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Guias e Dicas
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Revista - biotecnologia ed 38, Notas de estudo de Química

REVISTA BIOTECNOLOGIA - ED 38

Tipologia: Notas de estudo

2010

Compartilhado em 04/12/2010

jacare84
jacare84 🇧🇷

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Baixe Revista - biotecnologia ed 38 e outras Notas de estudo em PDF para Química, somente na Docsity! AU) ainaro d + 200) AUTO Ao a OLARIA att ds mi da bia pi di 2 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38 Colaboraram nesta edição: BIOTECNOLOGIA Ciência & Desenvolvimento KL3 Publicações Fundador Henrique da Silva Castro Direção Geral e Edição Ana Lúcia de Almeida Diretor de Arte Henrique Castro Fº Projeto Gráfico Agência de Comunicação IRIS E-mail biotecnologia@biotecnologia.com.br Portal www.biotecnologia.com.br Departamento Comercial, Redação e Edição: SHIN CA 01 - Lote A - Bloco A - Sala 223 Shopping Deck Norte Lago Norte Brasília - DF CEP: 71503-502 Os artigos assinados são de inteira responsabilidade de seus autores. ISSN 1414-6347 Nota: A Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento, é indexada na AGROBASE ( base de dados da Agricultura Brasileira) BINAGRI- Biblioteca Nacional de Agricultura- MAPA- Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. no Agris ( International Information System for the Agricultural Sciences and Technology) da FAO e atende a obrigatoriedade do Depósito Legal na Biblioteca Nacional do Rio de Janeiro - Fundação Biblioteca Nacional. Aline Oliboni de Azambuja Bióloga (UNISINOS) e Mestre em Biologia: Diversidade e Manejo de Vida Silvestre (UNISINOS). Andresa Patrícia Regert Lucho Engenheira Agrônoma (UFRGS) e Mestre em Biologia: Diversidade e Manejo de Vida Silvestre (UNISINOS). Diouneia Lisiane Berlitz Bióloga (UNISINOS) e Mestre em Biologia: Diversidade e Manejo de Vida Silvestre (UNISINOS). Emerson Luís Nunes Costa Engenheiro Agrônomo (UFRGS) e Mestre e Doutor em Fitotecnia – Fitossanidade (UFRGS) Gabriela Cristina Alles Bióloga (UNISINOS) e Mestre e Doutoranda em Biologia: Diversidade e Manejo de Vida Silvestre (UNISINOS). Jaime Vargas de Oliveira Engenheiro Agrônomo (UFSM), Mestre em Fitotecnia – Fitossanidade/Entomologia (UFPEL), Laura Massochin Nunes Pinto Bióloga (PUCRS) e Mestre e Doutoranda em Biologia: Diversidade e Manejo de Vida Silvestre (UNISINOS). Leila Lucia Fritz Bióloga (UNISINOS) e Mestranda em Biologia: Diversidade e Manejo de Vida Silvestre (UNISINOS). Lidia Mariana Fiúza Engenheira Agrônoma (UPF), Mestre em Fitotecnia – Fitossanidade (UFRGS), Doutora em Ciências Agronômicas (ENSAM-Montpellier) e Pós-Doutora em biotecnologia Vegetal (CIRAD-Montpellier). Marcus Hübner Biólogo (FURG) e Mestre em Biologia: Diversidade e Manejo de Vida Silvestre (UNISINOS). Maria Helena Ribeiro Reche Bióloga (UPF) e Mestre e Doutoranda em Biologia: Diversidade e Manejo de Vida Silvestre (UNISINOS). Neiva Knaak Bióloga (UNISINOS) e Mestre e Doutoranda em Biologia: Diversidade e Manejo de Vida Silvestre (UNISINOS). Raquel Castilhos-Fortes Bióloga (UNISINOS) e Mestre em Microbiologia Agrícola e do Ambiente (UFRGS) Rogério Schünemann Biólogo (UNISINOS) e Mestre em Biologia: Diversidade e Manejo de Vida Silvestre (UNISINOS). Vilmar Machado Biólogo (UNISINOS) e Mestre e Doutor em Genética e Biologia Molecular (UFRGS) Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38 5 Figura 1. Abundância de insetos e inimigos naturais em lavouras de arroz irrigado, RS ga. Fritz et al. (2008) analisaram a abundância de in- setos-praga e inimigos naturais presentes em áreas de arroz irrigado em Cachoeirinha (RS). Foram quan- tificados 1015 indivíduos subdivididos em 10 ordens de insetos e 2 ordens de aracnídeos (Figura 1). Os dípteros apresentaram maior abundância dentre os insetos (51,92%), seguido de Hemiptera (14%), Hy- menoptera (8,87%), Collembola (8,18%), Coleoptera (3,05%), Orthoptera (2,56%), Odonata (1,28%), Pso- coptera (0,98%), Lepidoptera (0,69%) e Dermaptera (0,1%). Acredita-se que as larvas de mosquitos vêm desenvolvendo resistência aos inseticidas que são uti- lizados frequentemente em lavouras orizícolas, tor- nando-se conseqüentemente abundantes nesses agro- ecossistemas (Victor & Reuben, 2000). Entre os insetos, Coleoptera é a ordem dos be- souros ou cascudos. Há inúmeras espécies de cole- ópteros fitófagos, sendo que em muitos casos, tanto as larvas quanto os adultos alimentam-se de plantas. Nessa ordem, há insetos-praga de diferentes hábitos: filófagos, rizófagos, xilófagos, carpófagos, entre ou- tros. Há também várias espécies que atacam produ- tos armazenados. Entre as famílias, destaca-se Curcu- lionidae, dos gorgulhos ou bicudos, que é a maior família do mundo, com cerca de 50.000 espécies des- critas, sendo a maioria das espécies fitófagas, e as larvas geralmente desenvolvem-se no interior de par- tes vegetais, como brocas. Na ordem Coleoptera também há insetos que são inimigos naturais, pois atuam no controle biológico como predadores de outros insetos. Nesse caso des- tacam-se as famílias Carabidae e Coccinellidae (joani- nhas), onde a maioria das espécies, tanto na fase de larva como de adulto, são predadoras de insetos-pra- ga. Em Diptera, a ordem das moscas e mosquitos, também há insetos-praga e inimigos naturais. Entre os insetos fitófagos destaca-se a família Tephritidae, das moscas-das-frutas. Entre os inimigos naturais des- tacam-se as famílias Syrphidae, com espécies cujas larvas são predadoras, e Tachinidae, com espécies que desenvolvem-se como parasitóides. A ordem Hemiptera é composta por insetos de hábito sugador. Anteriormente, Hemiptera era a or- dem apenas dos percevejos. Atualmente, inclui tam- bém cigarras, cigarrinhas, pulgões, cochonilhas, psilí- deos e moscas-brancas, que pertenciam à ordem Ho- moptera, atualmente não mais considerada como or- dem em Insecta. Além dos danos diretos causados pelos insetos fitófagos da ordem Hemiptera, que sugam líquidos de diferentes partes vegetais, também há os danos indiretos, principalmente relacionados à transmissão de fitopatógenos. Em Hemiptera, inimigos naturais ocorrem ape- nas na subordem dos percevejos (Heteroptera), onde em algumas famílias há espécies predadoras de inse- tos (sugam hemolinfa). No entanto, tais famílias não são exclusivas de espécies entomófagas. Em Reduvii- dae há também espécies hematófagas (os barbeiros) e em outras, como Pentatomidae, há um grande nú- mero de espécies fitófagas. Em Hymenoptera estão as abelhas, vespas, vespinhas e formigas. Nessa or- dem há diversas espécies que atuam como poliniza- dores. Entre os fitófagos destaca-se a família Formici- dae, que inclui as formigas-cortadeiras. Mas é no con- trole biológico que a ordem Hymenoptera destaca- se, pela grande quantidade de famílias e espécies de parasitóides. Entre os predadores, destaca-se a famí- lia Vespidae. Na ordem Isoptera estão os cupins, com espécies consideradas pragas de diversas culturas, como pas- tagens, cana-de-açúcar e florestais. Em Lepidoptera, a ordem das mariposas e bor- boletas, estão espécies de insetos-praga com diferen- tes hábitos alimentares, como filófagos, xilófagos, car- pófagos, rizófagos, minadores de folhas, espécies que atacam produtos armazenados, entre outras. No entanto, os danos dos lepidópteros às cultu- ras são causados quase que exclusivamente pelas formas jovens, conhecidas como lagartas. Entre as famílias de Lepidoptera destaca-se Noctuidae, que inclui diversas espécies que cau- sam danos a culturas de grande importância eco- nômica. Em Noctuidae estão a lagarta-da-soja (An- ticarsia gemmatalis) e Spodoptera frugiperda, uma praga polífaga conhecida como lagarta-militar, la- garta-do-cartucho-do-milho ou lagarta-da-folha- do-arroz. A ordem Neuroptera é composta por insetos predadores, com destaque para a família Chryso- pidae, cujas larvas são conhecidas como bicho- lixeiro, pois carregam os restos mortais das pre- sas aderidos ao corpo. Em Orthoptera, ordem dos gafanhotos, gri- los, esperanças e grilotalpas, as espécies de inse- tos-praga são normalmente polífagas, com desta- que para as famílias Acrididae, do gafanhoto-cri- oulo e Gryllotalpidae, dos grilotalpas ou cachor- rinhos-da-terra. Na ordem Thysanoptera estão os insetos co- nhecidos como tripes ou trips, sendo a maioria das espécies fitófagas e algumas associadas à trans- missão de viroses de plantas. A ordem Araneae conta com mais de 38.834 es- pécies, incluídas em 3.694 gêneros e 109 famílias no mundo (Platnick, 2008). Elas estão distribuí- das em agroecossistemas terrestres e são conside- radas um dos mais abundantes grupos de inver- tebrados predadores, além de possuírem a vanta- gem de não danificar as plantas e controlarem eventuais explosões populacionais de insetos, li- mitando o canibalismo e territoriedade. No en- tanto, os pesticidas não seletivos têm sido consi- derados um risco para as espécies de aranhas benéficas. Fritz et al. (2008) analisaram as popula- ções de aranhas em lavouras orízicolas orgânicas e convencionais (com aplicação de inseticida), coletadas de 3 regiões produtoras de arroz irriga- do do RS. Nesses agroecossistemas foram coleta- das 1148 aranhas, entre jovens e adultos, haven- do maior abundância em lavouras orgânicas (765) que diferiram significativamente das lavouras com aplicações de inseticidas (383). Das 12 famílias registradas predominaram Araneidae e Tetragna- thidae que foram fortemente afetadas pelos inse- ticidas, reduzindo em até 80% da população (Fi- gura 2). 1.4 Bactérias Entomopatogênicas As toxinas bacterianas com atividade insetici- da potencialmente aplicadas no controle de inse- tos-praga das plantas cultivadas e vetores de do- enças animais e humanas foram casualmente des- cobertas no final do século XIX, através das inves- tigações das doenças que ocorriam nas criações de abelhas melíferas (Apis mellifera) e do bicho- da-seda (Bombyx mori). A documentação da taxonomia geral bacteri- ana efetuada por Breed et al. (1957) e o levanta- mento de espécies de bactérias relacionadas com insetos hospedeiros descrito por Steinhaus (1947), podem ser considerados trabalhos pioneiros e fun- damentais à taxonomia de bactérias que causam doenças em insetos. A taxonomia bacteriana mo- derna baseia-se em critérios morfológicos, fisioló- gicos, sorológicos e genéticos. Atualmente são conhecidas inúmeras espéci- es de bactérias associadas a insetos, porém pou- cas apresentam as características desejáveis à apli- cação no controle biológico de pragas, sendo na classificação das bactérias entomopatogênicas, os critérios de Falcon (1971) os mais viáveis por agru- parem as bactérias em apenas duas categorias: es- porulantes e não-esporulantes. Entre essas cate- gorias destacam-se com maior importância à pa- tologia de insetos as espécies das famílias Bacilla- ceae e Enterobacteriaceae. As bactérias esporulantes apresentam uma ca- racterística de persistência, as quais podem se man- ter em condições ambientais adversas através de estruturas de resistência denominadas endóspo- ros. Esta característica dessa categoria de bactérias vem sendo considerada um pré-requisito à pro- dução de agentes microbianos em escala comer- cial. Como característica de bactérias entomopato- gênicas potencialmente aplicadas no controle mi- crobiano de insetos, destacam-se as espécies que apresentam alta virulência, elevada capacidade in- vasora e produção de toxinas, causando toxemias nos insetos alvo. Com essas características, na ca- tegoria de bactérias esporulantes destacam-se como gêneros de maior importância: Bacillus e Clostri- dium. 1.4.1. Gênero Bacillus Bacillus spp., em geral aeróbicas ou facultati- vamente anaeróbicas, encontram-se em substra- tos variáveis devido ao complexo enzimático pro- duzido pelas células em forma de bastonetes, po- dendo essas se apresentarem individuais ou em cadeias. Esse gênero apresenta uma grande varia- ção entre as espécies, porém as características en- tomopatogênicas associadas à formação de endós- 6 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38 Figura 2. Araneofauna em sistema de cultivo orgânico e convencional de arroz irrigado, RS Figura 3. Bacillus thuringiensis em microscopia eletrônica de transmissão poros e a produção de toxinas e enzimas deter- minam as seguintes espécies como promissoras ao controle de insetos prejudiciais: A. Bacillus thuringiensis Este microrganismo foi descoberto em 1902 por Ishiwata no Japão, através da criação massal de Bombix mori. Em 1911, B. thuringiensis foi novamente isolado por Berliner a partir de larvas de Ephestia kuehniella, na cidade de Thüringe, na Alemanha, de onde é originário seu atual nome. Os primeiros ensaios utilizando B. thurin- giensis foram realizados na Europa entre os anos de 1920 e 1930, no controle de Ostrinia nubila- lis, lepidóptero da família Pyralidae. Nos Estados Unidos e na Europa, entre os anos de 1930 e 1940, numerosos testes foram realizados contra outras espécies de lepidópteros. Atualmente, no caso do controle biológico, B. thuringiensis é o microrganismo mais utilizado em nível mundial . Para os microbiologistas, B. thuringiensis (Fi- gura 3) é uma bactéria gram-positiva, esporulan- te, aeróbica ou facultativamente anaeróbica, na- turalmente encontrado no solo. As espécies thu- ringiensis, cereus e anthracis do gênero Bacillus apresentam um grau de parentesco tão elevado, que muitas vezes dificulta, se não impossibilita, diferenciá-las através de provas bioquímicas e bac- teriológicas mais simples. Durante muito tempo, as duas primeiras espécies foram consideradas como sendo uma única. O principal critério utili- zado para a distinção entre essas bactérias é a produção de corpos de inclusões paraesporais durante o processo de esporulação do B. thurin- giensis. No controle microbiano dos insetos, o ento- mopatógeno Bacillus thuringiensis (Bt) oferece as melhores alternativas como bioinseticida, mos- trando-se também um bom candidato à obten- ção de formulações comerciais, bem como à en- genharia genética de plantas. B. Bacillus cereus B. cereus pode ser considerado como pató- geno facultativo, devido ao seu hábito saprofíti- co e à adaptação à vida parasítica das linhagens entomopatogênicas, sendo atualmente ainda uti- lizado como opcional no controle de alguns le- pidópteros, coleópteros e himenópteros quando o B. thuringiensis mostra-se ineficaz. O ingrediente ativo responsável pela viru- lência dessa bactéria corresponde a ação enzi- mática da lecitinase, descrita por Heimpel (1954, 1955). Em 1989, Rahmet-Alla & Rowley descre- veram que a fosfolipase C de B. cereus estaria relacionada a sua atividade entomopatogênica. Essa bactéria caracteriza-se por apresentar célu- las em forma de bastonetes com esporos cen- trais, não-cristalíferas e ausência de esporângio estendido. Alguns autores mencionam que além da lecitinase que levou certas linhagens a vida parasítica, o endósporo dessa bactéria contém proteína tóxica de baixa atividade específica, es- truturalmente semelhante ao cristal de B. thurin- giensis. Diversos estudos do modo de ação B. cereus mencionam que essa espécie não tolera meio al- calino e a enzima para ser ativa exige um pH entre 6,6 e 7,4, tornando essa bactéria específica a insetos cujo conteúdo intestinal encontra-se na faixa neutra, quando então são provocadas alte- rações no epitélio do intestino médio das larvas sensíveis, sendo os sintomas patológicos variá- veis em função do modo de infecção por esse patógeno. C. Bacillus larvae Essa bactéria apresenta esporos centrais ou terminais que variam de elípticos a cilíndricos num esporângio distinto, sem corpo de inclusão para- esporal (cristal). Quando os esporos de B. larvae são ingeridos pelas larvas e pupas das abelhas, causam a doença americana das abelhas ou pú- trida dos berçários. D. Bacillus alvei Essa espécie caracteriza-se por apresentar es- poros centrais ou sub-terminais que variam de elípticos a cilíndricos. Essa espécie causa doença européia das crias das abelhas. E. Bacillus popilliae e Bacillus lentimorbus Essas espécies são patógenos obrigatórios, crescem pouco em meio de cultura, e têm como características esporos elípticos a cilíndricos, em esporângio nítido num bastonete. B. popilliae cau- sa a doença leitosa do tipo A e B. lentimorbus causa a doença leitosa tipo B, ambas em larvas de escarabeídeos. As características de resistência dos esporos ao calor, à dessecação e à radiação, além da sua longevidade em larvas mortas e par- tículas de solo, tornam essas bactérias agentes promissores no controle de larvas de Popillia ja- ponica e Amphimallon mojalis (na Europa e Aus- trália), além de Eutheola humilis, Stenocrates spp. e Migdolus morretesi (no Brasil). O mecanismo de ação é semelhante em am- bas às espécies, cujas bactérias atuam por inges- tão, passando do trato digestivo à hemolinfa, mul- tiplicando-se, esporulando, causando a septice- mia e morte dos insetos. F. Bacillus sphaericus Trata-se de uma espécie que apresenta espo- ros esféricos em posição terminal num esporân- gio distendido. Certas cepas dessa espécie pro- duzem inclusões cristalinas (ou cristais), compos- tas por dois peptídeos de 42 e 51 kDa que repre- sentam a toxina binária, com ação inseticida. Há cepas que sintetizam proteínas inseticidas de 100kDa. Essa bactéria é cosmopolita, tendo sido iso- lada de solo, água e do seu hospedeiro natural (pernilongos mortos). As cepas foram classifica- das por sorotipos conforme o antígeno flagelar, totalizando atualmente cerca de 50 sorotipos, en- tre os quais 7 contêm cepas ativas contra larvas de dípteros e as cepas mais tóxicas apresentam como particularidade inclusões paraesporais crista- linas. Existem mais de 300 cepas de B. sphaericus catalogadas pelo Instituto Pasteur (Paris, França), sendo 50% dessas tóxicas às larvas de dípteros. 