- pulação de material radioativo e o reduzido tempo de prateleira dos rea- gentes foi substituído pelos ensaios imunoenzimáticos (Pestka et al., 1995). Imunoensaios que utilizam antí- geno ou anticorpo marcado com uma enzima são denominados ensaios imu- noenzimáticos, entre os quais o mais empregado é o método de ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent As- say). O ensaio imunoenzimático é um método em que a reação antígeno- anticorpo é monitorada pela medida da atividade enzimática, utilizando a conversão de um substrato (cromogê- nico, fluorescente ou quimiolumines- cente) por um antígeno ou anticorpo marcado com a enzima como meio de detecção/quantificação do analito (Gazzaz et al., 1992). Os imunoensai- os apresentam alta sensibilidade, es- pecificidade e facilidade na execução e permitem a quantificação do analito em níveis de ng ou pg. A enzima utilizada no ELISA deve apresentar alta atividade específica e o produto da reação enzimática deve ser estável, de fácil quantificação, fa- cilmente conjugada a vários antíge- nos, anticorpos e haptenos, sem perda da atividade e ter custo acessível (San- chez, 1998). Várias enzimas podem ser utiliza- das no ELISA, como peroxidase, fosfa- tase alcalina, β-galactosidase, entre ou- tras (Gazzaz et al., 1992). Tipos de ELISA Atualmente, os tipos de ELISA mais empregados para análise de subs- tâncias biologicamente ativas, como Figura 2. Grãos de milho de boa qualidade (a) e de baixa qualidade (b) Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 71 as micotoxinas, são ELISA competitivo direto e ELISA competitivo indireto. ELISA competitivo direto (dc-ELISA) No dc-ELISA, as microplacas são sensibilizadas com anticorpo específi- co para a micotoxina, incubadas com o conjugado micotoxina-enzima, na pre- sença da amostra em que se deseja pesquisar a micotoxina (Figura 3). Após a obtenção do equilíbrio da reação antígeno-anticorpo é adicionado o subs- trato da enzima. Há uma relação inver- samente proporcional entre a concen- tração de micotoxina na amostra e a intensidade da cor desenvolvida (San- chez, 1998). O dc-ELISA é um método fácil e rápido para detecção de micotoxinas, visto que a amostra e o conjugado (micotoxina conjugada à enzima) po- dem ser adicionados ao mesmo tem- po (Gazzaz et al, 1992). ELISA competitivo indireto (ic-ELISA) No ic-ELISA o anticorpo específi- co (anticorpo primário) para a micoto- xina é incubado com a amostra em uma microplaca sensibilizada com a micotoxina (Figura 4). Quanto maior a concentração de micotoxina na amos- tra, menos anticorpo livre estará dis- ponível para ligar-se à micotoxina fi- xada à microplaca. A quantidade de anticorpo primário ligado à placa pode ser estimada pela incubação com anti- corpo secundário marcado com enzi- ma, específico para o anticorpo primá- rio, seguida de adição do substrato. A concentração de micotoxina na amos- tra é inversamente proporcional à in- tensidade da cor desenvolvida (Hefle, 1995). Aplicação de técnicas imunoquímicas Diversos métodos imunoquími- cos têm sido aplicados na detecção de micotoxinas, incluindo ELISA, colunas de imunoafinidade, métodos que em- pregam membranas, imunofiltração e biosensores (Tabela 1). As técnicas de ELISA são ampla- mente utilizadas na análise de lotes de amostras e podem fornecer resultados qualitativos baseados no desenvolvi- mento de cor pela reação enzimática com um substrato cromogênico, ou semiquantitativo/quantitativo pela de- terminação espectrofotométrica. A principal desvantagem do ELISA resul- ta das interações inespecíficas de com- ponentes alimentares (proteínas, áci- dos graxos) com o anticorpo, que podem causar reações falso-positivas ou superestimação da concentração de micotoxinas (Hefle, 1995; Barna- Vetró et al., 1996). As interferências podem ser minimizadas pela diluição das amostras antes do ensaio, ou pela inclusão de uma etapa de pré-limpeza (Pestka et al., 1994; Barna-Vetro et al., 1996; Ono et al., 2000). Recentemente a “Association of Official Analytical Chemists” (AOAC) validou diversos métodos analíticos baseados na pré-limpeza do extrato alimentar por coluna de imunoafinida- de antes da análise por CLAE (Burdas- pal et al., 2001; Dragacci et al., 2001; Entwisle et al., 2001; Visconti et al., 2001). A utilização de cromatografia em camada delgada (CCD) associada a colunas de imunoafinidade é um procedimento promissor com desem- penho comparável à CLAE (Stroka & Anklam, 2002), principalmente se a CCD de alta performance for utilizada (Valenta, 1998). A desvantagem em relação ao elevado custo das colunas de afinidade comerciais tende a ser minimizada pelo processo de regene- ração da coluna (Scott & Trucksess, 1997; Fazekas & Tar, 2001; Watanabe et al., 2001; Kondo et al., 2002). Os limites regulatórios cada vez mais rigorosos sobre os níveis de con- taminação de micotoxinas por países importadores de grãos aumentaram a demanda por métodos rápidos e con- fiáveis para condições de campo. Di- versos métodos que empregam mem- branas (“dip-sticks”, tiras imunocro- matográficas, dispositivos de fluxo) foram desenvolvidos para aplicação no campo (De Saeger & Van Pete- ghem, 1996; Sibanda et al., 2000; Ho & Wauchope, 2002). Entretanto, ge- ralmente esses métodos apresentam baixa sensibilidade e são inadequados para a análise de grande número de amostras. Ultimamente, houve um progresso expressivo em bio-senso- res tais como “surface plasmon reso- nance” (SPR), sondas de fibra óptica e ensaios baseados em micropartículas (Carlson et al., 2000; Daly et al., 2000; Maragos, 2002; Nasir & Jolley, 2002), mas apenas uma amostra pode ser avaliada de cada vez. As principais limitações desses métodos consistem na baixa reutilização da imunosuperfí- cie e elevado consumo de reagentes (Gonzalez-Martinez et al., 1999). Aflatoxinas As aflatoxinas, compostos hete- rocíclicos consistindo de diidrofurano ou tetraidrofurano ligado a uma cuma- rina substituída (Figura 5), são produ- zidas por Aspergillus flavus e A. para- siticus (Stoloff, 1976). Os principais membros deste grupo de micotoxinas consistem de quatro toxinas que ocor- rem naturalmente, AFB 1 , AFB 2 , AFG 1 e AFG 2 , juntamente com seus produtos metabólicos (AFM 1 , AFM 2 , AFP 1 , AFQ 1 e aflatoxicol) produzidos pelos siste- mas metabólicos microbianos e ani- mais (Bradburn et al., 1993). As aflatoxinas são encontradas como contaminantes de milho, aveia, cevada, amendoim e outras nozes, Figura 3. ELISA competitivo direto (dc-ELISA) 72 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 especialmente em regiões tropicais e subtropicais, onde as condições de temperatura e umidade são ótimas para o crescimento do fungo e para a produção da toxina (Rustom, 1997). As aflatoxinas provocam sinto- mas tóxicos agudos em várias espéci- es de animais, e o fígado é o alvo principal (Wogan, 1969). A AFB 1 apre- senta atividade teratogênica, mutagê- nica e hepatocarcinogênica, por meio da ativação metabólica para a forma epóxido, que pode se ligar covalente- mente ao DNA. Devido à associação com o câncer hepático primário foi classificada pela “International Agen- cy for Research on Câncer” (IARC) como carcinógeno do grupo 1 (IARC, 2002). Dentre as micotoxinas para as quais os limites le- gais de contaminação já fo- ram estabelecidos, as aflatoxinas são as mais am- plamente reguladas. A “Food and Agriculture Organization” (FAO, 1997) relatou 77 países onde exis- te alguma forma de contro- le para aflatoxinas. Em pa- íses onde o regulamento especifica apenas o nível de AFB 1 , os níveis permiti- dos se encontram numa fai- xa de zero detectável a 50 µg/kg , sendo que a maioria é de 5 µg/kg. Além dos níveis de AFB 1 , alguns países regulam os níveis de aflatoxinas totais dentro da mesma faixa de concentração. A aflatoxina M 1 é um derivado hidroxilado da AFB 1 , sendo produzida e excretada no leite de animais que consomem ração contaminada com AFB 1 . A preocupação existente acerca da AFM 1 advém de sua semelhança estrutural com a AFB 1 e também do fato das crianças estarem entre os maiores consumidores de leite (Grem- mels, 1999). A AFM 1 foi classificada como carcinógeno do grupo 2B (pos- sivelmente carcinogênico para seres humanos) (IARC, 2002). Anticorpos policlonais e mono- clonais para aflatoxinas foram desen- volvidos para utilização em ic-ELISA e dc-ELISA (Morgan et al., 1983; Chu et al., 1987; Kawamura et al., 1988; Li et al., 1994; Aldao et al., 1995, Devi et al., 1999; Thirumala-Devi et al., 2002; Lipigorngoson et al., 2003). Lipigorngoson et al. (2003) de- senvolveram um dc-ELISA baseado em anticorpos monoclonais para detecção de AFB 1 com um limite de detecção de 4 µg/kg, recuperação de 88,1% a 99,5%. Os coeficientes de correlação com kit de ELISA comercial e CCD foram 0,912 e 0,802 para milho, 0,941 e 0,832 para amendoim, respectivamente (p<0,05). A triagem de contaminação de milho e amendo- im tailandês empregando esse ensaio demonstrou níveis médios de AFB 1 (por cento positivos) de 73 µg/kg (85,7%) em milho e 102 µg/kg (67,9%) em amendoim. Ono et al. (2001) analisaram 150 amostras de milho das regiões Centro- Sul, Centro-Oeste e Norte do Estado do Paraná, utilizando ic-ELISA baseado em anticorpos policlonais (C-Kure, CENSA) para triagem qualitativa de AFB 1 , seguida da determinação quan- titativa por dc-ELISA baseado em anti- corpos policlonais (Veratox, Neogen). As amostras positivas para aflatoxinas variavam de 38-460 ng/g, com uma concentração média de 191 ng/g. Apenas 17 das 86 amostras da região Centro-Oeste estavam contaminadas com AFB 1. As amostras das regiões Norte e Centro-Sul não apresentaram contaminação. Amostras de pasta de gergelim contaminadas artificialmente com afla- toxinas em níveis de 6,5, 13,0, e 19,5 µg/kg foram analisadas por CLAE, flu- orimetria e ELISA. A pré-limpeza das amostras foi realizada por colunas de imunoafinidade antes da análise por CLAE e fluorimetria. A correlação entre fluorimetria e CLAE foi de 0,978, e ambos os métodos apresentaram ele- vada percentagem de recuperação e pequena variabilidade, enquanto o ELI- SA seria aplicável apenas como um método de triagem (Nilüfer & Boya- cýoglu, 2002). Gathumbi et al. (2003) desenvol- veram um método sensível para de- tecção rápida de AFB 1 em fígado de galinhas, e avaliaram a eficácia da cromatografia de imunoafinidade (IAC) antes da análise por dc-ELISA. O limite de detecção variou de 15 a 17 pg/mL, com recu- peração de AFB 1 de 54,3% a 65,5% em teci- dos artificialmente conta- minados com 1 a 5 ng/g, respectivamente. A sen- sibilidade e especificida- de em amostras artificial- mente contaminadas (1 ng/g AFB 1 ) foram 100% para amostras submetidas à IAC e, 91,7% e 100%, respectivamente, para amostras não submetidas à IAC. Pal & Dhar (2004) desenvolveram um dis- positivo analítico simples para a reali- zação de um ensaio de imunofiltração para detecção de baixas concentra- ções de AFB 1 em alimentos. O dispo- sitivo consistia de tiras de membrana, contendo zonas de anticorpos imobili- zados em um cartão de polietileno. O método era baseado na amplificação do sinal envolvendo tiramina biotinila- da e conjugado avidina-peroxidase, utilizando 4-cloro-1-naftol como subs- trato. A quantificação foi determinada por densitometria (limite de detecção de 0,01 ng/mL), com recuperação média a partir de diferentes alimentos entre 91% e 104%, e alta correlação com CLAE (r2 = 0,99) em amostras de milho e amendoim artificialmente con- taminadas. Um lote de 12 amostras foi analisado em um único cartão em 12 minutos. Uma membrana de nitrocelulose montada sobre uma tira de plástico foi Figura 4. ELISA competitivo in- direto (ic-ELISA) Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 75 clonais para fumonisinas foram produ- zidos para aplicação em dc-ELISA e ic- ELISA (Azcona-Olivera et al. 1992a, b; Usleber et al., 1994; Iijima et al., 1996; Yeung et al., 1996; Yu & Chu, 1996; Barna-Vetró et al., 2000; Christensen et al., 2000). Um dc-ELISA baseado em anti- corpos monoclonais desenvolvido para detecção de FB 1 em cereais (Barna- Vetró et al., 2000) apresentou um limite de detecção de 7,6 ng/g FB 1 e uma reatividade cruzada média de 100%, 91,8%, e 209% para FB 1 , FB 2 , e FB 3 , respectivamente. A recuperação da toxina a partir de cereais artificial- mente contaminados em níveis de 50- 200 ng/g FB 1 variou de 61% a 84%. Kulisek & Hazebroek (2000) de- senvolveram um cd-ELISA empregan- do anticorpos policlonais para a tria- gem rápida de contaminação por FB 1 . Esse ensaio foi aplicado num estudo comparativo para determinar a efici- ência de extração de FB 1 em água deionizada, tampão fosfato salina (PBS), PBS-Tween e em solventes orgânicos (70% metanol, 50% acetonitrila) utili- zando 16 amostras de milho. O tam- pão fosfato mostrou-se adequado para a extração de FB 1 . As determinações realizadas por ELISA apresentaram boa correlação (r = 0,94) com CLAE em amostras artificialmente contaminadas entre 1 e 50 mg/mL de extrato. Desjardins et al. (2000) avaliaram a ocorrência de fumonisinas em milho nepalense por dc-ELISA baseado em anticorpos monoclonais e os níveis de fumonisinas foram >1 µg/g em 22% de 74 amostras. O limite de detecção do método foi de 1 µg/g. Danielsen & Funck Jensen (1998) avaliaram 35 amostras de milho pro- veniente de três regiões geográficas de Costa Rica, e detectaram fumonisinas em níveis de 4 a 16.000 ng/g, com uma média de 2500 ng/g, utilizando um cd-ELISA comercial ba- seado em anticorpos monoclonais (Ridascreen Fumonisin Fast, R- Biopharm). Os anticorpos apresenta- ram reatividade cruzada com FB 2 (40%) e FB 3 (100%), resultando em uma superestimação média de <20% para as leituras de FB 1 . A recuperação desse ensaio foi de 60% e o limite de detecção de 3,4 ng/g. Diversos estudos comparativos de ELISAs competitivos com métodos químicos (CLAE, GC-MS) foram reali- zados, alguns apresentando boa corre- lação, embora o ELISA possa apresen- tar valores superestimados em deter- minados casos (Pestka et al., 1994; Sydenham et al., 1996a, b; Usleber et al., 1994; Iijima et al., 1996; Sutikno et al., 1996; Yu & Chu, 1996; Scott et al., 1997; Ono et al., 2000; Kim et al., 2002). A performance de um ic-ELISA baseado em anticorpos monoclonais para detecção de fumonisinas foi ava- liada em 150 amostras de milho re- cém-colhido (safras 1995 e 1996) de 3 regiões do Estado do Paraná (Ono et al., 2000, 2001). Fumonisinas foram detectadas em 147 (98%) amostras numa faixa de concentração de 0,096 a 22,6 µg/g. O ensaio apresentou um limite de detecção de 93 ng/g e coe- ficiente correlação de 0,94 com a CLAE. Kim et al. (2002) avaliaram a ocorrência de FB 1 em 76 amostras de derivados de milho (Seoul, Coréia) empregando dc-ELISA e CLAE. A recu- peração média a partir de amostras de sucrilho artificialmente contaminadas em concentrações de 5-1000 ng/g FB 1 foram 104% por dc-ELISA (limite de detecção de 5 ng/g) e 82% por CLAE (limite de detecção de 20 ng/g), com boa correlação (r2 = 0,992). Um estudo colaborativo envol- vendo 13 laboratórios no Estados