1.4.2 Gênero Clostridium O gênero Clostridium compreende cerca de 100 espécies distribuídas em 19 grupos de acordo com a homologia de ARN16s. As células são em forma de bastonetes, geralmente Gram-positivas, com en- dósporos ovais ou esféricos que as deformam. As espécies desse gênero são estritamente anaeróbias, havendo algumas que toleram a presença de oxi- gênio livre, porém não formam esporos. Essas bac- térias são encontradas naturalmente no solo, sedi- mentos marinhos, restos animais e vegetais, assim como na flora intestinal de vertebrados e inverte- brados, como os insetos. Os efeitos entomopatogênicos de C. brevifas- ciens e C. malacosomae foram observados em lar- vas de Malacosoma pluviale, havendo a germina- ção dos esporos na luz intestinal e o rápido cresci- mento vegetativo, o qual causa a morte em poucos dias, sem haver invasão na cavidade do corpo do inseto. Alguns autores citam que C. bifermentans malaysia sintetiza uma proteína tóxica às larvas de Aedes aegypti, Culex pipiens e Anopheles stephensi, a qual apresenta elevada similaridade as delta-en- dotoxinas sintetizadas pelo entomopatógeno B. thu- ringiensis. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38 7 ORDEM COLEOPTERA – besouros Características gerais • Asas anteriores do tipo élitros (consistência coriácea ou córnea) e posteriores membranosas; • Aparelho bucal mastigador; • Metamorfose completa : Holometábolos (ovo, larva, pupa, adulto); • Mais de 300.000 espécies descritas. Subordem Adephaga Características gerais • Porção ventral do segmento abdominal (urosternito) basal divido pelas cavidades coxais do terceiro par de pernas; • Em geral, predadores. Principal família de importância agrícola • Carabidae: adultos e larvas predadores (Ver Tabela 2) Subordem Polyphaga Características gerais • Porção ventral do segmento abdominal (urosternito) basal não divido pelas cavidades coxais do terceiro par de pernas; • Maioria das famílias de Coleoptera. Principais famílias de importância agrícola • Anobiidae: Lasioderma serricorne – besouro-do-fumo • Bostrichidae: Rhyzopertha dominica - besourinho-do-trigo • Buprestidae: Colobogaster cyanitarsis – broca-da-figueira • Bruchidae: Acanthoscelides obtectus – caruncho-do-feijão • Cerambycidae: Oncideres impluviata - serrador-da-acácia-negra • Chrysomelidae: Diabrotica speciosa – vaquinha ou brasileirinho • Coccinellidae: joaninhas – larvas e adultos predadores (Ver Tabela 2) Epilachna cacica – joaninha-das-cucurbitáceas (fitófaga) • Curculionidae: Anthonomus grandis – bicudo-do-algodoeiro Oryzophagus oryzae – gorgulho-aquático (adulto), bicheira-da-raiz-do-arroz (larva) Sitophilus zeamais – gorgulho-do-milho • Elateridae: Conoderus scalaris - larva-arame • Meloidae: Epicauta atomaria – burrinho • Scarabaeidae: Euetheola humilis – cascudo-preto-do-arroz • Scolytidae: Hypothenemus hampei – broca-do-café • Tenebrionidae: Tribolium castaneum - besouro-do-milho Observação: As outras duas subordens (Archostemata e Myxophaga) têm pouco mais de 50 espécies descritas. ORDEM DIPTERA – moscas e mosquitos Características gerais • Asas anteriores membranosas; • Asas posteriores modificadas em halteres ou balancins; • Aparelho bucal sugador labial; • Metamorfose completa: Holometábolos (ovo, larva, pupa, adulto). Subordem Nematocera – mosquitos, pernilongos e borrachudos Característica geral • Antenas mais longas que o tórax. Principal família de importância agrícola • Cecidomyiidae: Jatrophobia brasiliensis – mosca-das-galhas-da-folha-da-mandioca Stenodiplosis sorghicola – mosca-do-sorgo Subordem Brachycera – moscas Característica geral • Antenas curtas, com arista ou estilo no último segmento. Principais famílias de importância agrícola • Agromyzidae: Liriomyza trifolii - mosca-minadora • Syrphidae: larvas predadoras (Ver Tabela 2) Quadro 1. Caracterização das principais ordens e subordens de insetos de importância agrícola, com exemplos de famílias e espécies 10 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38 ORDEM NEUROPTERA Características gerais • Asas membranosas com sistema variado de nervuras ; • Metamorfose completa: Holometábolos (ovo, larva, pupa, adulto); • Larvas predadoras. Principal família de importância agrícola • Chrysopidae – predadores (ver Tabela 2) ORDEM ORTHOPTERA – gafanhotos, grilos, esperanças e grilotalpas Características gerais • Terceiro par de pernas saltatorial; • Antenas filiformes ou setáceas; • Aparelho bucal mastigador; • Asas com par anterior do tipo tégmina e posterior membranosa; • Metamorfose incompleta: Hemimetábolos (ovo, ninfa, adulto). Subordem Caelifera - gafanhotos Características gerais • Antenas curtas; • Tímpanos, quando presentes, localizados no primeiro segmento do abdome. Principal família de importância agrícola • Acrididae: Rhammatocerus schistocercoides – gafanhoto-crioulo Subordem Ensifera - esperanças, grilos e grilotalpas Características gerais • Antenas longas; • Tímpanos, quando presentes, localizados nas tíbias anteriores. Principal família de importância agrícola • Gryllotalpidae – Neocurtilla hexadactyla – grilotalpa ou cachorrinho-da-terra ORDEM THYSANOPTERA - tripes ou trips Características gerais • Aparelho bucal sugador labial triqueta (raspador-sugador); • Antenas filiformes ou moniliformes; • Asas franjadas; • Metamorfose incompleta: Hemimetábolos (ovo-ninfa-ninfa imóvel-adulto). Subordem Tubulifera Característica geral • Último segmento abdominal em forma de tubo. Subordem Terebrantia Característica geral • Último segmento abdominal arredondado ou cônico. Principal família de importância agrícola • Thripidae: Frankliniella schultzei Thrips palmi Thrips tabaci Croft, 1990; Heinrichs, 1994; Gallo et al., 2002; Heinrichs & Barrion, 2004; Lucho, 2004. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38 11 Tabela 1: Alguns insetos vetores de fitopatógenos INSETOS VETORES Acrogonia citrina (Hem.: Cicadellidae) Aphis gossypii (Hem.: Aphididae) Bemisia tabaci (Hem.: Aleyrodidae) Cerotoma arcuata(Col.: Chrysomelidae) Dalbulus maidis(Hem.: Cicadellidae) Diabrotica speciosa (Col.: Chrysomelidae) Diaphorina citri (Hem.: Psyllidae) Dilobopterus costalimai(Hem.: Cicadellidae) Frankliniella occidentalis(Thy.: Thripidae) Frankliniella schultzei(Thy.: Thripidae) Hypocryphalus mangiferae (Col.: Scolytidae) Myzus persicae (Hem.: Aphididae) Myndus crudus(Hem.: Cixiidae) Oncometopia facialis (Hem.: Cicadellidae) Planococcus ficus (Hem.: Pseudococcidae) Pseudococcus longispinus(Hem.: Pseudococcidae) Rhopalosiphum maidis(Hem.: Aphididae) Thrips palmi(Thy.: Thripidae) Toxoptera citricidus(Hem.: Aphididae) PATÓGENOS Bactéria - Xylella fastidiosa Cucumber mosaic virus (CMV) Papaya ringspot virus – type P (PRSV-P) Passion fruit woodiness virus (PWV) Bean golden mosaic virus (BGMV) Bean rugose mosaic virus (BRMV) Fitoplasma Maize rayado fino virus (MRFV) Spiroplasma kunkelii Bean rugose mosaic virus (BRMV) Bactéria - Candidatus liberibacter spp. Bactéria - Xylella fastidiosa Tospovírus Tospovírus Fungo: Ceratocystis fimbriata Papaya ringspot virus – type P (PRSV-P) Passion fruit woodiness virus (PWV) Potato leafroll virus (PLRV) Potato virus Y (PVY) Soybean mosaic virus (SMV) Phytoplasma palmae Bactéria - Xylella fastidiosa Grapevine leafroll-associated virus (GLRaV) Grapevine leafroll-associated virus (GLRaV) Soybean mosaic virus (SMV) Sugarcane mosaic virus (SCMV) Tospovírus Citrus tristeza virus (CTV) Papaya ringspot virus – type P (PRSV-P) Passion fruit woodiness virus (PWV) DOENÇAS Clorose variegada dos citros (CVC) Mosaico da bananeira Mosaico do mamoeiro Endurecimento dos frutos Mosaico dourado do feijoeiro Mosaico rugoso da soja Enfezamento vermelho do milho Risca do milho Enfezamento pálido Mosaico rugoso da soja Greening ou Huanglongbing (HLB) Clorose variegada dos citros (CVC) Vira-cabeça Vira-cabeça Seca da mangueira Mosaico do mamoeiro Endurecimento dos frutos Enrolamento da folha da batateira Mosaico do pimentão Mosaico comum da soja Amarelecimento letal Clorose variegada dos citros (CVC) Enrolamento da folha Enrolamento da folha Mosaico comum da soja Mosaico comum Vira-cabeça Tristeza dos citros Mosaico do mamoeiro Endurecimento dos frutos CULTURAS Citros Bananeira Mamoeiro Maracujazeiro Feijoeiro Feijoeiro e soja Milho Milho Milho Feijoeiro e soja Citros Citros Fumo, tomate e outras solanáceas Fumo, tomate e outras solanáceas Mangueira Mamoeiro Maracujazeiro Batata Solanáceas Soja Coqueiro Citros Videira Videira Soja Milho, sorgo, cana-de-açúcar Fumo, tomate e outras solanáceas Citros Mamoeiro Maracujazeiro ORDENS E FAMÍLIAS PREDADORES PRESAS Coleoptera Carabidae Callida scutellaris lagartas Calosoma granulatum lagartas Lebia concina lagartas Coccinellidae (joaninhas) Azya luteipes cochonilhas Eriopis connexa pulgões Cycloneda sanguinea pulgões Pentilia egena cochonilhas Rodolia cardinalis cochonilhas Dermaptera Forficulidae (tesourinhas) Doru luteipes lagartas e ovos Diptera Syrphidae Pseudodoros clavatus pulgões Salpingogaster nigra ninfas de cigarrinhas Hemiptera Anthocoridae Orius insidiosus lagartas, ovos, tripes, pulgões Lygaeidae Geocoris sp. lagartas e ovos Nabidae Nabis sp. lagartas e ovos Pentatomidae Podisus nigrispinus lagartas e ovos Reduviidae Zelus sp. lagartas, coleópteros Hymenoptera Vespidae Polistes sp. lagartas Polybia sp. lagartas Neuroptera Chrysopidae Chrysopa sp. pulgões, cochonilhas, moscas-brancas Chrysoperla sp. pulgões, cochonilhas, moscas-brancas Tabela 2: Alguns insetos predadores e suas presas Kimati et al., 1997; Gallo et al., 2002; Oliveira et al., 2003. Gallo et al., 2002; Silva et al., 2002; De Bortoli et al., 2008. 12 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38 ORDENS E FAMÍLIAS Hymenoptera Aphelinidae Bethylidae Braconidae Chalcididae Encyrtidae Eulophidae Ibaliidae Ichneumonidae Scelionidae Trichogrammatidae Diptera Tachinidae PARASITÓIDES Aphelinus mali Encarsia (Prospaltella) berlesei Vespa-de-uganda Prorops nasuta Apanteles sp. Aphidius sp. Apanteles subandinus Chelonus insularis Colastes letifer Cotesia flavipes Diachasmimorpha longicaudata Hypomicrogaster hypsipylae Brachymeria pseudoovata Ageniaspis citricola Proacrias coffeae Tetrastichus giffardianus Ibalia leucospoides Campoletis flavicincta Coccygomimus tomyris Microcharops bimaculata Telenomus podisi Trissolcus basalis Trissolcus urichi Trichogramma galloi Trichogramma pretiosum Archytas incertus Archytas lopesi Archytas pseudodaemon Hemisturmia sp. Lespesia affinis Trichopoda nitens Xanthozona melanopyga HOSPEDEIROS Pulgão-lanígero Eriosoma lanigerum(Hem.: Aphididae) Cochonilha-branca Pseudaulacaspis pentagona (Hem.: Diaspididae) Broca-do-café Hypothenemus hampei (Col.: Scolytidae) Mandarová-do-fumo Manduca sexta (Lep.: Sphingidae) Pulgão-verdeMyzus persicae (Hem.: Aphididae) Pulgão-do-algodoeiroAphis gossypii(Hem.: Aphididae) Pulgão-da-espigaSitobion avenae(Hem.: Aphididae) Traça-da-batataPhthorimaea operculella(Lep.: Gelechiidae) Lagarta-do-cartucho-do-milho Spodoptera frugiperda(Lep.: Noctuidae) Bicho-mineiro Leucoptera coffeella(Lep.: Lyonetiidae) Broca-da-cana Diatraea saccharalis(Lep.: Crambidae) Mosca-do-mediterrâneo Ceratitis capitata (Dip.: Tephritidae) Broca-do-cedroHypsipyla grandella(Lep.: Pyralidae) Traça-dos-cachos Cryptoblabes gnidiella(Lep.: Pyralidae) Minador-dos-citros Phyllocnistis citrella(Lep.: Gracillariidae) Bicho-mineiro Leucoptera coffeella(Lep.: Lyonetiidae) Mosca-do-mediterrâneo Ceratitis capitata(Dip.: Tephritidae) Vespa-da-madeira Sirex noctilio(Hym.: Siricidae) Lagarta-do-cartucho-do-milho Spodoptera frugiperda(Lep.: Noctuidae) Lagarta-cachorrinho Eupseudosoma aberrans (Lep.: Arctiidae) Lagarta-mede-palmo Sabulodes caberata caberata (Lep.: Geometridae) Lagarta-da-soja Anticarsia gemmatalis(Lep.: Noctuidae) Percevejo-marrom Euschistus heros(Hem.: Pentatomidae) Percevejo-do-colmoTibraca limbativentris(Hem.: Pentatomidae) Percevejo-verde-da-soja Nezara viridula (Hem.: Pentatomidae) Percevejo-do-colmoTibraca limbativentris(Hem.: Pentatomidae) Broca-da-cana Diatraea saccharalis(Lep.: Crambidae) Broca-pequena-do-fruto Neoleucinodes elegantalis(Lep.: Crambidae) Lagarta-da-espiga-do-milho Helicoverpa zea(Lep.: Noctuidae) Lagarta-do-cartucho-do-milho Spodoptera frugiperda(Lep.: Noctuidae) Lagarta-das-folhas Rolepa unimoda(Lep.: Lymantriidae) Lagarta-cachorrinho Eupseudosoma aberrans (Lep.: Arctiidae Mariposa-violácea Sarsina violascens(Lep.: Lymantriidae) Lagarta urticante Lonomia circumstans(Lep.: Saturniidae) Lagarta-cachorrinho Eupseudosoma aberrans (Lep.: Arctiidae) Percevejo-verde-da-soja Nezara viridula (Hem.: Pentatomidae) Lagarta-das-palmeiras Brassolis sophorae(Lep.: Nymphalidae) CULTURAS Macieira e outras rosáceas Pessegueiro, amoreira e outras frutíferas Cafeeiro Fumo Diversas culturas, como as solanáceas Diversas culturas, como algodão, solanáceas e cucurbitáceas Diversas culturas, como trigo, aveia, cevada Batata Diversas culturas, como milho, arroz, algodoeiro Cafeeiro Cana-de-açúcar, milho e outras Poaceae (gramíneas) Frutíferas diversas Cedro, mogno e outras espécies florestais Videira Citros Cafeeiro Frutíferas diversas Pinus Diversas culturas, como milho, arroz, algodoeiro Eucalipto Eucalipto Soja e outras Fabaceae (leguminosas) Soja Arroz Diversas culturas, como soja e mamoeiro Arroz Cana-de-açúcar, milho e outras Poaceae (gramíneas) Tomateiro e outras solanáceas Milho, sorgo e outras Poaceae (gramíneas) Diversas culturas, como milho, arroz, algodoeiro Ipê Eucalipto Eucalipto Cafeeiro Eucalipto Diversas culturas, como soja e mamoeiro Coqueiro, dendezeiro e outras palmeiras Tabela 3: Alguns insetos parasitóides e seus respectivos hospedeiros Sampaio et al., 2001; Gallo et al., 2002; Rodrigues et al., 2004; Pratissoli et al., 2005; Carvalho, 2005; Maciel et al., 2007. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38 15 Hu et al., 2004). As espécies, B. ce- reus e B. thuringiensis são fenotipi- camente e geneticamente muito simi- lares entre si, havendo dificuldade na distinção entre as duas espécies (Le- cadet et al., 1999; Shisa et al., 2002). No entanto, B. cereus é considerado patógeno facultativo devido ao seu hábito saprofítico no solo e parasita de linhagens de insetos, possuindo uma proteína tóxica de baixa ativida- de específica (Habib & Andrade, 1998). Esta espécie não produz inclu- sões paraesporais inseticidas atuando através de ação enzimática (Guttmann & Ellar, 2000; Shisa et al., 2002). Mui- tas cepas de B. cereus são considera- das patógenas oportunistas de mamí- feros, causando intoxicações alimen- tares seguidas de vômitos e diarréias, dificultando o seu emprego no con- trole de insetos-praga (Hansen & Hen- driksen, 2001). As informações sobre o destino das toxinas de B. thuringiensis no solo são limitadas, embora alguns traba- lhos mostrem que elas unem-se a áci- dos húmicos e suplementos orgâni- cos ou partículas do solo, que as pro- tegem da degradação sem perder sua atividade inseticida (Polanczyk & Al- ves, 2003). De modo geral, as bacté- rias entomopatogênicas permanecem no solo por meses ou anos após a sua liberação. B. thuringiensis é ca- paz de permanecer viável por mais de três anos após liberado (Fuxa, 1992). A sensibilidade dos esporos desse entomopatógeno à radiação solar e à dessecação está associada com os plasmídeos, ocorrendo trocas na composição química da cobertura dos esporos, reduzindo sua tolerân- cia aos fatores físicos do ambiente. Nas folhas, a limitação dos esporos pode ocorrer pelo tipo de folha e seus exudados, os quais contém inibido- res da germinação de esporos (Yá- nez & Cabriales, 2000). Considerando a hipótese de que os esporos do B. thuringiensis encon- tram-se no ambiente como resultado da morte do inseto alvo, espera-se que a distribuição dessa bactéria ocorra aleatoriamente, e que os isolados de um mesmo lugar sejam similares (Fiu- za, 2001). No entanto, os isolados de B. thuringiensis têm sido encontrados em todos os tipos de solos e regiões do mundo, incluindo tundra ártica, es- tepe, regiões temperadas e tropicais, savanas e desertos quentes. Sua abran- gência foi relatada em áreas da Es- candinávia a Nova Zelândia e da Is- lândia a Cadeias Montanhosas. No en- tanto, ele é raramente encontrado em areias de praias e camadas de solo abaixo de 10 cm de profundidade (Landén et al., 1994; Chilcott & Ellar, 1998). B. thuringiensis tem sido freqüen- temente isolado de florestas, áreas ur- banas, campos e principalmente de lavouras agrícolas (Martin, 1994; Fiu- za, 2001). Em um levantamento do Banco de Bactérias Entomopotagonênicas da Microbiologia da UNISINOS (BBE- MU), foram analisadas 278 amostras de solo, oriundas de 29 municípios, de cinco regiões produtoras de arroz irrigado do RS. Foram isoladas 674 amostras de bactérias esporulantes, a maioria pertencente ao Litoral Norte (41%), seguido do Litoral Sul (21%), da Campanha (14,4%), da Depressão Central (14%) e da Fronteira Oeste (10%) (Figura 1). Dessas, 31,1% correspondem a B. thuringiensis; 6% a B. cereus; 4% a B. sphaericus e 58,9% equivalem a ou- tras espécies de Bacillus (Fritz et al., 2007). Outras pesquisas em solos de áreas de arroz irrigado revelam a ampla ocorrência de Bacillus no RS. Em 2006, Azambuja estudou a fre- qüência de isolados de Bacillus spp. durante o período que compreende o ciclo do cultivo do arroz irrigado no sistema convencional e obteve 245 colônias de bactérias esporulantes, onde 143 pertenciam ao gênero Ba- Figura 1. Bactérias esporulantes provenientes de amostras de solo em regiões produtoras de arroz irrigado do RS Figura 2. Freqüência de Bacillus spp. nos diferentes sistemas de cultivo e fases da cultura do arroz irrigado no RS; (C) pousio, (SCC) sistema de cultivo convencional, (SCG) sistema de cultivo pré-germinado, (SCD) sistema de cultivo direto 16 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38 cillus, entre as quais foram identifica- das 26,6% como B. thuringiensis; 4,2% como B. sphaericus e 69,2% foram agrupadas como outras espécies de Bacillus. Silva et al. (2002) reforçam a pre- dominância de B. thuringiensis (9,1%) em solos de todas as regiões brasilei- ras se comparado a B. sphaericus (5,1%), com exceção da região Sul do país que B. sphaericus (10,1%) foi mais freqüente que B. thuringiensis (4,6%). No entanto, em solos agríco- las de diferentes áreas da Argentina a freqüência de B. sphaericus foi maior (2,1%) em relação à de B. thuringi- ensis (1,6%) conforme os dados de Dias et al. (1999). Como foi verificada nas diversas pesquisas, a freqüência de B. thurin- giensis em vários locais e as diferen- ças encontradas podem ser atribuídas a inúmeros fatores, incluindo varia- ções geográficas, climáticas, ativida- de agrícola, tipo de solo e método de isolamento. Contudo, Martin (1984) discute que B. thuringiensis não pos- sui um habitat natural bem definido, pois esse entomopatógeno é caracte- rizado como um microrganismo sa- profítico, sem exigências nutricionais restritas, podendo adaptar-se a dife- rentes condições ambientais. Diante disso, ainda que os ento- mopatógenos apresentados possuam semelhanças quanto à biologia e modo de ação, eles diferem entre si por características particulares de cada espécie. Estudos ecológicos facilitam a compreensão dessas bactérias no ambiente, suas relações patógeno/ hospedeiro e a estrutura de popula- ções, permitindo conhecer o compor- tamento de microrganismos naturais e novos isolados, sejam eles modifi- cados geneticamente ou introduzidos através de programa de controle mi- crobiano (Sosa-Gómez et al., 1998). Ainda assim, as bactérias entomopa- togênicas do gênero Bacillus são matéria-prima à industrialização de inseticidas bacterianos. Seus efeitos sobre as larvas são tão pronunciados que as indústrias de inseticidas con- vencionais buscam ampliar suas utili- zações com o objetivo de controlar as pragas da agricultura e vetores de agentes etiológicos de doenças huma- nas e vegetais. 