Uni- dos foi realizado empregando dc-ELI- SA para determinação de fumonisinas totais (B 1 , B 2 , e B 3 ) em amostras de milho naturalmente contaminadas em três níveis e contaminadas artificial- mente com 1,0, 3,0, e 5,0 mg/kg. A recuperação média de fumonisinas totais foi 120%, 100% e 90%, respec- tivamente, apresentando precisão in- tra e interlaboratorial aceitável (Bird et al., 2002). Um novo sistema de imunoen- saio com lipossoma por injeção de fluxo denominado FILIA (“Flow-injec- tion liposome immunoanalysis”) foi desenvolvido para a determinação quantitativa de FB 1 . Este método utili- za lipossomas produzidos com FB 1 encapsulada com sulforodamina B, um corante. Esses lipossomas competem com a FB 1 presente na amostra por um número limitado de anticorpos imobilizados em uma coluna via pro- teína A. A quantidade de lipossomas ligados aos anticorpos é inversamente proporcional à concentração de FB 1 livre presente na amostra injetada. O limite de detecção do FILIA é de 0,1ng de FB 1 por 100 µL de amostra (Ho & Durst, 2000). Um estudo comparativo desse método com a CLAE apresentou um coeficiente de correlação de 0,945, indicando que o desempenho dos métodos são similares para a detecção de fumonisinas em milho, ração e outros alimentos. As principais vanta- gens do FILIA consistem em baixo limite de detecção, menor complexi- dade de execução e facilidade no preparo da amostra (Ho & Durst, 2003). Maragos et al. (2001) desenvol- veram um ensaio rápido baseado na polarização de fluorescência, onde ocorre competição entre fumonisina não marcada com fumonisina marcada fluorescentemente (FB 1 -FL) pelo anti- corpo monoclonal específico. A pola- rização de fluorescência da fumonisina marcada aumenta pela ligação com o anticorpo, portanto quando a toxina livre estiver presente, menos FB 1 -FL será ligada, diminuindo o sinal da po- larização. Este ensaio requer <2 min por amostra, apresentando um limite de detecção de 0,5 µg de FB 1 /g em milho contaminado artificialmente e uma recuperação média de 94,3 ± 13,8% na faixa de 0,5-20 µg/g. A correlação com a CLAE foi de 0,85- 0,88 (Maragos et al., 2001). Castelo et al. (1998) determi- naram as concentrações de fumonisi- nas em produtos derivados de milho, utilizando o dc-ELISA para fumonisinas totais (Veratox, Neogen) e a CLAE para FB 1 . O limite de detecção para a CLAE foi de 75 ng de FB 1 /g, enquanto que para o ELISA, o limite de detecção foi de 200 ng de fumonisina/g de alimento. A maioria das amostras apre- sentou concentrações maiores de fu- monisinas quando analisadas por ELI- SA em relação à CLAE, sendo que estas diferenças podem ser ocasionadas pela presença de outras formas de fumoni- sinas reconhecidas por ELISA e não determinadas por CLAE e também pela presença de compostos adicio- nais, como precursores de fumonisi- nas ou metabólitos estruturalmente relacionados que reagem com os anti- corpos do ELISA. 76 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 Torres et al. (1998) avaliaram a ocorrência de fumonisinas em 32 amos- tras de cerveja da Espanha, empre- gando cd-ELISA (Ridascreen, R-Bio- pharm). O limite de detecção do kit foi de 3 ng de fumonisinas/mL de cerveja. Das 32 amostras analisadas, 14 (43,8%) estavam contaminadas por fumonisi- nas com concentrações variando de 4,76 ng/mL a 85,53 ng/mL. Outra variante de métodos imu- noquímicos consiste na detecção de fumonisinas por imunosensor de “sur- face plasmon ressonance” (SPR). Neste método, anticorpos policlonais de alta afinidade específicos para FB 1 são imobilizados em uma película de ouro, que é acoplada a um prisma de vidro. Um raio de luz é focalizado através do prisma para excitar a SPR na película de ouro. Quando uma amostra conten- do FB 1 é adicionada a uma célula na parte externa da película de ouro, o perfil angular da intensidade da luz refletida é alterado, provocando mu- dança no ângulo de ressonância que é proporcional à concentração de FB 1 . O limite de detecção deste método é de 50 ng/mL com um tempo de análise inferior a 10 minutos (Mullett et al., 1998). Os trabalhos relatados demons- traram que as técnicas imunoquímicas preenchem os requisitos de rapidez e eficiência na triagem de micotoxinas, devendo-se concentrar os esforços na redução da reatividade cruzada. Considerações finais A ocorrência de micotoxinas como contaminantes alimentares, bem como o impacto desses compostos na saúde humana e animal, resultaram no desenvolvimento e no aperfeiçoamen- to de vários métodos de imunodetec- ção para monitorar os níveis de conta- minação em alimentos. Atualmente existem kits de ELISA para análise das principais micotoxinas, porém as rea- ções falso-positivas dificultam ainda, a sua utilização como alternativa aos métodos reconhecidos pela AOAC, sendo necessária a confirmação por métodos químicos como a CLAE. As colunas de imunoafinidade proporcio- nam especificidade e eficiência como técnica de pré-limpeza e concentra- ção antes da análise por CLAE e têm sido amplamente utilizadas na deter- minação de micotoxinas. Recente- mente foram desenvolvidos métodos rápidos baseados em biosensores, “sur- face plasmon resonance”, “dipstick”, imuno-análise baseada em lipossoma, que podem ser utilizados na análise rápida de um grande número de amos- tras. Os imunoensaios desempenha- rão um papel cada vez mais importan- te na análise de alimentos, principal- mente de micotoxinas, pois disponibi- lizam uma gama de métodos que podem ser utilizados tanto nos labora- tórios como ensaios quantitativos, como no campo, para a triagem. Consideran- do que os kits, bem como grande parte dos insumos para realização de imunoensaios são importados, elevan- do os custos, é de extrema importân- cia alcançar a auto-suficiência na pro- dução e desenvolvimentos de kits e reagentes imunológicos. Agradecimentos Os autores agradecem o apoio financeiro recebido pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientí- fico e Tecnológico (CNPq) e Funda- ção Araucária. Referências bibliográficas Abbas A.K., Lichtman A.H., Pober, J.S. (2000) Cellular an Molecular Immunology. W.B. Saunders Company, Philadelphia. Aldao M.A.J., Carpinella M.C., Corelli M., Herrero G.G. (1995). 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Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 81 Produção de fator FVIII por engenharia genética Imagem cedida pelos autores Produção de fator FVIII da coagulação por tecnologia do DNA recombinante Virginia Proenca Picanco Doutoranda em Ciencias Biomédicas-FMRP- USP e participante do programa de doutorado sanduiche DAAD/Cnpq com a Universidade de Frankfurt v.picanco@pegasus.fmrp.usp.br Prof. Dr Dimas Tadeu Covas Faculdade de Medicina de Ribeirao Preto Hemocentro de Ribeirao Preto dimas@fmrp.usp.br Dr. Sven Becker Institute for Transfusion Medicine and Immunohematology Red Cross Blood Bonor Service Baden- Wuerttemberg / Hessen Frankfurt am Main Alemanha sbecker@bsdhessen.de Dr. Torsten Tonn Institute for Transfusion Medicine and Immunohematology Red Cross Blood Bonor Service - Baden-Wuerttemberg / Hessen Frankfurt am Main Alemanha ttonn@bsbhessen.de Hemofilia A no Brasil hemofilia é uma doença hemorrágica hereditária resultante da deficiência de uma das várias proteí- nas do sangue envolvidas no proces- so de coagulação. Cerca de 350.000 pessoas em todo o mundo sofrem de hemofilia A em que o fator VIII não é produzido, não funciona ou existe em quantidades reduzidas. No Brasil, estima-se que exis- tam cerca de 7000 hemofílicos que são tratados, na sua maioria, com con- centrados de fator VIII obtidos a partir do plasma humano. Este tipo de trata- mento é caro e muitas vezes não dis- ponível na quantidade necessária. No mercado brasileiro cada unidade inter- nacional (UI) de fator VIII é comer- cializada ao preço médio de US $ 0,50. A dispensação anual média por hemofílico é de 30.000 UI, aproxima- damente US $ 15.000,00/ paciente/ ano, totalizando cerca de 100 milhões de dólares por ano. O tratamento atu- al para a hemophilia A é baseado na infusão intravenosa de concentrados de FVIII, profilaticamente ou na ocor- rência de um sangramento. Os pro- blemas com estes concentrados, inclu- indo o alto custo, a inconveniência, e o risco da transmissão de doenças vi- rais, tais como, hepatitis e HIV, aumen- taram o interesse em expressar este fator em sistemas celulares in vitro ou in vivo. Gene do fator VIII O gene do fator VIII foi clona- do e caracterizado em 1984. Seu lo- cus situa-se na região 28 do braço lon- go do cromossomo X (Xq28). É constituído por 26 exons cujo taman- ho varia entre 69 e 3106 pb e 25 ín- trons que podem atingir o tamanho de 32,4 kb, pertencendo a um dos maiores genes humano (0,1% do cro- mossomo X) 1-3. Estrutura e função A proteína deduzida da se- qüência de nucleotídeos do cDNA contém 2351 aminoácidos. A análise da estrutura primária mostrou a orga- nização em domínios: A1- a1- A2- a2- B- a3- A3- C1- C2 , sendo a cadeia pesada constituída pelos domínios A1- a1-A2-a2-B e a cadeia leve pelos domínios a3-A3-C1-C2. O fator VIII é uma glicoproteí- na que ativa o fator X no processo da coagulação sangüínea. É sintetizada como um polipeptídeo de cadeia úni- ca de cerca de 330 kDa e é clivada, gerando a cadeia pesada de 210 kDa e a cadeia leve de 80 kDa que se as- sociam por interaçoes eletrostáticas e hidrofóbicas. O domínio B, o maior domínio, não participa da atividade coagulante da proteína e sua função ainda permanece desconhecida.4 Expressão do fator VIII em sistemas in vitro Vários experimentos testaram a transfecção do gene do fator VIII, na sua forma inteira ou sem o domin- io B, em sistemas celulares, seguida da avaliação de sua atividade fun- cional. Os estudos iniciais mostraram níveis muito baixos de expressão em todas as linhagens celulares estudadas.2, 4-7 Em princípio, três seriam os fatores limitantes para a obtenção de Pesquisa 82 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 níveis elevados de expressão da pro- teína do fator VIII: 1) o tamanho do gene; 2) o seu baixo nível de ex- pressão de mRNA; e, 3) a secreção ineficiente do produto deste gene. É conveniente destacar que, apesar de mais elevados, os níveis de expressão obtidos com o fator VIII são muito baixos quando comparados aos obtidos para diversas outras proteínas. Informações adicionais sobre as mo- dificações pós-traducionais e o meca- nismo de secreção do fator VIII tor- nam-se primordiais para maior enten- dimento deste aspecto. Terapia gênica para hemofilia A A hemofilia A é uma doença que se presta para a terapia gênica, uma vez que se sabe muito sobre a sua transmissão, sobre a localização do gene defeituoso e sobre a estrutu- ra e função do fator produzido por este gene. É de se salientar que a concen- tração sanguínea de fator VIII obtida não é crítica, sendo que um pequeno aumento da concentração plasmática de FVIII pode converter um quadro de hemofilia grave em hemofilia mo- derada. O desenvolvimento da tera- pia gênica para a hemofilia A tem sido extensivamente explorado, utilizando estratégias com vetores adenovirais e retrovirais ex vivo e in vivo. Na tera- pia ex vivo tem sido utilizada uma variedade de células transduzidas com retro ou adenovirus e transplantadas em camundongos hemofílicos. Ape- sar de níveis terapeuticos de FVIII serem detectados na circulação, a ex- pressão declina gradualmente devido ao tempo limitado de sobrevivência das células transplantadas ou devido ao silenciamento da transcrição do transgene.8-12 O uso de vetores retrovirais é dificultado pelo baixo título do vetor e por baixos níveis de expressão do FVIII. Recentemente, modificações nos vetores retrovirais permitiu a produção de altos títulos do vetor13-15, apesar da incapacibilidade destes vetores retrovirais de transduzir célu- las quiescentes, limitando o seu uso na terapia gênica in vivo. Vetores adenovirais podem transduzir uma variedade de células, incluindo células quiescentes e foi observada eficiente produção de FVIII em transdução in vivo.16 Esta ex- pressão do FVIII foi gradualmente perdida devido á resposta imune con- tra o vetor ou contra o produto do transgene. Vetores lentivirais, baseados no HIV, são uma ferramenta promis- sora para terapia gênica, diferente- mente do retrovirus MLV (Moloney murine leukemia based), os lentivirus são capazes de transduzir estavel- mente células quiescente em vários órgaos 15, 17. Contudo, a resposta i- mune do hospedeiro contra o produ- to transgênico expresso pode resultar na perda da expressão da proteína na circulação18 . Resultados obtidos no Institu- to de Medicina Transfusional de Frankfurt mostram que células endo- teliais progenitoras derivadas de cordão umbilical (CBECs) 19 e células Hematopoiéticas20 transduzidas com vetor lentiviral contendo o cDNA do FVIII mantêm a expressão estável do FVIII por várias gerações, indicando que estas células podem ser usadas futuramente na terapia gênica. Além disso, um estudo detalhado da via de secrecão do FVIII mostra que do FVII recombinante, com ou sem o domínio B, expresso em células que não secre- tam o FVIII fisiologicamente fica reti- do em compartimentos celulares, como o retículo endoplasmático, li- mitando a secrecão deste fator21 . Aná- lise de fatores envolvidos na secrecão do FVIII, linhagens celulares adequa- das à expressão e secrecão, assim como a utilizacão de determinados promotores poderão facilitar a ex- pressão do FVIII recombinate. Objetivos O objetivo principal deste projeto é produzir o fator VIII de co- agulação em sistemas celulares in vi- tro, por técnicas de engenharia recom- binante. Este objetivo se justifica com base no pressuposto de menor custo e maior segurança, visto que seriam produtos praticamente isentos de agentes patogênicos, ao contrário do produto obtido do plasma humano. Em colaboração com o Insti- tuto de Medicina Transfusional de Frankfurt objetivamos obter altos níveis de fator VIII em linhagens ce- lulares de mamífero e também a con- strução de vetores lentivirais para uma futura aplicação em estudos in vivo (terapia gênica). Construções Estudos usando a primeira geração de vetores adenovirais Figura 1: A. Construções Lentivirais. As construções lentivirais foram realizadas no vetor 1054 (cedido gentilmente por Naldini L), onde o FVIII sem o dominio B foi clonado sob controle dos promotores CMV, HAAT, FVIIIp e EF1-alpha B. Constru- coes plasmidiais. Nas construções plasmidiais o vetor utilizado foi o pCDNA3.1 e diferentes promotores (CMV, HAAT, FVIIIp e EF1-alpha) foram clonados juntamente com o FVIII sem o domínio B. A B Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 85 sugerem que estes modelos podem explicar a especificidade das proteínas Cry de B. thuringiensis. * indução à formação de poros na membrana celular do epitélio intesti- nal (Höfte & Witeley, 1989; Schnepf et al., 1998). * desequilíbrio iônico entre o ci- toplasma e o meio externo à célula (Gill et al., 1992; Knowles & Bow, 1993). As análises histopatológicas re- alizadas após a intoxicação dos insetos mostram a destruição das