1.2 Bacillus spp. em amostras de solos de agroecossistemas O crescente aumento de áreas agrí- colas vem causando diversos efeitos ambientais, como a mudança micro- biana do solo que é mediada por di- versos processos e funções (Motavalli et al., 2004). Em agroecossistemas, as mudanças significativas e perceptíveis na comunidade microbiana do solo estão relacionadas com as condições ambientais, sendo conseqüência prin- cipalmente do uso das práticas de manejo desse ambiente (Atlas et al., 1991). Práticas agrícolas, tais como tipo de manejo do solo, rotação de culturas, aplicação de agrotóxicos e uso de maquinários interferem na microbiota terrestre, afetando a qua- lidade do solo, modificando as pro- priedades físicas, químicas e biológi- cas (Valarini et al., 2002; Andréa & Hollweg, 2004). Dessa forma, ocor- rem variações no número de indiví- duos ou na dinâmica bioquímica na- tural da comunidade de microrganis- mos. Porém, pouco é conhecido so- bre a distribuição desses microrganis- mos terrestres e a maneira com que eles respondem as mudanças de ma- nejo na terra (Buckley & Schmidt, 2003). Diversas populações de bactérias formadoras de endósporos ocorrem em áreas agrícolas e podem contri- buir diretamente ou indiretamente na produtividade das culturas (Gardener, 2004). As bactérias gram-positivas for- mam uma parte importante da micro- biota de solo, o qual constitui o prin- cipal ambiente natural que abriga bactérias do gênero Bacillus (Ibarra et al., 2003; Mohamed et al., 2007). Muitas espécies desse gênero são con- sideradas de importância prática (Cac- camo et al., 2001), já que espécies de Bacillus são utilizadas para a síntese de uma grande variedade de produ- tos médicos, agrícolas, farmacêuticos entre outros (Mohamed et al., 2007). No entanto, as transformações mi- crobianas ocorrem devido às diferen- tes populações que habitam o solo, e as suas distintas reações químicas po- dem ser alteradas sempre que o ecos- sistema sofrer algum tipo de interfe- Figura 3. Abundância de Bacillus thuringiensis em relação aos distintos tratamentos fitossanitários e período de irriga- ção do arroz no RS; (C) área controle, (H) área somente com herbicidas, (H+I) área com herbicidas e inseticida, (H+F) área com herbicidas e fungicida Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38 17 rência. Assim, na aplicação de diver- sos tipos de manejo, podem existir diferentes disponibilidades de subs- tratos que determinarão o favoreci- mento ou a inibição do estabeleci- mento dos diferentes grupos micro- bianos (Castro & Prado, 1993). Fritz (2007) analisou a abundân- cia de bactérias entomopatogênicas pertencentes ao gênero Bacillus ob- tidas de 36 amostras de solo coleta- das de diferentes sistemas de cultivo de arroz irrigado: sistema de cultivo convencional (SCC), sistema de culti- vo pré-germinado (SCG) e sistema de cultivo direto (SCD) e de uma área de pousio (sem cultivo) por aproxi- madamente 12 anos (C). Foram sele- cionadas 336 colônias pertencentes ao gênero Bacillus spp., onde foram identificadas, 35,42% como B. thurin- giensis, 16,96% como B. cereus, 9,52% como B. sphaericus e 38,10% como Bacillus sp. Todavia, não houve di- ferença significativa na freqüência de Bacillus spp. entre os sistemas de plantio (p>0,05), embora as fa- ses da cultura tenham influencia- do a abundância das espécies (P<0,01). A irrigação revelou-se capaz de favorecer a variação na abundância de Bacillus spp., prin- cipalmente no caso de B. sphaeri- cus, uma vez que representou 71,4% do total de isolados encon- trados durante a referida etapa da cultura (Figura 2). O fato dos solos agrícolas so- frerem mudanças nas suas propri- edades físicas e químicas pela in- trodução da cultura contribui para a diversidade de bactérias em fun- ção da aeração, profundidade e melhor distribuição ao longo das camadas (Kennedy, 1999). Pfüller et al. (2000) analisaram a freqüência de microrganismos utili- zando diferentes sistemas de plan- tio, e em seus estudos a população microbiana não diferiu significativa- mente, embora tenha ocorrido uma maior variação no SCC. No entanto, Garbeva et al. (2003) compararam a diversidade de Bacillus em solos agrícolas, e observaram maior nú- mero de esporos em solos que apre- sentavam cultivos, em tempo redu- zido em comparação aos cultivados em longo prazo. De acordo com Buckley & Tho- mas (2003), uma possível explica- ção para que as comunidades mi- crobianas em campos abandonados de cultivo continuem a apresentar freqüências semelhantes com cam- pos atualmente cultivados, se deve ao fato de que as comunidades mi- crobianas do solo respondem às ca- racterísticas do ambiente, que reque- rem longos períodos de tempo para recuperação dos efeitos antrópicos. Em geral, os microrganismos res- pondem de diversas formas à apli- cação de pesticidas em seu hábitat, podendo ocorrer principalmente se- leção de populações resistentes. Essa seleção pode ser em função de suas características fisiológicas e morfo- lógicas. Com o passar do tempo, a diversidade microbiana entra em equilíbrio, porém passa a ser com- posta por um menor número de es- pécies, mantendo-se por meses ou anos, atingindo o clímax a semelhan- ça da fase original (Borges et al., 2004). Por outro lado, alguns auto- res relatam que a diminuição das bactérias pode estar relacionada com a sensibilidade aos herbicidas, re- sultando na eliminação de algumas espécies. (Wardle & Parkinson, 1990). Nesse sentido, Azambuja (2006) avaliou a influencia do cultivo con- vencional de arroz irrigado sobre a abundância de bacilos entomopato- gênicos, em quatro áreas tratadas com distintos produtos fitossanitári- os e a fase de irrigação da cultura, concluindo que não houve diferen- ça significativa entre os parâmetros avaliados separadamente sobre a abundância de B. thuringiensis e B. sphaericus. No entanto, a interação entre os fatores apresentou signifi- Figura 4. Freqüencia de Bacillus spp. em amostras de água do Canal de Irrigação das 5 regiões produtoras de arroz do RS: Litoral Norte-LN, Campa- nha-CA, Fronteira Oeste-FO, Depressão Central- DC e Litoral Sul- LS Figura 5. Freqüencia de Bacillus spp. Isolados em amostras de água das Parcelas de cultivo de arroz, das 5 regiões produtora do RS: Litoral Norte-LN, Campanha-CA, Fronteira Oeste-FO, Depressão Central- DC e Litoral Sul- LS 20 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38 sões da tubulação de ferro corroído. Os autores concluíram que esses es- poros são capazes de persistir por longos períodos de tempo em pre- sença de altos níveis de cloro. Esse microrganismo pode desenvolver-se em águas ricas em nutrientes libera- dos pela decomposição de resíduos orgânicos, assim como foi citado para o solo, por Polanczyk & Alves (2003). Esses autores também levantaram a hipótese dessa bactéria ter algum tipo de relação simbiótica com plantas, o que explicaria a produção de toxinas tão específicas e eficientes. B. sphaericus é muito comum e de distribuição cosmopolita, sendo principalmente isolada do solo em sis- temas aquáticos ou mesmo de larvas de pernilongos mortos, seu hospedei- ro natural (Singer, 1981; Priest et al., 1997; Alves, 1998; Wirth et al., 2001; Partridge e Berry, 2002; Wei et al., 2006). B. cereus, de acordo Vilain et al. (2006), é uma bactéria de solo que pode ocorrer na rizosfera das plantas e algumas estirpes produzem antibi- óticos capazes de inibir o desenvol- vimento de doenças fúngicas na ri- zosfera; Galvão et al. (2006), em aná- lises microbiológicas de água de cul- tivo de mexilhões, detectaram B. ce- reus em 6,7% das amostras. Rowan et al. (2003) referem-se a B. cereus, como um grupo heterogêneo de bac- térias Gram-positivas, que devido a sua habilidade em formar esporos, to- lera melhor ambientes hostis do que outros entomopatógenos bacterianos não esporulantes. B. cereus é um pa- tógeno humano oportunista, que está presente no solo e na água, podendo proliferar em uma gama de ambien- tes incluindo matérias-primas e ali- mentos processados (From et al., 2005; Tourasse et al., 2006). 1.4 Referências Alles, G. C. 2008. Caracterização de estirpes de Bacillus sphaericus com atividade inseticida. Disser- tação (Mestrado), Universidade do vale do Rio dos Sinos, 2008. 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Acesso em 19/11/ 2008). 26 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38 Tabela 1. Classificação e caracterização das proteínas Cry de Bacillus thuringiensis. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38 27 L- Lepidoptera; C- Coleoptera; D- Diptera; H- Hymenoptera; N- Nematoda; Le- leucócitos cancerosos humanos. 30 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38 sendo eles: Bt kurstaki, Bt israelensis, Bt fukuokaensis Bt kyushuensis, Bt darmasta- diensis, Bt thompsoni, Bt tolworthii e Bt os- trinae. Já as subespécies Bt galleriae, Bt ai- zawai e Bt wuhanensis apresentaram so- mente hemolisina e quitinase. Os mesmos autores também relatam a presença do gene que codifica a enteroto- xina, uma toxina produzida por diferentes cepas de B. thuringiensis, com peso mole- cular em torno de 45kDa, e que pode ser tóxica a vertebrados, uma vez que é análo- ga à toxina produzida por B. cereus. Con- siderando a análise de 13 isolados de B. thuringiensis avaliados, 9 foram positivos para o gene entS que codifica a enterotoxi- na. No mesmo sentido, Rivera et al. (2000) avaliaram 74 isolados do entomopatógeno, em relação a presença dos genes bce, hbl e nhe para a enterotoxina. Os seus resulta- dos mostram que o gene nhe foi o mais freqüente, seguido de hbl e bce mostrando assim, uma pequena diferença na distribui- ção desses genes entre B. thuringiensis e B .cereus. Outros dados de pesquisa sobre ente- rotoxina (Ngamwongsatit et al., 2008), re- velaram a presença dos genes hbl, nhe, cytK e entFM em 205 isolados de B. thuringien- sis e 411 isolados de B. cereus. Os dados desses autores mostram que, em 149 isola- dos de B. thuringiensis todos os genes ocor- reram simultaneamente, sendo os genes nhe e entFM aqueles de menor freqüência. Es- ses autores relatam a importância desse conhecimento uma vez que a enterotoxina pode causar intoxicação alimentar, quan- do relacionada ao patógeno B. cereus. Em relação à β-exotoxina, também cha- mada thuringiensina, é uma proteína com peso molecular de 0,7 kDa (Gohar & Per- chat 2001), insespecífica, termoestável, identificada por inibir a síntese de rRNA (Mackedonski & Hadjilov, 1972) e prejudi- car a formação do fuso mitótico, dentre outros efeitos observados em ensaios in vi- tro com Alium cepa (Sharma & Sahu, 1977). Por ser inespecífica e tóxica a vertebrados, a thuringiensina é avaliada em testes labo- ratoriais, utilizando roedores como cobai- as. Os dados de Ohba et al. (1981) mos- tram que, de 740 isolados de B. thuringi- ensis avaliados quanto a presença da β-exo- toxina, 28 produziram essa toxina. Além desses, dois isolados da espécie B. subtilis, um isolado de B. natto e dois isolados da espécie B. megaterium também foram pro- dutores da thuringiensina. Nesse sentido, Hernandéz et al. (2003) revelam que 79% dos isolados de B. thu- ringiensis thuringiensis são produtores des- sa toxina, seguidos de 20% para B. thurin- giensis kenyae, 13% para B. thuringiensis kurstaki, contrastando com 0% de produ- ção para B. thuringiensis aizawai. Na Tabela 3 constam dados sobre a pro- dução da β-exotoxina pelas diferentes su- bespécies de B. thuringiensis. A thuringiensina também apresenta ati- vidade inseticida a diferentes espécies de insetos-praga, como demonstra o trabalho de Barreto et al. (1999) utilizando S. frugiper- da em seus ensaios de toxicidade. Porém, de- vido as suas propriedades não específicas aos insetos, ou seja, pode também afetar organis- mos não-alvo, os isolados bacterianos que são produtores dessa toxina não podem ser co- mercializados para serem utilizados na agri- cultura visando o controle de insetos-praga. 1.1 Referências Agaisse, H. & Lereclus, D. 1995. 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O tema trata do modo de ação completo de B. thuringiensis, des- de a ingestão do entomopatógeno até a morte do inseto. O processo de análise de receptores nos tecidos dos insetos é descrito detalhadamente, envolvendo diferentes abordagens metodológicas de detecção de sítios de ligação das prote- ínas inseticidas e uma discussão com dados de diversos autores que desen- volvem pesquisas nessa área. 1.1 Modo de ação das proteínas Cry de B. thuringiensis As análises do modo de ação das proteínas Cry de B. thuringiensis visam esclarecer os mecanismos pelos quais estas proteínas exercem seu efeito en- tomopatogênico e elucidar a especifici- dade das diferentes toxinas (Endo e Nishiitsutsuji-Uwo, 1980; Höfte e Whi- teley, 1989; Gill et at., 1992; Schnepf et al., 1998; Fiuza, 2004). Considerando o conjunto de informações atualmente dis- poníveis sobre as fases entre a ingestão dos cristais e a morte das larvas dos in- setos suscetíveis às proteínas Cry de B. thuringiensis, descreve-se como fases do mecanismo de ação: (i) Inicia pela solubilização dos cris- tais em pH alcalino no intestino médio dos insetos, liberando as protoxinas de 130-140 kDa para Cry1 e 70 kDa para Cry2. Essa etapa é determinante à especifi- cidade do isolado de B. thurin- giensis à espécie alvo, tanto pela alcalinidade do sistema digesti- vo quanto pela composição dos cristais de B. thuringiensis. (ii) Protoxinas são ativadas pelas enzimas digestivas, formando fragmentos tóxicos de 60-65 kDa. Nessa etapa tanto a composição proteolítica quanto a estrutura protéica do cristal são importan- tes. (iii) Toxinas reconhecem receptores específicos às microvilosidades das células epiteliais do intesti- no médio das larvas suscetíveis às quais elas se ligam. Os estu- dos realizados com BBMV (Brush Border Membrane Vesicles) iso- ladas de larvas de lepidópteros mostram que a ligação de forte afinidade entre a toxina e o re- ceptor é reconhecido como um fator importante na determinação do espectro inseticida das prote- ínas Cry (Fiuza et al., 1996). Da- dos de pesquisa mostram que há uma correlação positiva entre a ligação, in vitro, da toxina no receptor intestinal e a toxicida- de, in vivo. Por outro lado, ou- tros estudos descrevem que o reconhecimento do receptor é necessário, mas não é suficiente para provocar a toxicidade, su- gerindo a existência de outros fatores relacionados ao modo de ação das proteínas Cry. Em 1994, Knight et al., isolaram de BBMV de larvas de Manduca sexta Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38 35 logy, 184: 138-159. Boets, A.; Jansens, S.; Denolf, P.; Pe- feroen, M.; Degheele, D.; Van Rie, J. 1994. 