microvilosi- dades, hipertrofia das células epiteliais, vacuolização do citoplasma e lise celu- lar, levando o inseto à paralisia e morte (Endo & Nishiitsuji-Uwo, 1981; Bravo et al., 1992a,b; Denolf et al., 1993a,b). Considerando a especificidade inseticida das proteínas Cry de B. thu- ringiensis, de acordo com Meadows (1993), até o momento não foram descritos casos de intoxicações de mamíferos através dos alimentos. Por outro lado, em estudos com toxinas de B. thuringiensis israelensis, adminis- tradas via parenteral, foi observada a atividade citolítica para diversas célu- las de mamíferos (Thomas & Ellar, 1983; Armstrong et al., 1985; Meado- ws, 1993). Face aos referidos dados, esse entomopatógeno tem sido consi- derado seguro ao homem e ao ecossis- tema. Na seleção das proteínas insetici- das, sintetizadas por essa bactéria, as análises in vitro dos receptores mem- branares podem viabilizar uma rápida determinação do espectro de ação das proteínas Cry contra as espécies alvo, sendo em seguida efetuada a avaliação da toxicidade in vivo, apenas para os isolados pré-selecionados como ativos in vitro. Sendo assim, o presente traba- lho trata de diferentes métodos de análise de receptores de proteínas de B. thuringiensis em formas imaturas de lepidópteros. 2. Material e métodos 2.1. Tecidos dos insetos As larvas de lepidópteros (Chilo suppressalis, Heliothis armigera e Plu- tella xylostella) foram obtidas da cria- ção massal de insetos mantida em laboratório, a 25±1ºC, 70±5ºC e 12h de fotofase. Os tubos digestivos foram dissecados e fixados durante 24h em BHS a 10%, sendo em seguida lavados por 12h em água destilada e desidrata- dos em séries crescentes de etanol, 70 a 100% (Brandtzaeg, 1982). Os tecidos foram impregnados em banhos mistos (etanol/tolueno/paraplasto) e incluí- dos em paraplasto 100% a 58ºC. Os cortes longitudinais de 7 µm de espes- sura, preparados com micrótomo LKB, foram montados em lâminas de vidro, tanadas com poly-l-lysina (Sigma) a 10%, e conservadas a 4ºC. 2.2. Purificação das proteínas Cry As proteínas Cry1Aa, Cry1Ac e Cry1Ba foram obtidas de B. thuringi- ensis dendrolimus HD 37, B. thurin- giensis kurstaki HD 73 e B. thuringi- ensis thuringiensis 4412, respectiva- mente. Essas cepas contêm apenas um gene cry que codifica a referida proteína Cry inseticida, as quais foram cedidas para essa pesquisa pelo Insti- tuto Pasteur (IEBC-Paris, França) e a Pant Genetics Systems (PGS-Ghent, Bélgica). As cepas de B. thuringiensis foram cultivadas conforme o método de Mahillon & Delcour (1984). Após a lise bacteriana foram centrifugadas e lavadas com tampão fosfato (100 mM NaH 2 PO 4 ; 100 mM NaCl; 0,01 % Tri- ton X-100; pH 6). Os cristais foram separados dos esporos e das células bacterianas em gradiente de renografina por ultracen- trifugação, conforme metodologia des- crita por Sharpe et al. (1975). As ban- das, contendo os cristais puros, foram lavadas e diluídas em água milli-Q esterilizada, contendo 0,1 mM phenyl- methylsulfonyl (PMSF). As proteínas Cry foram solubilizadas em tampão fosfato (50 mM Na 2 , CO 3 ; 10 mM di- thiothreitol; 0,1 mM PMSF; pH 10). O pH foi ajustado a 8,6 por diálise contra o tampão 20 mM Tris e as proteínas Cry foram clivadas por bovine pancre- atic trypsin (Type I; Sigma), sendo a reação inativada com trypsin inhibitor (Type II-S; Sigma). A pureza e a integridade das pro- teínas foram avaliadas por eletroforese em gel de poliacrilamida a 10%, SDS-PAGE (Laemmli, 1970). A con- centração foi determinada pelo méto- do Bradford (1976), usando a bovine serum albumin (BSA) como proteína padrão. 2.3. Proteínas Cry biotiniladas As proteínas Cry foram prelimi- narmente biotiniladas conforme o método descrito por Bayer & Wilcheck (1990), onde a incorporação da biotina na parte N-terminal da proteína é feita usando o BNHS (biotinyl-N-hydroxy- succinimide éster - Amersham) em tampão de bicarbonato de sódio (100 mM NaHCO 3 ; 150 mM NaCl; pH 9). O produto da reação foi purificado em sephadex G-25 (Sigma) e as fra- ções biotiniladas identificadas por dot- blot, onde foi utilizada membrana de nitrocelulose, o conjugado de estrep- tavidina-fosfatase-alcalina diluída no tampão Tris-Saline-Triton (10 mM Tris; 150 mM NaCl; 0,1% Triton X-100; pH 7;6) e o substrato de revelação (5- bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate e nitroblue tetrazolium, diluídos no tam- pão 100 mM Tris; 100 mM NaCl; 5 mM MgCl 2 ; pH 9,5). A concentração das proteínas Cry biotiniladas foi determi- nada pelo método Bradford (1976), usando a BSA como proteína padrão. A pureza e a integridade das proteínas marcadas foi avaliada em western-blot, usando membrana de nitrocelulose (Sigma) e o tampão Towbin (12.5 mM Tris, 96 mM glycine; pH 8,3 com 10% ethanol). As membranas foram revela- das usando a mesma técnica descrita no dot-blot. 2.4. Anticorpos policlonais As proteínas, Cry1Aa, Cry1Ac e Cry1Ba, foram preparadas conforme descrito anteriormente na purificação. Os anticorpos foram produzidos em coelhos (Eurogentec – Bélgica), sendo as imunoglobulinas (IgGs) separadas em colunas de sepharose protein-A e as frações purificadas por afinidade incubando os IgGs e as membranas de nitrocelulose, contendo os antígenos previamente transferidos por western- blot conforme descrito por Burke et al. (1982). A especificidade e sensibilida- de dos anticorpos policlonais foi deter- minada pelo método de ELISA (Enzy- me-linked immunosorbent assay) e dot-blot. 2.5. Detecção in vitro dos receptores membranares O estudo in vitro dos receptores foi efetuado sobre cortes histológicos do intestino dos insetos, utilizando as 86 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 toxinas sintetizadas pelas cepas de B. thuringiensis em estudo. A detecção propriamente dita corresponde a incu- bação dos tecidos, previamente des- parafinados e reidratados, com as pro- teínas Cry. Nas análises com proteínas Cry biotiniladas, os cortes histológicos fo- ram incubados à temperatura ambien- te, durante 1h, com as proteínas bioti- niladas (10 µg/ml). As proteínas não ligadas aos sítios receptores foram re- movidas com TST (10 mM Tris; 150 mM NaCl; 0,1% Triton X-100; pH 7,6). Em seguida, os tecidos foram tratados com estreptavidina conjugada a uma enzima (peroxidase ou fosfa- tase alcalina) ou fluorocromo (fluoresceína ou ficoeritrina), diluídos em tampão TST. O complexo da reação “proteí- na-receptor”, usando o conju- gado com enzimas foi revela- do com substrato DAB para peroxidase e BCIP/NBT para fosfatase alcalina, sendo as secções montadas com Per- tex, entre lâmina e lamínula de vidro. Nas revelações com a fluoresceína ou ficoeritrina, as secções foram montadas com Mowiol e conservadas a 4ºC. Nas análises imunohisto- químicas com proteínas nativas (não biotiniladas), os receptores foram re- velados com o complexo anticorpo primário (AC 1 , específico contra a pro- teína Cry) e anticorpo secundário (AC 2 , dirigido contra o AC 1 ) conjugado a uma enzima ou fluorocromo, os quais foram revelados e montados de acordo com o método descrito anteriormente. Na imunodetecção, os cortes histológicos foram incubados com as proteínas na- tivas e na imunolocalização, as lagartas foram previamente tratadas in vivo com as proteínas Cry e posteriormente foram preparados os tecidos e as rea- ções imunohistoquímicas. Em ambos os métodos, as teste- munhas foram preparadas pela omis- são alternada de cada etapa da reação, a fim de eliminar a hipótese de reações falso-positivas. As amostras reveladas com enzimas, tipo peroxidase e fosfa- tase alcalina, foram avaliadas em mi- croscopia óptica de contraste de fase Nomarski (Leitz DMRB). Para as análi- ses onde foram utilizados os fluorocro- mos foi utilizada a microscopia de varredura laser (ACAS 570, Meridian). 