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Os trabalhos de pesquisa en- fatizam os métodos de ensaios toxico- lógicos em laboratório e campo, utili- zando o entomopatógeno B. thuringi- ensis e as formas imaturas das espéci- es-alvo. 1.1 Os insetos-praga Entre os insetos-praga para os quais têm sido desenvolvidos estudos e apli- cações de controle com B. thuringien- sis estão os lepidópteros, Spodoptera frugiperda e Anticarsia gemmatalis, e o coleóptero Oryzophagus oryzae, os quais serão apresentados como mode- lo de estudos de toxicidade com B. thu- ringiensis. A lagarta militar, S. frugiperda, ata- ca e causa danos a várias culturas de importância econômica, como: sorgo, milho, arroz, alfafa, cana-de-açúcar e al- godoeiro (Cruz et al., 1999; Gallo et al., 2002), ao passo que, a lagarta da soja A. gemmatalis é praga-chave para essa cul- tura e também tem importância para culturas como amendoim, feijão e alfa- fa (Gallo et al., 2002). Já o gorgulho aqu- ático, O. oryzae, cujas larvas são conhe- cidas como bicheira-da-raiz-do-arroz, é o principal inseto-praga da cultura do arroz irrigado no sul do Brasil (Martins et al., 2004) e, por isso, é também um dos mais estudados pelas instituições de pesquisa dessa região (Costa, 2003). As lagartas de S. frugiperda e A. gem- matalis podem ser criadas em laborató- rio, desde que respeitados determina- dos padrões de temperatura, umidade relativa e fotoperíodo (28ºC, 70%U.R., 12h de fotoperíodo). O ciclo evolutivo desses insetos, em laboratório, ocorre em torno de 30 dias, desde a fase de ovo até a emergência do adulto. Os adul- tos são mantidos em gaiolas de acrílico com alimentação a base de glicose aquo- sa (10%), onde acasalam e realizam a postura. Os ovos são retirados diaria- mente e acondicionados junto à dieta artificial, sendo dieta de Poitout para S. frugiperda e dieta de Greene para A. gemmatalis. As lagartas desenvolvem- se nessa dieta até a formação da pupa, que então são separadas em macho ou fêmea até emergir o adulto, finalizando o ciclo. No caso de O. oryzae, por se tratar de uma larva aquática, que se alimenta das raízes das plantas de arroz, não é descrito nenhum método de criação efi- ciente desse inseto, em laboratório. Por- tanto, quando realizados os bioensaios, esses insetos são coletados diretamente de áreas de plantio de arroz infestadas, trazidos ao laboratório para então se- Diouneia Lisiane Berlitz Bióloga (UNISINOS) e Mestre em Biologia: Diversidade e Manejo de Vida Silvestre (UNISINOS). Aline Oliboni de Azambuja Bióloga (UNISINOS) e Mestre em Biologia: Diversidade e Manejo de Vida Silvestre (UNISINOS). Andresa Patrícia Regert Lucho Engenheira Agrônoma (UFRGS) e Mestre em Biologia: Diversidade e Manejo de Vida Silvestre (UNISINOS). Neiva Knaak Bióloga (UNISINOS) e Mestre e Doutoranda em Biologia: Diversidade e Manejo de Vida Silvestre (UNISINOS). Rogério Schünemann Biólogo (UNISINOS) e Mestre em Biologia: Diversidade e Manejo de Vida Silvestre (UNISINOS). Jaime Vargas de Oliveira Engenheiro Agrônomo (UFSM), Mestre em Fitotecnia – Fitossanidade/Entomologia (UFPEL), Lidia Mariana Fiuza Engenheira Agrônoma (UPF), Mestre em Fitotecnia – Fitossanidade (UFRGS), Doutora em Ciências Agronômicas (ENSAM- Montpellier) e Pós-Doutora em biotecnologia Vegetal (CIRAD-Montpellier). Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38 37 rem utilizados nos ensaios biológicos. 1.2 Bioensaios de B. thuringiensis com os insetos-praga Para determinar a atividade insetici- da de isolados bacterianos, os bioensai- os podem ser classificados como preli- minares ou seletivos. A utilização de suspensão de células e esporos bacteri- anos é uma forma de identificar isola- dos ativos cujas propriedades mostram eficiência no controle de insetos-praga. Bioensaios também são utilizados para determinar a Concentração Letal Média (CL 50 ), ou seja, a quantidade de entomopatógeno que deve ser utilizada para controlar a metade da população do inseto. Para esses, são usados os iso- lados que causaram um eficiente índice de mortalidade nos testes preliminares. Nesta análise são utilizadas suspensões contendo células e esporos ou a prote- ína purificada, dosados em diferentes concentrações. Os ensaios de toxicida- de são importantes também, pois reve- lam injurias e detrimento morfológico, além de determinar em quanto tempo ocorre a morte do inseto, Tempo Letal Médio (TL 50 ). Esses dados são então ana- lisados para que, quando aplicado em lavouras, o bioinseticida seja eficiente no controle dos insetos-alvo. Os ensaios utilizando as lagartas de S. frugiperda e A. gemmatalis podem ser realizados em mini-placas de acríli- co, contendo dieta artificial, onde é apli- cada a quantidade de inóculo pré-de- terminada para uma lagarta por placa (Figura 1A). A quantidade de insetos pode variar entre 20 e 50 e o número de repetições entre três e cinco. No caso do coleóptero O. oryzae, os testes podem ser realizados em tubos de ensaio con- tendo uma planta de arroz, água e a sus- pensão bacteriana, com 5 larvas do inse- to por tubo (Figura 1B). Todos os bioen- saios utilizam placas ou tubos controle, contendo os insetos e sem adição dos tra- tamentos. Os ensaios são acondicionados em câmaras climatizadas nas mesmas con- dições de criação ou manutenção dos in- setos em laboratório, descritas anterior- mente. Os experimentos são avaliados até o 7º dia após a aplicação dos tratamentos e os dados são utilizados para o cálculo da mortalidade corrigida pela fórmula de Abbott (1970). 1.3 Controle de S. frugiperda com B. thuringiensis Apesar de inúmeras pesquisas envol- vendo esse lepidóptero e seu controle, há dificuldade em encontrar um isolado bac- teriano patogênico a essa espécie. Essa afirmação é comprovada no trabalho de Polanczyky et al. (2003) que, utilizando 58 subespécies de B. thuringiensis em S. frugiperda demonstraram que apenas B. thuringiensis morrisoni apresentou 80% de mortalidade das lagartas. Também Sil- va et al. (2004), testaram 77 isolados sen- do que somente 4 foram ativos a espécie- alvo. Recentemente, Berlitz & Fiúza (dados não publicados) testaram 132 isolados onde apenas um apresentou alta toxici- dade ao inseto, com 100% de mortalida- de, quando utilizada a suspensão de cé- lulas e esporos bacterianos. Em outro tra- balho, Berlitz et al. (2003) testaram 24 iso- lados de B. thuringiensis provenientes de diversas regiões orizícolas do RS e obteve as maiores mortalidades entre 31,6 e 100% com apenas cinco isolados, sendo que a cepa com maior potencial inseticida foi analisada quanto ao perfil protéico con- firmando a presença de proteínas ativas contra lepidópteros. As reduzidas taxas de mortalidade podem estar relacionadas a diferentes fatores, como por exemplo, o modo de ação das proteínas bacterianas no intestino do inseto, ou modificações no sítio de ligação dessas toxinas na mem- brana intestinal. Além disso, cada isolado tem uma característica genética particu- lar, ou seja, essas toxinas são codificadas por genes e esses têm uma determinada especificidade. Em outro trabalho, Berlitz & Fiuza (2004) testaram B. thuringiensis aizawai proveniente do produto formulado Xen- tari® mostrando que a suspensão celular apresentou CL 50 de 1,9x108 UFC/mL (Uni- dade Formadora de Colônia/mL) reduzin- do em 56,7% o consumo alimentar das lagartas. Isso indica que a bactéria inibe a alimentação do inseto-praga, o que tam- bém está relacionado com a mortalidade das lagartas. Entretanto o fato de um isolado cau- sar mortalidade às lagartas não implica que, quando purificadas as proteínas tó- xicas, essas serão ativas ao inseto. É o que ocorreu na pesquisa de Berlitz (2006), que, quando utilizada a suspensão de células e esporos bacterianos obtiveram 100% de mortalidade, entretanto quando purifica- das as proteínas do isolado, essas causa- ram baixa mortalidade às lagartas apre- sentando CL 10 de 268µg/mL. Esse fato pode estar relacionado ao conjunto de fatores de virulência presentes na bactéria, ou então a presença de outras toxinas como, por exemplo, proteína Vip, exotoxinas, he- molisinas, quitinases, entre outras, que estão presentes na suspensão bacteriana. Figura 1. Bioensaios com lagartas de Spodoptera frugiperda (A) ou Anticarsia gemmatalis e larvas de Oryzophagus oryzae (B) 40 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38 as interações com as plan- tas, as formigas e os cupins podem se tornar pragas e nesse caso faz-se necessário o controle, onde os entomo- patógenos assumem um pa- pel importante no controle biológico. Nesse contexto, alguns dados de pes- quisa sobre os ensaios de toxicidade de B. thuringiensis às formigas corta- deiras e aos cupins de montículo são apresentados nesse artigo. 1.1 Os insetos sociais Nas sociedades de insetos, o siste- ma de castas possibilita uma divisão do trabalho, permitindo a execução de múltiplas tarefas, nas quais indivíduos estéreis são responsáveis pela manu- tenção da colônia (obtenção de alimen- to, defesa e cuidados com a prole), e os reprodutores limitam-se a reprodu- ção. O Brasil está entre os países que contemplam a maior diversidade de Pesquisa Pesquisa TOXICOLOGIA DE BACILLUS THURINGIENSIS AOS INSETOS SOCIAIS insetos sociais do mundo. As formigas estão entre os orga- nismos mais abundantes do planeta, somando, em conjunto, mais de 10% da massa de todos os organismos ter- restres, incluindo mamíferos de gran- de porte (Hölldobler e Wilson, 1990). De acordo com estes autores, em um hectare da Floresta Amazônica vivem mais de oito milhões de formigas. As formigas cortadeiras são os principais herbívoros dos Neotrópi- cos. Abundantes nas suas numero- sas colônias desfolham a vegetação, sendo consideradas importantes pra- gas agrícolas no Brasil, com prejuí- zos estimados em milhões de reais. O gênero Acromyrmex representa uma ameaça às plantas cultivadas. Esses insetos também se destacam por atacarem uma ampla variedade de vegetais, incluindo plantas orna- mentais, reflorestamento e pastagens. As diferentes espécies deste gênero apresentam ampla distribuição geo- Figura 1. Bioensaios com cepas de Bacillus thuringiensis e Nasutitermes ehrhardti, em laboratório Raquel de Castilhos-Fortes Bióloga (UNISINOS) e Mestre em Microbiologia Agrícola e do Ambiente (UFRGS) Aline Oliboni de Azambuja Bióloga (UNISINOS) e Mestre em Biologia: Diversidade e Manejo de Vida Silvestre (UNISINOS). Laura Massochin Nunes Pinto Bióloga (PUCRS) e Mestre e Doutoranda em Biologia: Diversidade e Manejo de Vida Silvestre (UNISINOS). Lidia Mariana Fiuza Engenheira Agrônoma (UPF), Mestre em Fitotecnia – Fitossanidade (UFRGS), Doutora em Ciências Agronômicas (ENSAM-Montpellier) e Pós-Doutora em biotecnologia Vegetal (CIRAD- Montpellier). Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38 41 gráfica no Rio Grande do Sul, eviden- ciando hábitos de forrageamento bas- tante diversos (Gusmão e Loeck, 1999). Os cupins estão presentes pratica- mente em todos os ambientes terres- tres ou que sofreram alguma pertur- bação antrópica, alimentando-se basi- camente de celulose, obtida através desta capacidade de ajustar-se a di- versos ecossistemas. Muitas espécies desempenham um papel ecológico significativo, reciclando nutrientes minerais no solo e participando na re- generação de ambientes devastados. Porém, várias outras espécies se des- tacam como os organismos mais da- ninhos à cultura agrícola e florestal (Berti-Filho, 1993). No Brasil, além de dificultarem seriamente os tratos cul- turais, os cupins de montículo são con- siderados importantes pragas de pas- tagens e culturas de arroz, milho, cana- de-açúcar, amendoim e eucalipto. As principais espécies responsáveis por estes danos pertencem aos gêneros Cornitermes, Syntermes, Heterotermes, Nasutitermes, entre outros. O controle desses insetos vem sen- do realizado basicamente com a apli- cação de inseticidas químicos, sendo um método alternativo as bactérias en- tomopatogênicas que podem ser iso- ladas naturalmente do corpo desses insetos, representando mais uma fer- ramenta de combate ao inseto-praga, sem prejudicar o meio ambiente. 1.2 B. thuringiensis isolados de insetos-sociais Na análise da patogenicidade de B. thuringiensis sobre um determina- do inseto, o primeiro passo a ser ado- tado é a correlação da atividade das proteínas Cry no inseto-alvo já descri- ta. Caso este efeito ainda não tenha sido avaliado, uma das alternativas poderá ser por meio do isolamento do microrganismo de indivíduos da es- pécie de inseto-alvo. Diversos traba- lhos são publicados anualmente des- crevendo o isolamento de novas ce- pas de B. thuringiensis de diferentes substratos, inclusive dos próprios in- setos (Borm et al., 2002). Nesse senti- do, Azambuja et al. (2001) obtiveram, a partir de 80 indivíduos de Acromyr- mex sp., 35 isolados do gênero Baci- llus, entre os quais 14 foram identifica- dos como B. thuringiesis. Através des- te estudo pode-se constatar a elevada ocorrência de B. thuringiensis associa- do a formigas cortadeiras. Para tanto, os insetos devem ser co- letados com pinça e acondicionados em frascos esterilizados a -18ºC até o mo- mento de sua utilização. O isolamento é realizado através da maceração de 10 insetos em solução salina, sendo que 1mL desta suspensão é submetida a pasteurização, em seguida a inocula- ção em Ágar Nutriente e incubação durante 24h a 30°C. As colônias obtidas devem ser en- tão inoculadas em meio seletivo (Peni- cilina G) e mantidas a 30°C e 180rpm durante 24 horas. As amostras positi- vas devem ser avaliadas em microsco- pia de contraste de fase para identifi- cação das inclusões paraesporais, ca- racterísticas de B. thuringiensis. Os isolados de B. thuringiensis, oriundos de A. lundi, que causaram mortalidade ao referido inseto foram avaliados por PCR quanto a sua consti- tuição de genes cry conforme descrito por Pinto et al. (2003). Os autores iden- tificaram que sete dos nove isolados que apresentaram toxicidade a A. lun- di amplificaram fragmentos de DNA correspondentes a pelo menos uma das classes de genes cry avaliadas, sendo elas cry1 e/ou cry9. Os genes cry2, cry3, cry7 e cry8, os quais também foram avaliados na pesquisa, não fo- ram detectados nas amostras testadas. Além disso, 22% dos isolados obtidos de A. lundi não amplificaram com ne- nhum dos primers avaliados, podendo Figura 2. Representação esquemática dos bioensaios com Acromyrmex lundi e Bacillus thuringiensis Figura 3. Patogenicidade de Bacillus thuringiensis à Nasutitermes ehrhardti, em ensaios de laboratório; B. thuringiensis sooncheos (Bts); B.thuringiensis roskildiensis (Btr); B. thuringiensis yunnanensis (Bty); B. thuringiensis huazhongensis (Bth); B. thuringiensis braliliensis (Btb); B. thuringiensis colmeri (Btc) e B. thuringiensis kurstaki (Btk) 42 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38 representar novos genes cry. 1.3 Bioensaios de B. thuringiensis com insetos-sociais Cupins e formigas sofrem ação de di- versos tipos de patógenos como: vírus, bactérias, fungos e nematóides, sendo a defesa contra os mesmos pouco conheci- da. A complexidade do comportamento e a biologia dificultam o controle destes in- setos (Leonardo, 1989; Diehl-Fleig, 1993). Portanto, técnicas de bioensaios eviden- ciando o efeito desses entomopatóge- nos sobre os insetos sociais, considera- dos pragas, são escassos. Nessa linha de pesquisa, Castilhos-Fortes et al. (2002) avaliaram a patogenicidade de diferen- tes cepas de B. thuringiensis, sobre Na- sutitermes ehrhardti, onde foram utili- zadas suspensões contendo uma mistura de células vegetativas, esporos e cristais. Porções de celulose (1cm2), utilizadas como substrato alimentar, foram mergu- lhadas nas suspensões de B. thuringien- sis, as quais foram colocadas em placas de acrílico com seis compartimentos de 5,5 cm de diâmetro. Em cada comparti- mento, contendo 1cm2 de celulose trata- da, foram colocados dez insetos (Figura 1). O acondicionamento dos ensaios foi feito em estufa incubadora tipo B.O.D., a 28O C, 70% de umidade relativa, no escu- ro. A mortalidade dos insetos foi avaliada diariamente até o 7° dia após a instalação dos bioensaios, observando-se os cupins mortos com sintomas característicos de intoxicação por B. thuringiensis. Em 2003, Pinto et al. testaram o efei- to de B. thuringiensis em formigas cor- tadeiras, cujo método de bioensaio foi desenvolvido objetivando a sobrevivên- cia dos indivíduos por no mínimo sete dias, tempo suficiente para a avaliação de bioensaios. Esse método foi constitu- ído de uma dieta líquida composta de peptona bacteriológica, glicose e extra- to de levedura, com substituição perió- dica de 48 horas, previamente acondici- onada em pequenos frascos de polipro- pileno, acrescida de cinco indivíduos de Acromyrmex lundi (Figura 2). Utilizando o referido método de bi- oensaio de B. thuringiensis com Acromyrmex lundi, pode-se obter 100% de sobrevivência das formigas por 180 horas (7,5 dias), tempo suficiente para a avaliação dos bioensaios com o ento- mopatógeno. 1.4 Toxicidade de B. thuringiensis aos cupins e formigas cortadeiras As referências de B. thuringiensis contra isópteros são restritas, havendo poucos dados disponíveis, como os de Cowie et al. (1989), que citam algumas cepas de B. thuringiensis tóxicas a vári- as espécies de térmitas em condições laboratoriais. Khan et al. (1985), também ressaltam a carência de trabalhos desen- volvidos visando testar B. thuringiensis em térmitas, embora tenham citado os trabalhos de Smythe & Coppel (1965), os quais constataram que a solução com B. thuringiensis mostrou-se tóxica a três espécies de Reticulitermes, bem como a Zootermopsis angusticollis. Khan et al. (1977) isolaram B. thuringiensis a partir de ninfas do isoptero Bifiditermes bee- soni infectadas, encontradas em campo. Nos testes de toxicidade contra Micro- cerotermes champion, a suspensão de bactérias testada causou alta mortalida- de em condições laboratoriais. Considerando a patogenicidade de B. thuringiensis para N. ehrhardti, Cas- tilhos-Fortes el al. (2002) testaram 57 cepas desta bactéria, sendo que sete mostraram-se mais efetivas: B. thuringi- ensis sooncheon (Bts) e B. thuringiensis roskildiensis (Btr) com uma mortalidade de 100%; seguidos dos isolados B. thu- ringiensis yunnanensis (Bty) com 71,4%; B. thuringiensis huazhongensis (Bth) com 57,1%; B. thuringiensis brasiliensis (Btb) com 52,3%; B. thuringiensis col- meri (Btc) com 42,85% e B. thuringien- sis kurstaki (Btk) com 28,57% de morta- lidade ao 7o dia após a aplicação dos tra- tamentos, conforme resultados apresen- tados na Figura 3. Para a determinação da CL 50 de B. thuringiensis os referidos autores utili- zaram os isolados B. thuringiensis soon- cheon e B. thuringiensis roskildiensis os quais causaram 100% de mortalidade nos ensaios pré-seletivos. As CL 50 de B. thu- ringiensis sooncheon observadas foram 46,98x108, 66,19x106 e 5,14x105 esporos/ ml, aos três, cinco e sete dias após os tratamentos, respectivamente. Para B. thuringiensis roskildiensis foram 30,78x105, 48,40x106 e 16,80x104 espo- ros/ml aos três, cinco e sete dias, res- pectivamente. A toxicidade de B. thuringiensis para N. ehrhardti foi confirmada pelos auto- res através de observações microscópi- cas de cupins macerados aos três, cinco e sete dias após a aplicação dos trata- mentos. As estruturas de B. thuringien- sis formadas por células em forma de bastonete, cadeias, esporos e inclusões paraesporais podem ser observadas na Figura 4A para B. thuringiensis soon- cheon e na Figura 4B para B. thuringi- ensis roskildiensis. A patogenicidade e o desenvolvimen- to de B. thuringiensis foram estudados por Khan et al. (1985) nos isópteros Mi- crotermes championi e Bifiditermes be- esoni, que se mostraram suscetíveis à infecção causada pela bactéria após a aplicação do formulado Thuricide-HP. De acordo com a análise histopatológi- ca, foi constatado que a ação de B. thu- Figura 4. Isolados de Bacillus thuringiensis a partir da maceração de Nasutitermes ehrhardti infectados; A- Bacillus thuringiensis soocheon; B- Bacillus thuringiensis roskildiensis Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38 45 Mortalidade Corrigida (%) Tratamentos B. germanica P. americana B.t. sorovar colmeri 6,65 0,0 B.t. sorovar yunnanensis 14,85 0,0 B.t. sorovar huazhangiensis 15,00 0,0 B.t. sorovar roskildiensis 16,65 0,0 B.t. sorovar sooncheon 30,00 0,0 Tabela 1. Mortalidade corrigida de Blatella germanica e Periplaneta americana, submetidas aos tratamentos com sorovares de Bacillus thuringiensis serem submetidas à forte pressão de sele- ção, sob condições de laboratório (Amo- rim, 2007; Georghiou, 1992; Pei, 2002; Rod- charoen & Mulla, 1994) ou de campo (Mulla, 2003). Estes resultados apontam para a necessidade de racionalizar o uso do B. sphaericus, a fim de evitar a seleção de populações resistentes. A primeira população resistente obtida sob condições de laboratório, foi submeti- da à forte pressão de seleção e atingiu um nível de resistência da ordem de 100.000 vezes, em relação à colônia susceptível (Georghiou, 1992). Em outro estudo reali- zado em laboratório, foram selecionadas duas colônias de Cx. quinquefasciatus, no Brasil e na China, que atingiram um alto nível de resistência (>100.000) (Pei, 2002). Também foi demonstrado que é possível selecionar a resistência ao B. sphaericus cepa IAB59, sob condições de laboratório, embora, esta seleção tenha ocorrido de forma mais lenta em relação ao B. sphaeri- cus 2362. O nível de resistência chegou a mais de 40.000 vezes (Amorim, 2007). Em campo, já foram detectadas populações com níveis de resistência variáveis na França (Chevillon, 2001), Índia (Rao, 1995), China (Yuan, 2000), Tunísia (Nielsen-Leroux, 2002) e na Tailândia (Mulla, 2003). O pro- cesso de seleção da resistência em popula- ções de campo é modulado por diversos fatores que incluem o background genéti- co da população, bem como fatores ecoló- gicos e ambientais. 1.1.3 Controle integrado de vetores O conceito do Manejo Integrado de Vetores (MIV) surgiu como resultado de uma mudança de paradigma após o uso intensivo de inseticidas químicos nas dé- cadas de 1940-60. Em outras palavras, o MIV é definido como uma combinação ra- cional de diversos métodos de controle disponíveis, objetivando manter a popula- ção de vetores em níveis aceitáveis e da maneira mais efetiva, econômica e segura, incluindo componentes biológicos, quími- cos, físicos e ambientais, visando interferir o mínimo possível no ecossistema. No MIV, várias ações são empregadas na tentativa de englobar todas as causas do problema. No âmbito do controle de mosquitos, estas ações podem incluir a melhoria da rede de esgoto e distribuição de água, eliminação física de criadouros, uso de barreiras físi- cas nas habitações, medidas de proteção individual, uso de larvicidas específicos em criadouros que não podem ser eliminados, além da conscientização e participação da comunidade. Dentre estas ações, o uso de biolarvicidas apresenta vantagens, como a especificidade para o inseto alvo e segu- rança para o meio ambiente (Georghiou et al., 1992). O principal objetivo de estratégias de controle integrado de vetores é reduzir a densidade populacional de mosquitos para níveis em que a atividade é minimizada ou a transmissão de doenças reduzidas ou in- terrompida com o mínimo de efeitos ambi- entais. Idealmente, programas de controle in- tegrado devem incluir intervenções mais eficazes e ambientalmente compatíveis. Devido à sua eficácia e aparente especifi- cidade, tanto Bt israelensis quanto B. spha- ericus podem ser ideais para o programa integrado de controle de pragas. (Lacey & Orr, 1994). A combinação de Bt israelensis com outros agentes de controle biológico resultou em um excelente controle e, em alguns casos, a supressão prolongada de larvas de mosquitos. Mulligan & Schaefer (1982) relataram um controle inicial de larvas de Cx. tarsa- lis em uma das zonas úmidas em que o tratamento com Bt israelensis foi seguido por abatimento em longo prazo com lar- vas de insetos predadores. Do mesmo modo, Mulla et al. (1993) observaram que as populações de Cx. quinquefasciatus, Cx. stigmatosoma e Cx. tarsalis não se recupe- raram após o tratamento com Bt israelensis devido a subsequentes predações de lar- vas por macroinvertebrados aquáticos e uma redução na oviposição atrativa da pe- cuária local. Regis & Nielsen-Leroux (2000) revisan- do estratégias de manejo de resistência B. sphaericus recomendaram o acompanha- mento da susceptibilidade das espécies-alvo de B. sphaericus antes e durante o trata- mento, alternando o uso de B. sphaericus com Bt israelensis. Zahiri et al. (2004) de- monstraram que utilizando suspensões de misturas contendo formulações comerciais de Bt israelensis e B. sphaericus, não resul- tou em resistência em colônias de Cx. quin- quefasciatus, enquanto que somente sus- pensões de B. sphaericus gerou resistên- cia. 1.2 B. thuringiensis no controle de baratas Segundo Wilson (1972), estudos com- parativos realizados entre famílias primiti- vas de térmitas e baratas revelaram a exis- tência de múltiplas características em co- mum que, segundo o autor, poderiam con- siderar os térmitas como baratas sociais, cujos diagramas de filogenia, não só refor- çam este parentesco, como também, rela- cionam a evolução da flora microbiana in- testinal entre as ordens Isoptera e Blatto- dea. Nesse contexto, a partir do trabalho de Castilhos-Fortes et al. (2002), Hübner (2004) testou cinco isolados de B. thuringiensis em Blatella germanica e Periplaneta ame- ricana: B. thuringiensis yunnanensis, B. thuringiensis colmeri, B. thuringiensis hua- zhangiensis, B. thuringiensis sooncheon e B. thuringiensis roskildiensis, oriundos do Instituto Pasteur, Paris. Para o estudo, adultos e ootecas de B. germanica e P. americana foram coleta- dos em estabelecimentos comerciais e re- sidenciais, no município de Gramado, Rio Grande do Sul. Ambas as espécies perma- neceram em caixas de plástico (564 x 385 x 371 mm e 400 x 270 x 362 mm), com as bordas superiores preenchidas com uma mistura de água e talco neutro, para evitar a fuga dos insetos. A umidade foi mantida através de algodão umedecido, trocado a cada 48 horas. Substratos de papelão cor- rugado foram utilizados para mimetizar seu hábitat natural. Na alimentação foi utiliza- da 0,5 g de ração animal moída Whiskas, sendo os insetos mantidos em condições controladas (30ºC, 70% de U.R., 12h foto- fase). Nos bioensaios, baratas adultas de am- bas as espécies foram agrupadas em caixas plásticas (262 x 177 x 85 mm), contendo placas de Petri com algodão umedecido em água destilada e outra contendo 0,5g de ração animal moída e 1000µL das suspen- sões bacterianas a 1.1010 células/mL. Nas testemunhas, os isolados foram substituí- dos por água destilada esterilizada. Para cada isolado bacteriano e cada espécie fo- ram utilizados 30 insetos. A mortalidade foi analisada durante 7 dias após a aplicação dos tratamentos e corrigida pela fórmula de Abbott (Alves, 1998). Os dados de patogenicidade, utilizan- do os cinco isolados de Bacillus thuringi- ensis, demonstraram uma baixa ação tóxi- ca sobre B. germanica (6,65% a 30% de mortalidade), e uma inatividade (0% de mortalidade) à P. americana, levando-se em consideração que os índices de mortalidade corrigida apresentados na Tabela 1. Apesar de Wilson (1972) ter descrito um parentesco evolutivo entre as famílias primiti- vas de térmitas e baratas, inclusive quanto a sua flora bacteriana, o presente estudo de- monstra que não há uma correlação da ação de B. thuringiensis sobre B. germanica e P. americana, pertencentes às famílias mais evo- luídas. Cavados (2003) cita que o controle bioló- gico com bactérias entomopatogênicas tem como principal vantagem a especificidade. Dependendo da composição de proteínas Cry no cristal bacteriano, os isolados podem apre- sentar um espectro de ação limitado às or- dens de insetos (Fiuza, 2001). Assim, os da- dos obtidos sugerem que as delta-endotoxi- nas produzidas pelos cinco isolados de B. thu- ringiensis testados não apresentam proteínas Cry com ação tóxica para a ordem Blattodea, uma vez que causaram uma menor ação so- bre os insetos-alvo do trabalho de Hübner (2004). Lambiase et al. (1996) mencionam uma diferenciação na localização dos sítios bacte- rianos em B. germanica e P. americana, o que poderia justificar o fato de ter-se obtido uma ação inseticida para a primeira espécie e uma ausência de efeito para a segunda. Também forma realizados ensaios de to- xicidade in vivo para verificar a ação de B. thuringiensis oswaldocruzi (H-38) e B. thu- ringiensis brasiliensis (H-39) contra Peripla- neta americana e Blatella germanica. Porém, nesses ensaios não houve ação patogênica das cepas avaliadas às duas espécies de baratas utilizadas nos bioensaios (Hübner, 2004). 1.3 Referências Amorim, L. B. 2007. 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Agora você pode colher os frutos: BIO TECNOLOGIA Ciência & Desenvolvimento 50 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38 as plantas são importantes “meios de co- municação”, pois ao serem atacadas por um herbívoro, liberam substâncias voláteis pe- las folhas, as quais orientam as fêmeas dos parasitóides a encontrarem as lagartas e de- positar seus ovos. Sendo assim, os odores têm papel fundamental na organização dos indivíduos nos agroecossistemas (Vendra- min, 2002; Vilela &Palini, 2002). As interações tri-tróficas podem ser exemplificadas nas culturas da soja e do milho. A cultura é atacada pela largarta-da- soja, A. gemmatalis que é combatida atra- vés da aplicação de vírus, o Baculovirus anticarsia, e predada por Geocoris sp. No caso do milho, as lagartas de S. frugiperda podem ser parasitadas por Trichogramma sp. e controladas através do entomopató- geno B. thuringiensis. De acordo com Ferry et al. (2004), os insetos são causadores de perdas mundiais entre 10 e 20% da produção agrícola. Com isso as pesquisas na área biotecnológica estudam diferentes formas de induzir a re- sistência de uma planta a seu predador. Apesar disso as técnicas convencionais de controle químico ainda são largamente uti- lizadas, sendo que o controle biológico en- contra algumas resistências, principalmen- te devido aos elevados custos aos produ- tores agrícolas. Agrawal (2000) relata que as plantas podem ser atrativas ou benéficas a alguns inimigos naturais de herbívoros, mas tam- bém podem ser tóxicas ou prejudiciais a esses. Assim, as interações tri-tróficas po- dem identificar esses mecanismos de modo a poder manipulá-los, o que irá ampliar o controle e reduzir o uso de inseticidas. Os autores Ferry et al. (2004) identifi- caram diferentes estratégias de defesa das plantas a seus predadores. Dentre essas, pode-se citar mecanismos de defesa endó- genos e moleculares, sinalização das plan- tas e a produção de substâncias voláteis. Em resposta, os insetos também desenvol- veram estratégias de defesa a esses com- postos, principalmente através da produ- ção de proteinases e de mecanismos espe- ciais de desintoxicação utilizando, por exemplo, citrocomo P450, monoxigenases e glutatione S-transferases. Entretanto, a complexidade química das plantas pode manipular seus fenótipos e, conseqüentemente de seus inimigos natu- rais (Wittstock e Gerhenzon, 2002). Ven- zon et al. (2001) relatam que, quando inse- rido uma quantidade de inimigos naturais ou removendo-se determinadas espécies de um agroecossistema, uma grande quanti- dade de interações indiretas pode ser es- perada. Essas interações podem ser positi- vas ou negativas ao controle biológico, de- vendo-se dar importância aos níveis de in- terações entre as espécies. As interações tri-tróficas também podem ser exemplificadas através do trabalho de Dequech et al. (2005) que avaliaram lagar- tas de S. frugiperda parasitadas por Cam- poletis flavicincta e infectadas por B. thu- ringiensis aizawai. Em seus resultados o uso conjunto dos componentes biológicos citados, aumentou a mortalidade do inse- to-praga e diminuiu seu consumo de ali- mento. Resultados semelhantes foram encon- trados por Moraes et al. (2004) que identi- ficaram a influência de silício em plantas de trigo, no pulgão-verde (Schizaphis gra- minum) e seus inimigos naturais. Os da- dos desses autores mostram que a aplica- ção de silício na cultura aumentou a resis- tência das plantas de trigo diminuindo a preferência alimentar do pulgão-verde, não afetando seus inimigos naturais. Através desses trabalhos nota-se a im- portância de novas pesquisas visando iden- tificar relações tri-tróficas benéficas e efici- entes que podem ser utilizadas junto às práticas de Manejo Integrado de Pragas. 1.3 Compatibilidade de produtos fitossanitários com Bacillus entomopatogênicos O controle biológico ocorre natural- mente no ambiente através da ação de ini- migos naturais, mantendo em níveis relati- vamente baixos as populações de inúme- ras pragas (Lacey et al. 2001). As bactérias Bacillus thuringiensis e B. sphaericus são entomopatógenos que desempenham o papel de agentes de controle microbiano de pragas de importância agrícola e veto- res de agentes etiológicos de doenças hu- manas (De Maagd et al., 2003). Diante dis- so, a utilização e conservação desses mi- crorganismos, dentro de agroecossistemas, é uma das estratégias utilizadas no Manejo integrado de Pragas, já que são encontra- das naturalmente nesses ambientes. Assim, torna-se importante conhecer a ação dos produtos fitossanitários, determinando a sua seletividade e compatibilidade sobre os en- tomopatógenos, com o objetivo de mini- mizar os impactos tanto no ambiente quanto na microbiota residente (Batista-Filho et al., 2001). A excessiva aplicação de defensivos agrícolas vem ocasionando uma série de desequilíbrios ambientais, especialmente nas populações de entomopatogênos, ve- rificadas atráves da inibição do crescimen- to, esporulação, mutações genéticas, redu- ção da toxicidade a determinada praga, influenciando diretamente no estabeleci- mento e sobrevivência (Alves et al., 1998). No entanto, a ação dos agroquímicos so- bre os microrganismos pode variar em fun- ção da espécie e linhagem do microrganis- mo, como também da formulação química e dosagens dos produtos (Batista-Filho et al., 2001). Contudo, alguns produtos apre- sentam seletividade aos entomopatógenos, podendo potencializar o seu efeito e con- tribuir para o controle do inseto-alvo (Benz, 1971; Chen et al., 1974). Assim, a associa- ção de inseticidas químicos e biológicos contribuem para minimizar os efeitos ne- gativos sobre os agroecossistemas (Chen et al., 1974; Batista-Filho et al., 2001). Grande parte das reações dos pesticidas, atualmente utilizadas no controle de pragas, é desconhecida devido à carência de infor- mações a respeito da compatibilidade desses produtos sobre entomopatógenos (Morris, 1977). Para B. thuringiensis, majoritariamen- te os trabalhos realizados sobre interação são proveniente da década de 70, como reflexo da demasiada aplicação de inseticidas sintéti- cos orgânicos como hidrocarbonetos clorina- dos, oganofosforados, metilcarbamatos e pi- retróides (Casida e Quistad, 1998). Para B. sphaericus, quase a totalidade dos trabalhos se referem à toxicidade às larvas de dípteros, ressaltando a importância de estudos que vi- sam à proteção desse inimigo natural, através da compatibilidade com os pesticidas quími- cos. Ainda na década de 70, Doughert et al. (1971) obtiveram respostas variadas na sensi- bilidade de B. thuringiensis thuringiensis em função dos diversos solventes utilizados para os mesmos pesticidas. A presença de emulsi- ficantes e outros aditivos concentrados, utili- zados nas preparações, podem gerar proble- mas de compatibilidade com entomopatóge- nos devendo ser considerado na elaboração de novas formulações comerciais (Morris, 1977). O mesmo autor testou a compatibili- dade de 27 pesticidas sobre a germinação e replicação de B. thuringiensis kurstaki, con- cluindo que o grupo dos carbamatos foram os mais compatíveis, as piretrinas altamente bacteriostáticas e os produtos acefato, triclor- fon, metomil, carbaril, mexacarbato e PH 60- 40 (derivado da uréia) podem ser utilizados em conjunto com a bactéria. Os trabalhos mais atuais nessa linha de pesquisa avaliaram o efeito de diferentes con- centrações de defensivos agrícolas sobre mi- crorganismos entomopatogênicos. Especial- mente para B. thuringiensis, os dados mos- tram que tiametoxam, carbosulfan, diafentiu- ron, imidacloprid, acefato, utilizados nas con- centrações máximas, não apresentaram dife- rença significativa nas unidades formadoras da colônia - UFC (Batista-Filho et al., 2001; Batista-Filho et al., 2003; Almeida et al., 2003). Por outro lado, essas pesquisas revelam que endosulfan, monocrotofós, deltametrina e ci- proconazole + tiametoxam inibiram a forma- ção das colônias. Já, na concentração míni- ma, o diafentiuron foi sinérgico e o tiameto- xam e ciproconazole + tiametoxam não afe- taram B. thuringiensis. Utilizando ambas as concentrações, o endosulfan, deltametrina e profenofós + lufenuron inibiram as colônias da bactéria e tiametoxam + cipermetrina fo- ram compatíveis. Há poucas pesquisas que avaliam a com- patibilidade de bactérias entomopatogênicas com os pesticidas mais utilizados em diver- sas culturas, como