3. Resultados 3.1. Localização de receptores com proteínas Cry biotiniladas Os cortes histológicos das lagartas de Chilo suppressalis, tratados com proteínas biotiniladas de Cry1Aa e Cry1Ac (Fig. 1A), revelaram uma mar- cagem uniforme ao longo das microvi- losidades intestinais. Na mesma espé- cie a marcagem de Cry1Ba (Fig. 1B) também foi intensa. Os tecidos de Heliothis armigera também apresen- taram marcagem uniforme nas micro- vilosidades intestinais para a proteína Cry1Ac (Fig. 1C), sendo os mesmos resultados obtidos nos ensaios com as lagartas de Plutella xylostella, quando tratadas com as proteínas Cry1Aa e Cry1Ac (Fig. 1D). No caso dos tecidos tratados como controle, representantes da omissão alternada dos diferentes componentes da reação, observou-se a ausência de coloração nas microvilosidades das cé- lulas do epitélio intestinal dos insetos em estudo. As marcagens detectadas na região das microvilosidades das cé- lulas do epitélio intestinal revelam a presença de receptores membranares às proteínas Cry, em estudo, nas refe- ridas espécies de insetos alvo. 3.2. Imunodetecção de recepto- res com proteínas Cry nativas Os resultados das análises de imunohistoquímica, utilizando os anti- corpos policlonais, confirmam a detec- ção dos receptores membranares in- testinais nas lagartas de: Chilo suppres- salis às proteínas nativas Cry1Aa, Cry1Ac e Cry1Ba; Heliothis armigera à proteína Cry1Ac; Plutella xylostella às proteínas Cry1Aa e Cry1Ac (Fig. 2). 3.3. Imunolocalização de recep- tores com proteínas Cry nativas Nessas análises apenas a espé- cie Chilo suppressalis foi avaliada, de- monstrando a localização de recepto- res intestinais às proteínas Cry1Aa, Cry1Ac e Cry1Ba nos tecidos das lagar- tas previamente intoxicadas in vivo, confirmando assim os dados obtidos nas análises in vitro de receptores por imunode- tecção e biotinilação de pro- teínas. 3.4. Receptores mem- branares em microsco- pia de varredura laser As amostras de imuno- detecção (Fig. 2) e biotinila- ção de proteínas, reveladas com fluorocromos, foram avaliadas em microscopia de varredura laser, que permite uma análise semiquantitati- va dos receptores através da varredura da totalidade das secções longitudinais dos tubos digestivos das lagartas, podendo-se obter imagens: bidimensional (Fig. 2A), tridimensional (Fig. 2B) ou um gráfico que representa o pico de fluorescência numa linha imaginária do epitélio intestinal (Fig. 2C). Nos estudos com Chilo suppres- salis foi avaliada a distribuição dos receptores das proteínas Cry1Aa e Cry1Ac ao longo do epitélio intestinal, cujos dados foram convertidos em va- lores numéricos correspondentes à in- tensidade de fluorescência e analisa- dos estatisticamente pelo teste de ho- mogeneidade de variância de Bartlett (Dagnelie, 1970), sendo as duas prote- ínas comparadas pelo teste de Stu- dent–Neuwman-Keuls em três por- ções intestinais. Os resultados revela- ram uma diferença significativa na in- tensidade de fluorescência detectada para Cry1Aa e Cry1Ac (Fig. 3), sendo a primeira mais intensa, representando Figura 1: Detecção de receptores de proteína Cry1 de Bacillus thuringiensis em cortes longitudinais de lagartas de Chilo suppressalis (A e B), Heliothis armigera (C) e Plutella xylostella (D), analisados em microscopia óptica de contraste de fase Nomarski e Fluorescência. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 87 competição de duas proteínas, como por exemplo Cry1Aa e Cry1Ba, reve- ladas com fluorocromos detectados em diferentes comprimentos de onda, so- bre a mesma porção intestinal da lagar- ta (Chilo suppressalis), revelando as- sim que a fluorescência pode ser so- breposta (Fig. 4) e que essas proteínas se ligam aos mesmos receptores mem- branares intestinas. 4. Discussão As análises de receptores mem- branares intestinais, através de técni- cas de imunohistoquímica e detecções de proteínas Cry biotiniladas, foram realizadas por diversos autores em lar- vas de diferentes espécies de lepidóp- teros (Bravo et al., 1992a; Denolf et al., 1993a; Estada e Ferre, 1994; Fiuza, 1995), dípteros (Ravoahangimalala et al., 1993) e coleópteros (Bravo et al. 1992a; Boets et al., 1994). Esses auto- res comprovaram que as ligações das proteínas Cry nas microvilosidades do intestino médio das larvas de insetos correspondem à existência de um re- ceptor específico à referida proteína no inseto-alvo. As análises in vitro de recepto- res de proteínas Cry de B. thuringien- sis reveladas com enzimas mostram que em geral os receptores estão dis- tribuídos uniformemente ao longo do intestino médio dos lepidópteros (Bra- vo et al., 1992b; Denolf et al., 1993a), porém Bravo et al. (1992b) revelaram que essas proteínas se ligam preferen- cialmente nas microvilosidades da por- ção posterior do intestino médio das larvas dos coleópteros. No presente estudo, as semiquantitativas dos re- ceptores, avaliadas em microscopia de varredura laser, em larvas de lepidóp- teros, também revelaram que a distri- buição desses receptores membrana- res intestinais foi diferenciada ao longo do epitélio, sendo mais concentrada nas porções anteriores e posteriores do intestino médio. Nas avaliações de competição das proteínas de B. thuringiensis, as toxinas Cry1Aa e Cry1Ba mostraram- se em competição pelos receptores celulares de Chilo suppressalis, cujos dados também foram demonstrados em outras espécies de lepidópteros. Por outro lado, os estudos desenvolvi- Figura 2: Imunodetecção de receptores de proteína Cry1A de Bacillus thuringiensis em cortes longitudinais de lepidópteros, analisados em microscopia de varredura laser (barra = 35 µm). Figura 3: Distribuição de receptores de proteínas Cry1 ao longo intestino médio de lagartas de Chilo suppressalis, avaliadas em microscopia de varredura laser. uma maior concentração de recepto- res intestinais na espécie em estudo. Por outro lado, ambas as proteínas revelaram uma maior quantidade de receptores na porção anterior (Fig. 3A) e posterior (Fig. 3C) do intestino mé- Figura 4: Competição de proteínas Cry1 biotiniladas, reveladas com fluoresceína (Cry1Aa - detector1) e ficoeritrina (Cry1Ba - detector 2), na análise de receptores membranares intestinais de Chilo suppressalis, em microscopia de varredura laser. dio, quando comparadas à porção cen- tral (Fig. 3B). A microscopia de varredura laser permite a leitura simultânea de dois fluorocromos (fluoresceína e ficoeritri- na), permitindo assim a análise da 90 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 Nanotecnologia é arma na luta contra o câncer O Instituto do Câncer dos Estados Unidos (NCI) anunciou um plano de cinco anos para desenvolver a utiliza- ção da nanotecnologia no combate ao câncer. A área, que abrange a criação de aparelhos microscópicos, é consi- derada promissora para a obtenção de novas formas de diagnóstico e trata- mento da doença em estágio inicial e com poucos efeitos colaterais. “Se pudermos alcançar esses ob- jetivos, seremos capazes de eliminar a doença”, previu Richard Smalley, pro- fessor de nanotecnologia da Rice University. O plano de US$ 144,3 mi- lhões incluirá a Aliança para a Nanotecnologia no Câncer, uma inicia- tiva que reunirá pesquisadores, médi- cos, empresas e grupos sem fins lucra- tivos. A medicina já emprega dispositi- vos do tamanho de moléculas na forma de proteínas - como os anticorpos - naturais ou criadas artificialmente. “A novidade é que podemos construir nano-objetos que nunca existiram”, comentou Smalley. Esses dispositivos seriam cobertos de substâncias que encontrariam as células cancerosas. Os nano-objetos também pode- rão levar drogas para matar as células ou agentes de obtenção de imagens para ajudar a detectar o câncer, expli- cou o médico Mauro Ferrari, consultor do NCI e professor de engenharia biomédica da Ohio State University. “Ao realizar isso em uma escala muito pequena, haverá efeitos distin- tos. As possibilidades são enormes para se encontrar tumores muito pequenos, muito antes do que conseguimos hoje, e tratá-los com drogas poderosas, ao mesmo tempo reduzindo os efeitos colaterais. A iniciativa permitirá que exploremos o uso dessa tecnologia em seu pleno potencial”, disse Samuel Wickline, da Washington University. técnica possibilita tratamento pre- ciso Uma droga conduzida por um equipamento nanométrico poderia, por exemplo, atingir células cancerosas com uma precisão que não existe na quimioterapia e na radioterapia. Se- gundo os especialistas, isso já é possí- vel com os anticorpos monoclonais, mas essa área seria ampliada de manei- ra significativa. Os lipossomos, cápsulas minúscu- las usadas para carregar drogas, podem ser considerados a primeira geração de dispositivos desse tipo. A médica Janet Woodcock, comissária-adjunta da FDA, disse que a agência tem se preparado para aprovar novos dispositivos médi- cos em escala nanométrica - um nanômetro corresponde a um bilionésimo do metro. “Vemos um gran- de potencial em novas formas de ad- ministração de remédios”, disse. Qualquer produto novo, porém, terá de passar pelas etapas normais de aprovação nos quesitos segurança e eficácia. Janet Woodcock lembrou que também haverá algumas questões bu- rocráticas, principalmente se os produ- tos forem classificados ao mesmo tem- po como dispositivos e drogas. A diretora-adjunta do NCI, Anna Barker, informou que o plano incluirá US$ 90 milhões para pelo menos cinco centros de excelência em cinco anos, US$ 16 milhões para treinamento e US$ 38 milhões em bolsas para proje- tos específicos. Primeiras aplicações >> Os lipossomos, a primeira geração de dis- positivos nanométricos para adminis- tração de remédios, foram desenvolvi- dos para levar tratamentos anticâncer diretamente aos tumores. A doxorubicina lipossômica é usada para tratar alguns tipos de câncer, enquanto a anfotericina lipossômica B combate infecções por fungos, freqüentemente associadas a tratamentos anticâncer agressivos. >>Recentemente, uma for- mulação de nanopartículas do conhe- cido composto anticâncer taxol foi sub- metida ao FDA como um novo trata- mento para câncer de mama em está- gio avançado. >> Outras aplicações clínicas da nanotecnologia têm como foco a identificação do câncer em está- gios iniciais; a visualização do desen- volvimento da doença; a administra- ção de tratamentos melhorados para aumentar a eficácia e reduzir os efeitos colaterais das drogas; e a detecção de sinais de eficácia de medicamentos. Jornal do Commercio - RJ 90 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento Especialistas aprofundam pesquisas sobre a Amazônia Durante três dias, entre amanhã (28/09) e a próxima quinta-feira (30/ 09), especialistas e pesquisadores de prestígio internacional discutem, em Rio Branco (AC), questões relativas à ciência e tecnologia, experiências e resultados concretos na Amazônia, exploração florestal, genética, ecolo- gia, mercado e organização comunitá- ria. A programação é parte do seminá- rio Manejo Florestal para Pequenas Pro- priedades: a Experiência do Projeto de Colonização Pedro Peixoto. O seminário será uma oportunida- de para sintetizar a experiência acumu- lada no projeto de assentamento Pedro Peixoto, onde 25 produtores estão envolvidos com manejo florestal co- munitário há quase 10 anos sob orien- tação de pesquisadores da Embrapa Acre. O modelo desenvolvido no local tornou-se referência para o Estado e o Instituto Nacional de Colonização e Reforma Agrária (Incra) já manifestou interesse em adotá-lo em projetos de assentamentos florestais na Amazônia. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 9191 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento Uma forma de remediar solos con- taminados pelo herbicida atrazina, uti- lizando técnicas da indústria farmacêu- tica, está sendo desenvolvida pela pro- fessora Julieta Mieko Ueta, da Faculda- de de Ciências Farmacêuticas de Ribei- rão Preto (FCFRP) da USP. Ela conse- guiu isolar microrganismos redutores de atrazina e condensá-los em microcápsulas, formando uma espécie de biomedicamento - em que o princí- pio ativo, ao invés de uma substância química, é um ser vivo. Em parceria com o CNPMA (uni- dade Meio Ambiente da Embrapa, lo- calizada em Jaguariúna), Ueta coletou mensalmente, durante dois anos, amos- tras de solo de fazendas da região de Ribeirão Preto. “Escolhemos uma pro- priedade monocultora, produtora de cana-de-açúcar - cultivo que demanda larga aplicação de atrazina”, explica a pesquisadora. Em laboratório, ela me- diu o impacto do uso do herbicida sobre a biodiversidade bacteriana do solo. “As bactérias, além de metabolizarem materiais orgânicos e contribuírem para a fertilidade do ter- reno, conseguem biodegradar subs- tâncias xenobióticas, como pesticidas e herbicidas. No entanto, quando a aplicação do herbicida é exagerada, a capacidade biorremediadora da popu- lação microbiana é reduzida, com con- seqüente prejuízo à qualidade do solo e do ambiente”, diz. A atrazina é um herbicida triazínico, empregado largamente na agricultura para o controle de ervas daninhas. “Estima-se que a cultura canavieira no Brasil vem consumindo acima de 20 mil toneladas desse tipo de substância por ano”, afirma Ueta. O dado é preocupante na medida em que a atrazina, graças ao seu alto potencial de escoamento e elevada persistência nos solos, é um potencial contaminador da água. Essas características ganham maiores proporções na região de Ri- beirão Preto, onde se localiza um dos pontos de afloramento do Aqüífero Guarani. “Durante o processo de po- luição, a atrazina infiltra-se no solo, podendo atingir lençóis freáticos”, ex- plica a pesquisadora. “Analisamos amos- tras da água do Aqüífero e não encon- tramos indícios concretos de contami- nação. No entanto, como a atrazina é amplamente usada nas culturas de cana- de-açúcar da região, o risco existe.” Biorremédio é mais eficiente na degradação de herbicidas no solo Células mortas por raios Tratamento com radiação ultravioleta artificial é usado para linfoma cutâneo Trabalho sobre o uso da radiação ultravioleta artificial para o tratamento do câncer linfoma cutâneo será apre- sentado no Simpósio de Imunologia Clínica e Experimental (ImunoRio), que acontece dias 16 e 17 na Santa Casa de Misericórdia, no Centro. A doença se manisfesta na pele, mas pode se alastrar para órgãos como pulmão e fígado. ́ Durante quatro anos, o professor Luiz Werber Bandeira, chefe do Servi- ço de Imunologia Clínica e Experimen- tal da Santa Casa, realizou pesquisa com nove pacientes portadores do linfoma. A radiação foi aplicada três vezes por semana, durante quatro meses. No fim do estudo, concluiu-se que as células cancerígenas diminuíam consideravelmente. Não houve efei- tos colaterais. Colocados em uma câmara com lâmpadas que emitem raios ultraviole- tas artificiais, os pacientes tomaram psoraleno, substância