por exemplo, o arroz irri- gado. No caso, Azambuja (2006) testou seis produtos fitossanitários, comumente utiliza- dos na orizicultura irrigada, sobre as bactéri- as B. thuringiensis e B. sphaericus, em con- dições laboratoriais e observou que os herbi- cidas glifosato e propanil foram significativa- Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38 51 mente antagônicos ao desenvolvimento de B. thuringiensis, e os mesmos produtos, inclu- indo o fungicida azoxistrobina, reduziram o crescimento de B. sphaericus, afetando esse microrganismo com mais intensidade. Entre- tanto, relatou uma provável compatibilidade dos herbicidas quincloraque e pirazosulfuron- etil e o inseticida fipronil para ambos ento- mopatógenos naturais do solo, propondo a sua utilização em Programas de MIP. Complementando os dados anteriores, Batista-Filho et al. (2001) verificaram que o inseticida fipronil apresentou um efeito sinér- gico aumentando a UFC de B. thuringiensis (Dipel®) quando utilizado na concentração mí- nima, mas não teve influência quando utili- zado na concentração máxima. Entretanto, Rohr (2005) mostrou que azoxistrobina, quin- cloraque e fipronil não apresentaram intera- ções significativas sobre os bioinseticida de B. thuringiensis kurstaki (Dipel®) e B. thu- ringiensis aizawai (Xentari®). Os dados dos ensaios realizados in vitro expõem ao máximo os microrganismos a ação dos produtos fitossanitários, podendo diferir das condições de campo, onde outros fato- res interferem, diminuindo a intensidade das reações. Nesse sentido, Alves et al. (1998) sa- lientam que a seletividade de um produto testado in vitro pode ser confirmado em cam- po, mas o antagonismo apresentado em la- boratório nem sempre pode ser verificado no campo. Os dados referentes às interações entre entomopatógenos e pesticidas em condições de campo são ainda mais reduzidos (Alves et al., 1998). Nesse enfoque, Azambuja (2006), em laboratório, concluiu que os agroquími- cos: fipronil, azoxistrobina, quincloraque, gli- fosato, propanil e pirazosulfuron-etil não in- terferiram na abundância de B. thuringiensis nem de B. sphaericus. Ressaltando esse pa- drão, Batista-Filho et al. (2001) estudaram a compatibilidade do tiametoxam e B. thurin- giensis (Dipel®), aplicados em lavouras de feijão, revelando que o inseticida não inter- feriu no potencial de inóculo do entomopa- tógeno, assim como in vitro, recomendando a utilização do produto em conjunto com a bactéria. Conforme foi verificado, no ambi- ente natural, os diversos fatores bióticos e abióticos atuam minimizando os possíveis impactos sobre os Bacillus spp. da ação dire- ta dos produtos fitossanitários (Alves et al., 1998). Em outro trabalho, Das et al. (2003) veri- ficaram a influência de dois inseticidas em diversos microrganismos presentes nos solos de cultivo de arroz. Esses autores mencio- nam que forato e carborufam estimularam o crescimento das populações de bactérias e as proporções de Bacillus sp. No entanto, o efei- to sinérgico de carbofuram foi mais pronun- ciado. Esse fato está relacionado à capacida- de de alguns microrganismos desse gênero utilizarem o inseticida e degradarem seus pro- dutos para o seu próprio desenvolvimento no solo. Como já mencionado, na literatura a res- peito de interações de microrganismos ento- mopatogênicos e agroquímicos, em condi- ções de campo, é muito restrita e quase a totalidade dos trabalhos realizados dessa natureza se referem aos fungos entomopa- togênicos avaliados in vitro. A falta de pa- dronização na realização dos testes é um dos problemas desse tipo de estudo que, em muitos casos, não permite uma compa- ração efetiva entre os produtos (Alves et al., 1998). Diante disso, os microrganismos ento- mopatogênicos que habitam naturalmente os agroecossistemas devem ser preserva- dos através de técnicas culturais e princi- palmente na utilização de pesticidas com- patíveis não comprometendo o MIP (Almei- da et al., 2003). 1.4 Controle microbiano de Fitopatógenos 1.4.1 Fungos Fitopatogênicos: Os fungos constituem um grupo de organismos que se caracteriza por nunca apresentarem tecido verdadeiro, por serem eucarióticos e aclorofilados. A maioria das espécies fúngicas é saprofítica, mas algu- mas desenvolveram a capacidade de para- sitar plantas, causando a morte ou um re- tardamento do desenvolvimento do hos- pedeiro. Devido aos sistemas intensivos de produção agrícola, o índice e a prevalên- cia de doenças têm aumentado significati- vamente, podendo, em alguns casos, cau- sar perda total da produção. Esse aumento de doenças em áreas agrícolas se deve prin- cipalmente ao desequilíbrio entre as dife- rentes populações microbianas do solo, do rizoplano, do fitoplano e endofíticas que interagem com plantas, permitindo o esta- belecimento e o desenvolvimento dos fun- gos patogênicos (Esposito & Azevedo, 2004). Os autores relatam que para o fungo patogênico colonizar a planta hospedeira, inicialmente ele precisa quebrar o seu sis- tema de defesa. Para isso, produz enzimas hidrolíticas (cutinases, celulases, ligninases e outras) que quebram a cutícula e a pare- de da celular hospedeira; toxinas que re- duzem ou inibem completamente a ativi- dade das células da planta a ser parasitada e/ou produzem substâncias específicas de plantas (hormônios) que quebram o equi- líbrio fisiológico da célula vegetal, causan- do distúrbios no crescimento e na diferen- ciação das células da planta (Esposito e Aze- vedo, 2004). Em geral, os fungos patogênicos apre- sentam três estágios de colonização da plan- ta hospedeira. Esses estágios são caracteri- zados pela germinação do esporo na su- perfície dos tecidos da planta hospedeira, pelo reconhecimento da superfície, pela formação de apressório e pela penetração nos tecidos vegetais. Estando no interior da planta, o fungo pode colonizar os espa- ços intercelulares e/ou intracelulares de forma parasítica e, posteriormente, produ- zir estruturas reprodutivas que permitam a sua disseminação (Esposito e Azevedo, 2004). 1.4.2 Efeitos de B. thuringiensis em fitopatógenos: Alguns microrganismos, como bactérias, fungos e actinomicetos, produzem metabó- litos capazes de inibir o crescimento de ou- tros microrganismos. Estas substâncias são diferentes na sua estrutura e distribuição, se restringindo aos poucos compostos e estan- do presentes em apenas alguns microrganis- mos (Kennedy, 1999). Os produtos do meta- bolismo secundário microbiano são alvos de pesquisas cada vez mais intensas na busca de substâncias bioativas, para atuação em di- versas áreas como a agricultura, veterinária e farmácia (Woodruff, 1980). Grande parte dos microrganismos envol- vidos no controle biológico atua através de antibiose, onde ocorre a interação entre or- ganismos, um metabólito produzido por um deles tem um efeito prejudicial sobre o ou- tro. A produção de metabólitos pode resul- tar na completa lise e dissolução da estrutu- ra celular e independe do contato físico en- tre os microrganismos (Bettiol & Ghini, 1995), dessa forma, a busca por microrganismos antagônicos a fungos fitopatogênicos tem aumentado (Benitez et al., 2004). Diversas espécies de Bacillus são citadas como pro- dutoras de antibióticos, podendo secretar me- tabólitos comercialmente importantes, como enzimas aminolíticas e enzimas proteolíticas (Bettiol & Ghini, 1995). Bettiol (1988), em trabalho de seleção de microrganismo antagônico a Pyricularia oryzae, verificou que B. subtilis foi o mais eficiente em inibir o crescimento micelial do patógeno, e constatando também que o an- tagonista apresenta boas características para uso como agente de controle biológico, pois, além de rápido desenvolvimento, tanto em meio de cultura como na natureza, produ- zem endósporo e antibióticos, crescem em larga faixa de temperatura e adaptam-se a várias condições ambientais. O processo para que ocorra o antago- nismo exige a degradação da parede celular fúngica por hidrolases secretada por micror- ganismos. Como quitina e beta-1,3-glucana são os principais componentes estruturais da parede celular fúngica, quitinases e glucana- ses podem ser importantes no controle bio- lógico desses microrganismos (Kulminskaya et al., 2001). Knaak et al. (2007) testaram as cepas e proteínas Cry1Ab e Cry1Ac sintetiza- das por Bacillus thuringiensis thuringiensis 407 (pH 408) e B. thuringiensis kurstaki HD- 73, respectivamente, sobre os fungos fitopa- togênicos Pyricularia grisea, Rhizoctonia so- lani, Fusarium oxysporum e F. solani. Veri- ficaram que as cepas B. thuringiensis, que sintetizam as proteínas Cry1Ab e Cry1Ac, re- duziram o crescimento micelial dos fungos R. solani, P. grisea, F. oxysporum e F. solani durante o período avaliado, quando compa- rado aos controles. As duas cepas inibiram o crescimento dos fitopatógenos testados até sete dias após a incubação, onde houve di- ferença significativa (P<0,05) entre os trata- 52 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38 mentos bacterianos e os grupos controle. Na avaliação da ação das proteínas Cry1Ab e Cry1Ac, sobre R. solani, P. grisea, F. oxys- porum e F. solani, não foi observada a for- mação do halo de inibição de crescimento. Nos resultados obtidos para germina- ção dos conídios também não houve dife- rença significativa (P<0,05) entre o contro- le e os tratamentos com as proteínas Cry1Ab e Cry1Ac sobre os fungos citados anterior- mente. Batista-Junior et al. (2002) testaram duas cepas: B. thuringiensis kurstaki HD1, produtor do cristal com atividade insetici- da e B. thuringiensis 407, mutante não pro- dutor do cristal protéico, contra os fitopa- tógenos F. solani, F. oxysporum e Colleto- trichum sp., concluindo que a ausência dos genes produtores do cristal protéico não interferiram no poder de degradação do micélio pelos isolados de B. thuringiensis estudados. O efeito inibitório das cepas de B. thu- ringiensis nas estirpes dos fungos fitopato- gênicos pode estar relacionado com a pro- dução de enzimas que podem ter ação con- tra a parede celular fúngica, já que algu- mas bactérias antagonistas de fungos fito- patogênicos produzem quitinases (Asaka e Shoda, 1996; Mavingui e Heulin, 1994). Nesse contexto, Barboza-Corona et al. (1999) selecionaram e caracterizaram enzi- mas (quitinases) de B. thuringiensis nati- vos do México, concluindo que a ação si- nérgica entre quitinases e proteínas Cry podem ser aplicadas no controle biológico de fitopatógenos. Diferentes tipos de fungos e bactérias produzem uma grande variedade de enzi- mas degradantes (Mauch et al., 1988). Sen- do assim, B. thuringiensis é uma bactéria que secreta quitinases em meios de cultura quando cultivada em meio com sais e qui- tina (Barboza-Corona et al., 2003). Alguns estudos sugerem que as quitinases de B. thuringiensis possuem potencial biotecno- lógico contra fungos fitopatogênicos (Es- cudero-Abarca et al., 2001; Reyes-Ramírez et al., 2004). La Vega et al. (2006) testaram à enzima quitinase, purificada de B. thuringiensis aizawai, a qual produz 66 kDa quitinase extracelular, nos fungos Fusarium sp. e S. rolfsii. Os fitopatógenos foram incubados com a enzima purificada por 120h, demons- trando que os valores de inibição do cres- cimento de S. rolfsii e Fusarium sp. foram superiores e estatisticamente diferentes do controle (11 e 24%, respectivamente). Os mesmos autores não encontraram diferen- ças significativas no crescimento com a enzima purificada, em comparação com o extrato bruto enzimático. Melent’ev et al. (2001) testaram o extrato bruto e purifica- do de quitinase de Bacillus sp. e descobri- ram que a enzima purificada perdeu a sua capacidade de inibir o crescimento de Fu- sarium oxysporum e Helminthosporium sativum. No entanto, há relatos de que al- gumas cepas bacterianas apresentam uma relação direta entre as suas habilidades para reprimir o crescimento de fungos fitopato- gênicos e para produzir quitinases (Inbar e Chet, 1991). Resmuska e Pria (2007) avaliaram o efei- to dos agentes antagonistas B. thuringien- sis e Trichoderma sp. no crescimento mi- celial, sobre os fungos fitopatogênicos: Scle- rotium rolfsii, Diaporthe phaseolorum, Pythium aphanidermatum., Monilinia fructicola, Sclerotinia sclerotiorum, Rhizoc- tonia solani. Verificaram que a bactéria B. thuringiensis mostrou-se eficiente no con- trole de M. fructicola, S. sclerotiorum, F. solani. e S. rolfsii, impedindo que o fungo S. sclerotiorum formasse escleródios. O fun- go Trichoderma sp., exerceu efeito no cres- cimento micelial do fungo S. rolfsii. B. thu- ringiensis mostrou-se mais eficiente que Trichoderma sp. no controle biológico dos fitopatógenos D. phaseolorum, P. aphani- dermatum, M. fructicola, S. sclerotiorum, R. solani e F. solani. 1.5 Referências Agrawal, A.A. 2000. Mecanisms, ecological consequences and agricultural implica- tions os tri-trophic interactions. Current Opinion in Plant Biology 3: 329-335. 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Os autores relatam que, em la- boratório, são utilizadas altas dosagens de biopesticida e oferecido apenas uma alter- nativa alimentar e que, em campo, o pre- dador tem alternativas de alimentação, não dependendo somente de uma presa infec- tada. Além dos produtos formulados a base de B. thuringiensis, atualmente as pesqui- sas na área biotecnológica visam a transfor- mação genética de plantas com os genes cry de B. thuringiensis para conferir a re- sistência dessas plantas aos insetos-praga. Plantas de milho, algodão e batata transgê- nicos têm sido comercializados (Shelton et al. 2002), porém, os dados de O’Callaghan et al. (2005) revelam que não foram detec- tados efeitos dessas plantas em insetos be- néficos, como polinizadores e inimigos na- turais. Nesse contexto, Romeis et al. (2008) relatam que dados como a descrição da cultivar, as características moleculares dos elementos genéticos inseridos na planta, a natureza e a estabilidade da expressão pro- téica, o espectro de ação das proteínas, a composição de macro e micronutrientes e as características morfológicas e agronômi- cas da planta, são exigidos pelas autorida- des para a regulamentação dessas plantas. Os autores mostram que o milho modifica- do com o gene expressando a proteína Cry 1Ab de B. thurigniensis, ativa a insetos da ordem Lepidoptera, não afeta insetos de outras ordens. Ou seja, as proteínas de B. thuringiensis são altamente específicas, não atingindo artrópodes não alvos. Na revisão de Fontes et al.(2002) são discutidos princípios e questões ecológicas, impacto ambiental e efeitos de plantas ge- neticamente modificadas no ambiente. Em relação aos inimigos naturais, os autores relatam a existência de fatores importantes em relação às plantas, como o ciclo de vida (anual ou perene) que difere na composi- ção das comunidades de artrópodes asso- ciados a essas plantas. Dos 41 trabalhos ava- liados pelos autores, 20 foram conduzidos em laboratório e desses, 14 não mostraram efeito sobre inimigos naturais, quando uti- lizadas plantas modificadas e não modifi- cadas. No restante (6 trabalhos) não foram observados efeitos em alguns inimigos na- turais. E em 14 de 21 trabalhos avaliados em campo, os autores não mostraram dife- rença na densidade de inimigos naturais entre áreas com plantas-Bt e plantas não transgênicas. Porém, nos 7 casos restantes ocorreu um decréscimo nessa densidade. No trabalho de Chen et al. (2008) fo- ram avaliados os efeitos diretos e indire- tos da proteína Cry1Ac de B. thuringiensis que está presente em plantas transgênicas de milho e algodão, sobre o parasitóide da lagarta Plutella xilostella, Diadegma insulare. Os autores utilizaram a planta transgênica e a proteína proveniente de uma formulação líquida comercial (MC), em três tratamentos: a proteína purificada, o produto comercial e a planta transgêni- ca. Também avaliaram o efeito de insetici- das a base de spinosad, indoxacarb, lamb- da-cialotrina e cipermetrina. Em seus re- sultados, observaram que, mais de 90% das lagartas foram parasitadas após a ingestão dos tratamentos, indicando que esses não influenciam o parasitismo. Porém, o nú- mero de D. insulare emergidos das lagar- tas, diferiu entre o controle e o grupo tra- tado com a formulação comercial, mas não diferiu entre o controle e as lagartas trata- das com a planta expressando a proteína Cry 1Ac ou somente com a proteína puri- ficada. Os autores citados também demons- traram que o parasitóide D. isulare foi al- tamente suscetível aos inseticidas comu- mente utilizados para o controle das la- gartas de P. xylostella, ocorrendo a morte dos mesmos após duas horas de contato. Sendo assim, os inseticidas usados afetam as populações do parasitóide e, conse- qüentemente aumentam as populações do inseto praga-alvo, no caso, P. xylostella. Estudo semelhante foi realizado por Torres & Ruberson (2008) com a mesma proteína expressa em plantas de algodão. Os resultados desse estudo mostraram que a proteína foi detectada em três níveis tró- ficos avaliados, porém, os insetos preda- dores e parasitas das lagartas de S. exigua não foram afetados quando as lagartas for- ma alimentadas com algodão transgênico. Um caso bem polêmico entre a comu- nidade científica, foi o trabalho de Losley et al. (1999) que mostrou que o milho ge- neticamente modificado com a proteína Cry1Ab de B. thuringiensis, afetou severa- mente a população da borboleta monar- ca, Danaus plexippus. Em seu trabalho foi comparado a alimentação, o crescimento e a mortalidade de lagartas que se alimen- tavam de plantas com pólen Bt, com pó- len de milho não modificado e plantas sem pólen. O resultado apresentou sobrevivên- cia de 56% com milho-Bt e 100% de so- brevivência com pólen normal e sem pó- len. Entretanto novas pesquisas foram rea- lizadas posteriormente como Stanley-Horn, et al. (2001) que avaliou 6 híbridos de B. thuringiensis em quatro cidades diferen- tes (EUA) divididos em duas etapas (na borda e na parte interna das lavouras) fren- te à D. plexippus. As conclusões dos auto- Figura 1. Mortalidade de camundongos CF1 submetidos aos tratamentos intraperitoneais com Bacillus thuringiensis, ( Susp. = suspensão contendo células e esporos; Sob. = sobrenadante da cultura; Prot. = proteína purificada; Test. = testemunha tratada somente com água; Número total de indivíduos = 15 por tratamento) 56 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38 res fornecem evidências de que a quanti- dade de pólen e a expressão de Cry1Ab no pólen predizem um impacto na alimenta- ção das lagartas da monarca, porém isso ocorre em lagartas do 1º instar, sendo que não ocorrem diferenças significativas da so- brevivência da monarca nas regiões com milho-Bt e milho não transgênico. Além disso, os autores identificaram a mortalida- de de lagartas poucas horas após a alimen- tação em áreas com milho não transgênico pulverizados com λ-cialotrina. A sobrevivên- cia e o crescimento foram afetados também em áreas próximas ao local. Entretanto pes- quisas devem continuar sendo realizadas para entender o impacto do milho não trans- gênico sendo que é relativamente de baixa toxicidade a borboletas monarca. Apesar desses dados o conhecimento a respeito da influência de novas tecnologias seja para a produção de biopesticidas ou para a transgenia, ainda são carentes de informação. Entretanto, os estudos realiza- dos até então indicam que efeitos nocivos em organismos não-alvo verificados em la- boratório são raramente detectados no am- biente, provavelmente porque a quantida- de de produto utilizada em laboratório é superior àquela utilizada e recomendada em campo. 