imunomodula- dora que previne complicações Fonte: O Dia - RJ Pedro Peixoto foi um dos primeiros trabalhos de manejo articulado com produtores rurais que, tradicionalmen- te, viam a floresta como um entrave ao desenvolvimento da propriedade. Entre os pesquisadores de maior expressão, está Milton Kanashiro, da unidade Amazônia Oriental da Empre- sa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (Embrapa), vinculada ao Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Kanashiro é líder do Projeto Dendrogene, que busca os pontos de equilíbrio ente o uso e conservação da floresta e a exploração madeireira, ge- radora de 600 mil empregos e R$ 3 bilhões de renda ao Brasil. O projeto desenvolve meios de avaliar os impac- tos da exploração florestal sobre a biodiversidade. Trata dos impactos so- bre a capacidade da floresta de se regenerar e garantir, por meio de pro- cessos de reprodução, a continuidade das diferentes espécies. O Dendrogene conquistou o Prêmio Ford de Conser- vação Ambiental 2003 e o Super Eco- logia 2004, concedido pela revista Super Interessante. O seminário é uma iniciativa da Embrapa Acre, Instituto Brasileiro do Meio Ambiente (Ibama), Pro-Manejo e Associação dos Produtores Rurais em Manejo Florestal e Agricultura (Apruma). O encontro conta com pa- trocínio da KfW Group e apoio do Sebrae e Governo do Estado do Acre. A programação completa pode ser vista em www.cpafac.embrapa.br. Fonte: www.agricultura.com.br Biorremédio Foi justamente com o objetivo de evitar possíveis contaminações do solo e, principalmente, da água que Ueta vem desenvolvendo microcápsulas com microrganismos do gênero Pseudomonas - que conseguem de- gradar a atrazina com grande eficiên- cia. O biorremédio para o solo é com- posto utilizando técnicas da fabricação de medicamentos pela indústria far- macêutica. “Os princípios ativos dos ‘comprimidos’ são as bactérias. Porém, na formulação das microcápsulas, adi- cionamos alguns nutrientes cujo papel é facilitar o desenvolvimento dos mi- crorganismos de forma que eles degra- dem mais rapidamente a atrazina”, esclarece Ueta. 92 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.32 - janeiro/junho 2004 Biodiesel ganha status de fonte alternativa de energia Pesquisadores, professores, estu- dantes, especialistas de órgãos públi- cos e parlamentares participam ama- nhã (28/09), às 8h15, no auditório da Reitoria da Universidade de Brasília (UnB), do 5º Encontro do Projeto Café com Ciência, cujo tema será “Biodiesel: Uma alternativa de Energia Renovável”. Promovido pelo Decanato de Pesquisa e Pós-Graduação da UnB, o encontro mostrará as pesquisas desen- volvidas pela universidade sobre o biocombustível. A palestra dos pesqui- sadores Kleber Carlos Mundim e João Nildo de Sousa Vianna abordará os aspectos fundamentais do uso do biodiesel no Brasil, como a caracteriza- ção, produção, utilização e sustentabilidade da cadeia produtiva. O trabalho envolve o Instituto de Química, onde são estudados os pro- cessos tecnológicos da utilização dos diversos óleos vegetais, como os deri- vados da soja, girassol e mamona, além do Departamento de Engenharia Me- cânica e o Centro de Desenvolvimen- to Sustentável, que investigam o de- sempenho do biodiesel e as questões de sustentabilidade. Emprego - O governo federal pretende autorizar a entrada do biodiesel no mercado nacional de combustíveis até o final deste ano. O produto poderá ser adicionado ao óleo diesel mineral na proporção de até 2%, sem compro- meter a garantia dos motores dos veí- culos. O Brasil dispõe de um grande número de matérias-primas para a pro- dução de biodiesel, como soja, girassol, mamona e dendê. O governo federal espera que a entrada do novo combus- tível no mercado nacional permita a redução da importação do diesel, que hoje corresponde a 9% do consumo. Além disso, o biodiesel deve apoiar o desenvolvimento econômico do meio rural com a geração de empregos e renda e incrementar o desenvolvimen- to da indústria nacional de pesquisa e equipamentos. Fonte: www.agricultura.gov.br Nos testes em laboratório, a biorremediação obteve sucesso. No entanto, ela ainda não foi aplicada em campo “porque deve-se estudar a fun- do as conseqüências que a introdução de seres vivos estranhos ao ambiente pode provocar. Caso contrário, ao in- vés de melhorar a situação, podemos causar um desequilíbrio ambiental”, aler- ta a pesquisadora. Segundo ela, as melhores ferramentas biológicas são aquelas que, quando lançadas na natu- reza, cumprem seu papel e morrem, “como as bactérias utilizadas em derra- mes de petróleo no oceano”. Por isso, conclui Ueta, o ideal é mesmo não poluir. Tadeu Breda Mais informações: (0XX16) 602-4158 ou jueta@usp.br Fone: Agência USP de Notícias Resina para imobilização da invertase apresenta vantagens em relação ao carvão ativo Pesquisadores do Departamento de Tecnologia Bioquímico-Farmacêu- tica, da Faculdade de Ciências Farma- cêuticas (FCF) da USP, patentearam um novo método de imobilização de invertase - enzima usada no processo de produção do açúcar invertido. “De- senvolvemos uma nova maneira de reaproveitar várias vezes a invertase”, comenta o professor Michele Vitolo, que juntamente com sua orientanda, Ester Junko Tomotani, patentearam o produto. O açúcar invertido é uma mistura de frutose com glicose, e resulta da quebra das moléculas da sacarose - o açúcar comum, obtido da cana-de-açú- car. É muito utilizado pela indústria de alimentos, uma vez que a frutose tem mais capacidade de adoçar do que a sacarose. “Nós imobilizamos a invertase em uma resina de troca iônica (tipo DOWEX®)”, explica o professor. Essa resina é um polímero orgânico, insolú- vel em água, capaz de adsorver macromoléculas (no caso, a invertase) por meio de interação eletrostática. “Dizemos que as moléculas de invertase presas ao polímero (chamado de su- porte ou carreador) encontram-se na forma imobilizada”, conta Vitolo. “Com a invertase imobilizada, podemos utilizá-la várias vezes, sem nenhum tipo de perda”. Vantagens A invertase imobilizada já é co- nhecida desde 1916 - e usada regular- mente na indústria. Só que a fórmula comercial atual de maior uso traz invertase imobilizada em carvão ativo. “É um método eficiente, mas acredita- mos que a imobilização em DOWEX® apresenta vantagens”, comenta o pro- fessor. Uma delas é a facilidade em separar após a reação, geralmente por filtração, a invertase imobilizada do restante da mistura, sem deixar vestígi- os de resina no produto final (açúcar invertido). “Como as partículas de car- vão ativo têm dimensões extrema- mente reduzidas, para evitar a presen- ça delas no produto final torna-se ne- cessário o uso de microfiltros - muito caros - ou realizar várias filtrações su- cessivas, quando se empregam filtros comuns”, diz Vitolo. Para desenvolver esse método, o professor Vitolo e Ester Tomotani tes- taram vários tipos de resinas de troca iônica. “Foram testadas mais de vinte resinas com características distintas. Quatro ou cinco variedades de resina se mostraram favoráveis, mas a DOWEX® (tipos 1X2, 1X4 e 1X8) adsorveu 100% das moléculas de invertase”, explica. “As vantagens des- sa resina são a não toxicidade, o baixo custo, o amplo uso e a plena disponi- bilidade no mercado”. Márcia Blasques, especial para a Agên- cia USP Mais informações: (0XX11)091-2382, com o professor Michele Vitolo, ou pelo e-mail michenzi@usp.br Fonte: Agência USP de Notícias 92 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento
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