1.2 Efeitos de B. thuringiensis sobre aves Um grupo de predadores de lagartas, os pássaros, também deve ser avaliado em relação ao uso de biopesticidas ou plantas geneticamente modificadas. Porém existem poucos dados na literatura a respeito desse assunto. Os autores Sopuck et al. (2002) relatam a utilização do produto comercial Foray 48B a base de B. thuringiensis. kurs- taki, para o controle de Lymantria dispar e avaliaram a resposta de pássaros associa- dos ao sul da Ilha de Vancouver, no Cana- dá. Em seus resultados não observaram di- ferença na abundância relativa de pássaros nas áreas tratadas e não tratadas com o bi- opesticida, entre os anos de 1999 e 2000, indicando que o tratamento não influencia na presença dos mesmos. Já Norton et al. (2001) avaliaram o efei- to secundário da mesma subespécie de B. thuringiensis citada acima porém proveni- ente do produto Thuricide, em aves da es- pécie Dendragapus canadensis. Os auto- res citam essa ave como um herbívoro pri- mário, porém os pintos, em suas primeiras duas semanas de vida, são essencialmente insetívoros. Lattner (1982) descreve a ali- mentação dessa ave como sendo cerca de 64% de lagartas, seguido de gafanhotos (10%), formigas (7%) e outras variedades de invertebrados e partes de plantas. O tra- balho de Norton et al. (2001) teve como objetivo avaliar os itens da dieta e o cresci- mento de D. canadensis em áreas tratadas e não tratadas com B. thuringiensis kurs- taki. Os resultados indicam que o cresci- mento dos pintos foi afetado em relação às duas áreas, ocorrendo uma redução de 30% no tamanho desses na área tratada com a bactéria. Porém esses dados podem estar relacionado ao fato de que, com a morte das lagartas devido à ingestão do patóge- no, os pintos passaram a se alimentar prin- cipalmente de formigas e estas tem um bai- xo índice de proteínas em comparação com às lagartas. Isso pode ser determinante para o decréscimo no tamanho dos pintos, uma vez que a dieta alimentar teve seu teor de proteínas também reduzido. 1.3 Efeitos de B. thuringiensis sobre mamíferos Pequenos mamíferos, como ratos e ca- mundongos, também estão associados às áreas agrícolas uma vez que esses animais podem se alimentar dos grãos das culturas. Então também existem pesquisas que ava- liam o possível efeito do entomopatógeno nesses mamíferos, sendo que a bactéria tam- bém pode produzir toxinas ativas a esses animais. Na área da saúde, os trabalhos de Pra- sad & Shethna (1975) sugerem que as pro- teínas de B. thuringiensis têm atividade antitumoral em sarcoma Yoshida em ratos, além de acentuarem a resposta imune de ovelhas. Yamashita et al. (2000), também demonstram efeito citocida em células de leucemia, em ensaios in vitro. Em relação a humanos, a revisão de Si- egel (2001) apresenta dados em que o pro- duto Thuricide (B. thuringiensis thuringi- ensis) foi ingerido (100mg) e inalado (100mg) por 18 pessoas, durante 5 dias, e esses não apresentaram nenhuma reação decorrente do microrganismo. Além dessa reportagem, o trabalho apresenta alguns dados sobre isolados de B. thuringiensis que foram re-isolados de queimaduras ou feri- das de pessoas, entretanto foi averiguado que a água utilizada para a limpeza desses ferimentos estava contaminada. Além dis- so, o autor relata que o isolado pode se desenvolver nesses locais feridos quando o sistema imune não está respondendo de forma adequada ao ferimento, mas não cau- sa nenhuma reação. Betz et al. (2000) relatam que B. thu- ringiensis kurstaki foi administrado em hu- manos voluntários durante 3 dias, na quan- tidade de 1000mg/pessoa ou 1x1010 espo- ros/mL, e não apresentaram sintomas de toxicidade, nem culturas de células bacteri- anas nas amostras de sangue avaliadas. Os autores relatam a presença das proteínas Cry 1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac e Cry 2Aa no isolado testado. Diferentes autores relatam os resultados de suas pesquisas com ratos tratados com B. thuringiensis. No caso de Bishop et al. (1999), a aplicação oral de 5.1010 esporos/ dia de B. thuringiensis thuringiensis e B. thuringiensis israelensis, em ratos não mos- trou diferença significativa no peso corpo- ral dos animais tratados e não tratados. Nos dados de Siegel (2001), ratos foram trata- dos via oral com 109 esporos/dia, por 730 dias, também não apresentaram nenhuma reação. Também em ensaios toxicológicos, Ber- litz et al. (2006) avaliaram o efeito da sus- pensão de células e esporos de B. thuringi- ensis aizawai proveniente do produto co- mercial Xentari e B. thuringiensis thuringi- ensis (H1), em ratos Wistar. Os autores ava- liaram o conteúdo estomacal e as fezes em SDS-PAGE, onde os resultados sugerem que as proteínas são degradadas no estômago dos animais. Os estômagos foram avaliados em estereomicroscópio (40x) não apresen- tando modificações superficiais, como pi- pocas vermelhas ou raias hemorrágicas, em relação ao grupo controle. Os autores con- cluíram que as proteínas de B. thuringien- sis não afetam os ratos quando administra- das oralmente. Em outra pesquisa, Berlitz (2006) ava- liou a suspensão e as proteínas purificadas de dois novos isolados bacterianos, em ca- mundongos CF1, via oral e intraperitoneal, divididos em grupos de 5 animais e três re- petições. Os dados dos tratamentos, via oral, não causaram mortalidade dos camundon- gos, porém nas administrações intraperito- neais os camundongos morreram a partir de 6horas após a aplicação dos tratamen- tos, quando aplicada a suspensão bacteria- na contendo células e esporos (Figura 1). Apesar desses resultados, deve-se sali- entar que injeções intraperitoneais não são uma via de acesso natural do entomopató- geno nos mamíferos. Essa mortalidade tam- bém não deve estar associada à thuringien- sina, uma proteína tóxica a vertebrados que é produzida pelo entomopatógeno, pois essa toxina está presente no sobrenadante da cultura, e esse tratamento não causou a mortalidade dos animais. O tratamento via oral, não causou rea- ções nos camundongos. Nesse sentido, Betz et al. (2000) revelam que as proteínas Cry1, Cry2 e Cry3 são degradadas em 30 segun- dos após a ingestão, em ensaios in vitro, resultando em proteínas de 2 kDa. Também, os dados de Vasquez-Padrón et al. (2000) e Moreno-Fierros et al. (2000) revelaram que camundongos Balb/c apresentaram eleva- da produção de anticorpos IgA, seguidos de IgG e IgM, após a administração oral, retal e intraperitoneal da proteína Cry1Ac, mostrando uma eficiente resposta imune desses animais. Como já comentado anteriormente, as preocupações têm sido em torno dos efei- tos das plantas geneticamente modificadas com genes de B. thuringiensis em seus con- sumidores. Porém, Azevedo & Araújo (2003) mostram a ausência de efeitos tóxicos, mu- tagênicos, teratogênicos ou clastogênicos dessas plantas. Betz et al. (2000) também relatam que as proteínas Cry de B. thurin- giensis não são tóxicas em contato direto, sendo que a exposição de animais não-alvo é extremamente baixa e a presença dessas proteínas nos tecidos vegetais também ocor- re em baixas concentrações. Romeis et al. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38 57 (2008) também comentam que os testes la- boratoriais utilizando essas plantas, são con- duzidos com elevadas concentrações da proteína purificada, muito acima daquelas concentrações encontradas nos tecidos das plantas. Apesar desses dados, periodicamente estão sendo lançados produtos comerciais à base de B. thuringiensis e que, para che- garem ao mercado devem passar por dife- rentes análises para confirmar a não toxici- dade em organismos não-alvo. O mesmo ocorre com as plantas geneticamente mo- dificadas que são testadas em diferentes organismos para garantir a sua segurança. Nesse sentido, a Lei de Biossegurança nº 11.105, estabelece as normas de segurança e os mecanismos de fiscalização de ativida- des que envolvam organismos geneticamen- te modificados e seus derivados. 1.4 Referências Azevedo J L, Araújo W L 2003. Genetically modified crops: environmental and human health concerns. Mutation Re- search. 544: 223-233. Berti Filho, E.; Ciociola, A.I. Parasitóides ou predadores? Vantagens e desvantagens. In: Parra, J.R.P. (ed.); Botelho, P.S.M.; Corrêa-Ferreira, B.S.; Bento, J.M.S. Con- trole biológico no Brasil: parasitóides e predadores. São Paulo: Manole, 2002. Cap. 3, p.29-41. Berlitz, D.L.; Giovenardi, M. ;Fiuza, L.M. 2006. Toxicology effects of ä-endoto- xins and â-exotoxins of Bacillus thu- ringiensis in Wistar rats. Neotropical Biology and Conservation. 1(1): 35-38. Berlitz, D.L. 2006. 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Nos estudos toxicológicos dos bi- opesticidas podem ser avaliados so- mente o ingrediente ativo ou a for- mulação que se deseja registrar, po- dendo ambas as formas serem avali- adas simultaneamente. Após as aná- lises requeridas pela ANVISA e IBA- MA, é o MAPA quem registra a for- mulação do produto, publicando a decisão no Diário Oficial da União, com validade nacional e tempo in- determinado (Gallo et al.,2002). 1.2 Produtos comerciais à base de B. thuringiensis Entre os biopesticidas, a base de B. thuringiensis (Entwistle et al, 1993; Schnepf et al., 1998), apresentados na Tabela 1, alguns se destacam no controle biológico de pragas agríco- las por serem utilizados há várias décadas, levando atualmente esse entomopatógeno a quase totalidade do mercado dos pesticidas microbia- nos. B. thuringiensis é um importante agente de controle de insetos-praga, principalmente para lepidópteros e coleópteros, porque seu ingrediente ativo tóxico, representado por pro- teínas Cry, pode ser considerado ató- xico aos vertebrados e aos insetos não-alvo (Siegel, 2001). Por outro lado, as formulações comerciais de B. thuringiensis apresentam uma es- tabilidade limitada a campo, além de apresentarem um período de aplica- ção crítico devido à redução da sus- cetibilidade com o desenvolvimento larval dos insetos. Para complementar e manter atu- alizadas essas informações recomen- da-se a revisão de alguns sites que indicados a seguir: - www.andef.com.br (Associação Nacional de Defesa) - www.epa.gov (EPA – Environ- mental Protection Agency) - www.anvisa.gov.br - www.ibama.gov.br - www.agricultura.gov.br - http: www. pesticide.net - http://pesticideinfo.org - http://foodchemicalnews.com - http://www.cnpma.embrapa.br Quanto às formulações de B. thu- ringiensis israelensis e comercializa- ção em escala mundial contra dípteros, especialmente os vetores de doenças humanas como Aedes aegypti, destacam- se os seguintes produtos (Thomas e Ellar, 1983; Armstrong et al., 1985; Thi- ery et al., 1996; Andrade, 2008): • Vectobac, Skeetal, Bactimos (Abbot) • Teknar (Sandoz) • Aquabac (Becker Microbials) • LarvX SG (Meridian Precision Realease Technologies) • Biotouch (Zohar Dalia) • Culinex (Culinex Gmbh) • Bacticide( Biotech International Ltd) • Bactivec (Labiofam) • Bt Horus SC (Bthek) (http:// www.bthek.com.br) Os mesmos autores também menci- onam algumas formulações comerciais de B. sphaericus para o controle de lar- vas de Culex pipiens, como: • Spherimos e Vectolex (Abbot) • Sphericide (Biotech Internatio- nal Ltda) • Spicbiomoss (Turicorin Alkali Chemicals and Fertilisers Ltda). Apesar de haver um número signifi- cativo de produtos à base de B. thurin- giensis, ainda há um longo percurso para que sejam atingidas a maioria das ordens de insetos-praga de importân- cia agrícola e vetores de doenças hu- manas. Enquanto mais pesquisas vêm sendo desenvolvidas nessa área, devem ser priorizados os biopesticidas já re- gistrados e comercializados para o con- trole de insetos a fim de reduzir a con- taminação ambiental causada pelos in- seticidas químicos. 1.3 Referências ANDRADE, C.F.S. 2008. Controle Bioló- gico de Borrachudos – Dosagens de Produtos a Base de Bacillus thurin- giensis var. israelensis Artigos Téc- nicos - Unicamp, Instituto de Biolo- gia, Dep. de Zoologia, Campinas, 2008. Site Ecologia Aplicada, 19p. Disponível em: http:// w w w . i b . u n i c a m p . b r / p r o f s / eco_aplicada/. Acesso em: 04.12.08 ANDREI, E. Compêndio de defensivos agrícolas. 6 ed. São Paulo, Organi- zações Andrei. 1999. 672p. ALVES, S.B. 1998. 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A biotecnologia ve- getal, através do desenvolvimento de téc- nicas de biologia celular e molecular de vegetais superiores oferece novas possi- bilidades ao melhoramento de plantas cul- tivadas, facilitando a obtenção de plantas resistentes ao ataque dos insetos. A trans- formação genética e a regeneração in vi- tro de plantas, somadas à disponibiliza- ção de genes de interesse agronômico, destinados a introdução em plantas, têm permitido a geração de plantas transgêni- cas com características específicas, sem o rompimento de combinações genéticas já selecionadas pelos programas convenci- onais de melhoramento genético de plan- tas cultivadas. A transformação de plan- tas com genes de origem microbiana, ve- getal e animal, os quais codificam especi- ficamente toxinas com efeito inseticida, vem sendo considerada uma alternativa re- levante junto aos métodos de controle de insetos-praga das plantas de interesse eco- nômico, onde se destacam as plantas-Bt resistentes a diversas ordens de insetos, principalmente aos lepidópteros e coleóp- teros. 1.1 Genes de B. thuringiensis em plantas B. thuringiensis apresenta um geno- ma de 2,4 a 5,7 milhões de pares de ba- ses, com elementos extracromossômicos lineares ou circulares (Carlson et al., 1994). Os genes cry estão localizados em plas- mídios, sendo esses responsáveis pela sín- tese de diferentes proteínas inseticidas, cuja clonagem e caracterização desses genes em 1981 (Schnepf & Whiteley, 1981) revelou novas perspectivas de aplicação do entomopatógeno. Entre essas se encon- tra a transgenia que permite introduzir os genes de B. thuringiensis codificadores das toxinas nos genomas dos vegetais, permi- tindo a expressão contínua das proteínas em todos os tecidos da planta e atingin- do, assim, apenas os insetos-praga que se alimentam dos tecidos (de Maagd et al., 1999). A primeira geração de plantas trans- gênicas resistentes a insetos foi desenvol- vida com o uso de genes codificadores de proteínas inseticidas de B. thuringiensis (Fischhoff, 1987; Vaeck et al., 1987). Os genes cry de B. thuringiensis são talvez os exemplos mais conhecidos de genes exógenos para os quais tem sido difícil obter um nível satis- fatório de expressão em plantas transgênicas (Diehn et al.,1996). A baixa expres- são dos genes de B. thurin- giensis em plantas tem sido associada à instabilidade das moléculas de mRNA, uma característica ampla- mente observada da expres- são destes genes em plan- tas é o pouco ou nenhum acúmulo de mRNA mesmo quando sob controle de promotores fortes. Para tan- to várias modificações têm sido testadas para aumentar a eficiência de expressão destes genes, como adaptar os códons pre- ferenciais de bactérias para códons prefe- renciais de plantas e/ou aumentar o con- teúdo de G/C nas seqüências codificantes (Perlak et al., 1991), retirada de sítios de splicing, modificações dos sinais de poli- adenilação dentro da região codificante (Koziel et al., 1993), inserção de íntrons na região 5’ da seqüência não traduzida (Jouanin et al., 1998) bem como a inser- ção de genes nativos em cloroplastos ini- cialmente restrita a tabaco (McBride et al., 1995). Genes parcialmente ou totalmente sin- téticos têm sido construídos, nestes genes a seqüência de nucleotídeo é modificada sem a troca da seqüência de aminoácido, a expressão destes genes em plantas au- mentou significativamente (de menos de 0,001% de proteína solúvel na folha para até 1%), sendo os genes totalmente sinté- ticos os mais eficientes em testes de cam- po (Jouanin et al., 1998). Os estudos iniciais se basearam em plantas como tabaco e tomate (Barton et al., 1987; Fischhoff et al., 1987; Vaeck et al., 1987) devido às facilidades de trans- formação, cultivo em casa de vegetação e crescimento rápido. Vários genes quimé- ricos contendo um gene promotor de ori- gem vegetal; a seqüência completa do gene cry e uma região de poliadenilação foram introduzidos em tabaco e tomate, porém nenhuma expressão foi detectada em ta- baco e níveis muito baixos foram obser- vados em tomate (Perlak et al., 2001). A truncagem da seqüência codificadora do gene cry por eliminação da metade 3’ desta seqüência aumentou a expressão para níveis detectáveis de proteína e mRNA (Estruch et al., 1997). Os primeiros testes de campo com versões truncadas do gene cry foram eficientes no controle de Heli- coverpa zea no caso do tomate (Perlak & Fischhoff, 1993), porém não no controle de Heliothis virescens no caso do algodão (Jenkins et al., 1991). Os resultados mais efetivos foram obtidos utilizando genes sin- téticos (Perlak et al., 1990; Perlak et al., 1991; Van der Salm et al., 1994). Lidia Mariana Fiúza Engenheira Agrônoma (UPF), Mestre em Fitotecnia – Fitossanidade (UFRGS), Doutora em Ciências Agronômicas (ENSAM-Montpellier) e Pós-Doutora em biotecnologia Vegetal (CIRAD-Montpellier). Laura Massochin Nunes Pinto Bióloga (PUCRS) e Mestre e Doutoranda em Biologia: Diversidade e Manejo de Vida Silvestre (UNISINOS). Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38 65 GENES / PRODUTOS CMe (cevada); CMTI (abóbora); MTI-2 (mostarda); PI-IV (soja); KTi3 e SKTI (soja); inibidor de proteinase I e II (tomate); SI (animal); α1AT(animal) Pot PI-I e Pot PT-II (batata); BPTI (pâncreas bovino); C-II (soja); CpTI (cowpea) OC-1 (arroz) anti-quimiotripsina (Manduca sexta), anti-elastase (M. sexta), anti-tripsina (M. sexta) Inibidores de alfa-amilase WMAI-1 (cereais) αAI-Pv (feijão) Lectinas GNA (anêmona), p-lec (ervilha) WGA (trigo), lectina (arroz), jacalin Outros BCH – quitinase (feijão) Quitinase (Manduca sexta) Quitinase(tomate), Peroxidase(fumo) TDC (crisântemo) 14K-CL (bifuncional) * INSETOS-ALVO Lepidoptera Lepidoptera, Orthoptera Coleoptera, Lepidoptera Coleoptera, Homoptera Homoptera Lepidoptera Coleoptera Lepidoptera, Homoptera Lepidoptera, Coleoptera Lepidoptera, Homoptera Lepidoptera Lepidoptera, Homoptera, Coleoptera Homoptera Lepidoptera, Coleoptera PLANTAS TRANSFORMADAS / PRODUTOS fumo, arabidopsis, batata, alfafa, beladona, tomate petúnia, fumo, bétula, alface, arroz, batata, trevo branco colza, álamo, batata, fumo, maçã, alface, arroz, morango, girassol, batata-doce, tomate colza, álamo, fumo algodão, fumo, alfafa fumo feijão, ervilha, fumo uva, colza, batata, arroz, batata-doce, cana- de-açúcar, girassol, fumo, tomate milho batata fumo colza, fumo, tomate fumo fumo * bifuncional: inibidor de proteinases serínicas e de alfa-amilases mente lepidópteros, têm adquirido resis- tência às proteínas Cry de B. thuringien- sis, reforçando assim o compromisso das futuras pesquisas na identificação de no- vas toxinas inseticidas. Também são con- siderados importantes os estudos sobre expressão gênica, espectro de ação e es- pecificidade das proteínas inseticidas, per- mitindo a disponibilização freqüente de novas versões gênicas mais eficazes, mais específicas e com vantagens ainda maio- res sobre as práticas convencionais de controle de pragas. Ainda para evitar ou retardar o surgimento de resistência de insetos às plantas transgênicas, recomen- da-se a adoção de técnicas de manejo ade- quadas, sendo algumas já relatadas por Peferoen (1997) há mais de uma década. A aplicação integrada das plantas transgênicas na agricultura convencional, já ultrapassou a aceitação pública da tec- nologia dos transgênicos e atualmente re- presenta uma realidade no incremento da produção de alimentos de origem vege- tal, com baixo custo e impacto ambiental. 1.5 Referências ADAMCZYK, J.J.; ADAMS, L.C.; E HAR- DEE, D.D. 2001. 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As informações acima demonstram claramente a presença de genes para resistência às toxinas de B. thuringien- sis em populações de várias espécies mesmo que em baixa freqüência. É pre- ciso destacar que até o momento não foi registrada nenhuma população na- tural resistente a essas toxinas. O que é necessário para que estes genes aumen- tem em freqüência nas populações na- turais? A resposta simples é: que as apli- cações das toxinas B. thuringiensis tor- nem-se numa pressão de seleção cons- tante e intensa. 1.3 Fluxo gênico Estudos sobre a estrutura genética de populações têm demonstrado, ao longo do tempo, que as espécies rara- mente são constituídas por populações únicas e panmíticas; pelo contrário, di- ferenças genéticas são encontradas en- tre as populações. Essas diferenças são componentes importantes da diversida- de genética da espécie. Em geral, a tro- ca de genes ocorre com maior probabi- lidade entre populações próximas geo- graficamente do que entre populações mais distantes, sendo influenciada pela estrutura geográfica e espacial das po- pulações. Portanto, o estudo da estru- tura genética das populações é um com- ponente importante de programas de manejo e controle de pragas, pois po- dem fornecer informações sobre níveis de variabilidade genética, graus de di- ferenciação entre as populações e pa- drões de fluxo gênico. Além disso, pode possibilitar o monitoramento das mu- danças na freqüência de genes es- pecíficos. A caracterização genética das es- pécies alvo, ao longo de sua área de distribuição, é um dos fatores que podem contribuir para o sucesso de programas de controle biológico (Hoelmer & Kirk, 2005). O fluxo gênico é um componente importan- te para as estratégias de manejo da evolução da resistência e seus efei- tos podem ter reflexos em pequena e grande escala. Em pequena escala (populações locais) espera-se que ele contribua para diluição da resistência levando ao cruzamento entre insetos resis- tentes e não resistentes. Sua intensi- dade tem efeitos na taxa de aumen- to da freqüência dos genes para re- sistência. A capacidade de dispersão de um inseto praga é relevante para definição do tamanho e distribuição das áreas de refúgio, uma vez que estas são os locais para manutenção de indivíduos susceptíveis possibili- tando o fluxo de genes não-resisten- tes para grupos de indivíduos resis- tentes nas áreas de plantas-Bt (Va- cher et al., 2006). Em grande escala, o fluxo gêni- co pode determinar a possibilidade dos genes para resistência se espa- lharem ao longo da área de distri- buição geográfica da espécie. Esse fenômeno influencia a velocidade em que uma adaptação que surge numa população local pode se es- palhar. Os possíveis impactos do fluxo gênico na evolução da resistência torna fundamental dispor de estudos precisos sobre a estrutura genética das populações de insetos-praga vi- sando estimar seu impacto em po- pulações locais e também em lon- gas distâncias. Especialmente no caso de pragas com ampla área de distribuição que atacam culturas di- ferentes. Estudos de estrutura genética têm potencial para responder questões relevantes para o manejo destas es- pécies, como por exemplo: os inse- tos que atacam plantas diferentes for- mam linhagens distintas? Qual o grau de diferenciação genética entre as linhagens? Quando as linhagens ocorrem na mesma área, os cruza- mentos são aleatórios ou não? Qual a capacidade de dispersão a longas distâncias? A reprodução ocorre an- tes ou depois da dispersão dos insetos? 1.4 Efeito de seleção e evolução da resistência A seleção natural pode ser definida como diferenças na taxa de reprodu- ção e/ou sobrevivência entre indivídu- os com características distintas. De uma maneira mais simples, os indivíduos com as melhores respostas aos proble- mas de sobrevivência e reprodução deixam mais genes para as próximas gerações. O efeito da seleção natural sobre as populações aumenta a freqüên- cia dos alelos com resposta “positiva”, gerando uma mudança adaptativa. De acordo com a hipótese da rainha ver- melha (Van Valen, 1973) é preciso evo- luir (adaptar-se) continuamente para não ser “superado” pelos seus compe- tidores. A capacidade de evoluir é uma ca- racterística dos organismos vivos, mes- mo que no processo ocorram extinções de muitas linhagens, mas a “vida” no planeta Terra tem mantido sua capaci- dade de encontrar novos caminhos, reinventando a si mesma de diferentes maneiras. Nossa relação com os insetos-praga é apenas parte do processo e, por mai- or que seja nosso empenho, não con- seguimos superá-las; até hoje apenas nos esforçamos para reduzir seu impac- to sobre nossa existência. Essa relação iniciou quando inventamos a agricultu- ra e desde então estamos envolvidos numa corrida ao armamento. Nossas armas envolvem os diferentes métodos de controle, com destaque para a apli- cação em massa de produtos químicos sintéticos após a segunda guerra mun- dial e, mais recentemente, o desenvol- vimento das plantas-Bt. A crescente utilização de B. thurin- giensis como biopesticidas e a amplia- ção das áreas de plantio com plantas- Bt certamente aumentam a pressão de seleção desse agente sobre as popula- ções alvo. O primeiro formulado comercial de B. thuringiensis surgiu na França, em 1938 e sua introdução nos Estados Uni- dos ocorreu em 1950. Desde então essa bactéria vem sendo utilizada amplamen- te para controle de pragas (Sayyed e Wright, 2002). Em 1996, foram comer- cializados e plantados algodão-Bt e milho-Bt em milhares de hectares nos Estados Unidos (Gould, 1998). A partir de então, foram produzidas outras plan- Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38 71 tas com genes B. thuringiensis, e a área plantada foi ampliada, estendendo-se para outros continentes. Em 2002 fo- ram plantados, no mundo, 14 milhões de hectares apenas de algodão-Bt e mi- lho-Bt (James, 2002; Bourguet et al., 2005). A expressão das toxinas de B. thu- ringiensis nas plantas transgênicas é considerada um dos maiores avanços no uso de biopesticidas. Segundo Ja- mes (2007), as lavouras de plantas-Bt aumentaram anualmente, atingindo 114,3 milhões de hectares no mundo, em 2007. As informações disponíveis indicam claramente que as condições para evo- lução da resistência contra as toxinas de B. thuringiensis existem, ou seja, as populações apresentam genes para re- sistência (mesmo que em freqüência baixa) e a pressão de seleção aumenta anualmente. Cientes desta situação os profissio- nais da área de manejo e controle de pragas colocaram em prática o que cha- mamos de manejo da resistência, isto é, um conjunto de procedimentos que tem por objetivo retardar ao máximo o surgimento de populações resistentes em campo. 1.5 Manejo da Evolução da Resistência Uma população se torna resistente quando a maioria dos insetos susceptí- veis ao método de controle utilizado foi removida. A maior taxa de cruzamen- tos entre insetos portadores do gene para resistência tornará o controle mais difícil a cada geração. No intuito de eliminar ou retardar o aumento na freqüência dos genes para resistência às toxinas de B. thuringien- sis em populações de insetos-alvo, fo- ram desenvolvidas várias estratégias de manejo da evolução da resistência. A finalidade destas estratégias é reduzir a pressão de seleção, diminuindo a velo- cidade de crescimento da população de insetos resistentes. A estratégia mais utilizada no ma- nejo da resistência é denominada de altas doses/refúgio estruturado e fun- damenta-se em modelos teóricos e tes- tes experimentais realizados em peque- na escala (Georghiou & Taylor, 1977; 1999; Gould, 1998; Peck et al., 1999; Caprio, 2001, Onstad et al., 2002; Liu & Tabashnik, 1997; Shelton et al., 2000; Wenes et al., 2006). As premissas dessa estratégia são: (i) o gene para resistência ocorre em freqüência baixa nas populações; (ii) as quantidades de toxinas de B. thuringiensis produzidas pelas plantas são altas o suficiente para eliminação da população os insetos homozigotos não resistentes e os heterozigotos re- sistentes; (iii) os indivíduos resistentes (homo- zigotos) que nascem nas áreas com plantas-Bt cruzam aleatoriamente com os indivíduos não resistentes que nas- cem nas áreas dos refúgios. No manejo da resistência, o refúgio é a área na qual não são cultivadas plan- tas-Bt e sua finalidade é manter na po- pulação indivíduos susceptíveis às to- xinas de B. thuringiensis, ou seja, aque- les que não possuem genes para a re- sistência. Sua contribuição é a produ- ção de insetos adultos susceptíveis às toxinas de B. thuringiensis para cruza- rem com insetos homozigotos resisten- tes, “diluindo”, dessa forma, a resistên- cia na população. A dispersão para fora das áreas dos refúgios é necessária para que os cruzamentos aconteçam. As dimensões e a distribuição das áreas de refúgio são definidas com base em estudos teóricos e experimentos de campo podendo variar de acordo com a cultura ou praga em questão. A área dos refúgios para milho-Bt varia entre 20 e 50%; simulações de computador indicam que áreas menores podem ace- lerar a evolução da resistência. Para al- godão-Bt, por outro lado, recomenda- se que 5 a 20% da área de plantio seja destinada ao refúgio (Technology Use Guide, 2007-2008). São fatores relevantes na definição da área de refúgio: a capacidade de dis- persão da praga, sua biologia reprodu- tiva e seus hábitos alimentares. A distri- buição dos refúgios também procura reduzir a possibilidade de cruzamentos entre indivíduos homozigotos para o gene da resistência (Peck et al., 1999; Caprio, 2001; Ives & Andow, 2002; Va- cher et al., 2006; Tyutyunov et al., 2007; 2008; Hanur, 2008). A expressão “doses altas” significa que as plantas vão produzir quantida- des das toxinas de B. thuringiensis su- ficientes para eliminar da população os indivíduos que possuem uma única có- pia do gene para resistência, ou seja, os heterozigotos. Por definição, “dose alta”, é aquela suficiente para matar mais do que 95% dos insetos heterozigotos (Georghious & Taylor, 1977; Roush, 1994; Gould, 1998). Essa estratégia torna a resistên- cia uma característica funcionalmen- te recessiva, uma vez que apenas os portadores de duas cópias do gene sobrevivem às doses de toxina pro- duzida pelas plantas-Bt (Tabashnik & Croft, 1982). Nas áreas com plan- tas-Bt sobreviverão apenas os raros portadores de duas cópias do gene para resistência, ou seja, os homo- zigotos recessivos. Os cruzamentos aleatórios entre os raros indivíduos resistentes nas áreas com plantas- Bt e os indivíduos não resistentes dos refúgios, produziria indivíduos susceptíveis que seriam eliminados quando se alimentassem de plantas- Bt (Gould, 1998; Vacher et al., 2006). Na teoria, a estratégia “altas do- ses/refúgios estruturados” funciona muito bem, ou seja, dentro das pre- missas ela realmente reduz a veloci- dade de aumento na freqüência do gene para a resistência nas popula- ções aumentando, com isso, o tem- po de uso das plantas-Bt. O mundo real, porém, tem diversas maneiras de se desviar das aceitações do mo- delo. Estudos sobre o padrão de he- rança da resistência indicam que outros mecanismos genéticos podem ocorrer, como por exemplo, domi- nância e herança poligênica (Heckel et al., 2007). Além disso, os cruza- mentos podem não ocorrer aleato- riamente; para isso, basta que exis- tam diferenças na velocidade de de- senvolvimento entre indivíduos re- sistentes e susceptíveis. A assincro- nia no desenvolvimento pode de- terminar uma freqüência maior de cruzamentos entre indivíduos resis- tentes, o que pode acelerar a evolu- ção da resistência (LIU et al., 2000; Medvinsky et al., 2007). 1.6 Considerações A espécie humana, não tem mui- tas respostas para explicar como a vida surgiu no planeta Terra, mas ao longo do tempo fez muitas des- cobertas sobre as forças envolvidas no processo de evolução da biodi- versidade e nas mudanças adaptati- vas nas diferentes linhagens de or- ganismos. A evolução é um processo com- plexo, influenciado pela mutação, seleção natural, fluxo gênico, deri- 72 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38 va genética e sistema de cruzamen- tos. As interações entre estes fatores são complexas e de difícil compre- ensão. A construção de modelos para simular o efeito destes fatores permi- te analisar parcialmente estas intera- ções. Atualmente em muitos casos temos respostas relativamente preci- sas de como as coisas aconteceram, por exemplo, sobre a evolução da re- sistência aos inseticidas e/ou antibió- ticos. Podemos fazer muitas previsões, porém estas estão envolvidas num mundo de incertezas, determinadas pela presença do acaso ou das inte- rações que nossos modelos não po- dem estimar, pois são uma simplifi- cação do mundo real. Muitos pesquisadores acreditam que o surgimento de linhagens resis- tentes a agentes de controle químico e/ou biológico em populações natu- rais não é uma questão de “se” vai acontecer, mas sim, “quando” irá ocorrer. Estas preocupações são váli- das também para as plantas-Bt (Wri- ght et al., 1997; Gould, 1998; Tabash- nik & Carriére, 2004, Tabashnik et al., 2004 e 2008; Bourguet et al., 2005). Quando analisamos um fenôme- no biológico do ponto de vista da te- oria da evolução, as unidades de tem- po devem ser pensadas em perspec- tivas diferentes; estas envolvem ge- rações que se sucedem ao longo do tempo. As unidades de tempo envol- vem períodos maiores do que aque- les que usamos para datar a história da civilização, ou seja, 50 ou mesmo 100 anos, podem ser pouco relevan- tes. As constantes pesquisas por no- vas toxinas e/ou a produção de plan- tas com capacidade de expressar mais do que uma toxina é um indicativo de nossa consciência de que as plan- tas-Bt cultivadas atualmente podem ser sucessos temporários. No momento, nossa melhor alter- nativa é continuar aplicando as es- tratégias de manejo da evolução da resistência e aprimorar as pesquisas por novos métodos para reduzir os impactos das pragas sobre a produ- ção de alimentos. Devemos ter em mente, porém, que essa relação evolutiva só poderá terminar com a extinção de um dos envolvidos, mas dada à dinâmica do processo evolutivo, podemos afirmar que novas relações irão surgir. 1.7 Referências Adamczyk, J.; Holloway, J.W.; Leonard, B.R. & Graves, J.B. 1997. Suscepti- bility of fall armyworm collected from different plant host to selec- ted insecticides and transgenic Bt cotton. The Journal of Cotton Sci- ence, 1: 21-28. Aikhionbare, F.O. & Mayo, Z.B. 2000. 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