Ácido hipúrico na urina

Ácido hipúrico na urina

1. Finalidade

Determinar a quantidade de ácido hipúrico (AH) na urina para monitorização de indivíduos que possivelmente está exposto ocupacionalmente ao tolueno. Monitorização onde a coleta da amostra é por meio não invasivo, utiliza-se a urina, e para quantificação usa-se a técnica de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE ou, mais comumente, HPLC) que se trata de uma técnica muito sensível e, portanto de alta precisão.

2. Fundamentos dos Métodos

O ácido hipúrico é considerado um marcador de exposição ocupacional para o tolueno estando a sua concentração relacionada à exposição ocupacional, durante a jornada de trabalho do dia. O tolueno é um composto aromático também chamado de metilbenzeno por sua estrutura química. É um líquido incolor, volátil quando em pressão de vapor a 25°C, com propriedade significativa de lipossolubilidade e que apresenta traços de benzeno de até 25%, quando utilizado para fins comerciais. A absorção ocorre principalmente pela via pulmonar, sendo que cerca de 40% do tolueno inalado é absorvido pelos pulmões. A absorção ocorre principalmente pela via pulmonar, sendo que cerca de 40% do tolueno inalado é absorvido pelos pulmões. A principal via de biotransformação é a oxidação do grupamento metila. O primeiro passo corresponde à formação do álcool benzílico, mediado pelo citocromo P450. Segue-se a oxidação a benzaldeído, pela ação de álcool desidrogenase e finalmente a formação do ácido benzóico, etapa catalisada pela enzima aldeído desidrogenase. Este ácido se conjuga principalmente com a glicina, formando o ácido hipúrico e em menor proporção com o ácido glicurônico, produzindo benzoilglicuronatos.

A cromatografia é um método físico-químico de separação. Ela está fundamentada na migração diferencial dos componentes de uma mistura, que ocorre devido a diferentes interações, entre duas fases imiscíveis, a fase móvel e a fase estacionária. A grande variedade de combinações entre fases móveis e estacionárias a torna uma técnica extremamente versátil e de grande aplicação. A cromatografia pode ser utilizada para a identificação de compostos, por comparação com padrões previamente existentes, para a purificação de compostos, separando-se as substâncias indesejáveis e para a separação dos componentes de uma mistura. O grande avanço na cromatografia em coluna foi o desenvolvimento e a utilização de suportes com partículas diminutas responsáveis pela alta eficiência, as quais tornam necessário o uso de bombas de alta pressão para a eluição da fase móvel, devido a sua baixa permeabilidade. A Figura 1 mostra um equipamento típico de CLAE. As fases móveis utilizadas em CLAE devem possuir alto grau de pureza e estar livres de oxigênio ou outros gases dissolvidos, sendo filtradas e desgaseificadas antes do uso.

Figura 1 - Esquema do equipamento de CLAE (HPLC)

A bomba deve proporcionar ao sistema vazão contínua sem pulsos com alta reprodutibilidade, possibilitando a eluição da fase móvel a um fluxo adequado. As válvulas de injeção usadas possuem uma alça de amostragem para a introdução da amostra com uma seringa e duas posições, uma para o preenchimento da alça e outra para sua liberação para a coluna. Existem alças de diversos volumes, sendo utilizadas geralmente alças na faixa de 5-50 µL para injeções analíticas e 0,5-2 mL para preparativas. As colunas utilizadas em CLAE são geralmente de aço inoxidável, com diâmetro interno de cerca de 0,45 cm para separações analíticas e na faixa de 2,2 cm para preparativas. O comprimento é variável, sendo comuns colunas analíticas de 10-25 cm e preparativas em torno de 25-30 cm. Essas colunas são reaproveitáveis, sendo empacotadas com suportes de alta resolução, não sendo necessária sua regeneração após cada separação. O detector mais utilizado para separações por CLAE é o detector de ultravioleta, sendo também empregados detectores de fluorescência, de índice de refração, e eletroquímicos, entre outros. Detectores de polarimetria para CLAE, recentemente desenvolvidos, diferenciam compostos quirais, através da rotação de seus estereoisômeros frente à luz plano-polarizada.

3. Fluxograma dos Métodos

4. Resultados e Discussão

Temos os valores para a construção da curva padrão mostrados na tabela abaixo:

Padrões de AH Área do pico

Centrifugar a 200 RPM por 15min.

Adicionado em um tubo de ensaio 1 mL de etanol + 1mL de urina (misturado com Mixer)

Injetado 20 µl do sobrenadante no HPLC, (fase móvel =

Água/Metanol/Ác. Acético 792/200/8), vazão de 1,3 mL/min. e λ = 257 nm.

A partir dos dados acima, obtemos a curva padrão:

Para as amostras feitas em aula, temos:

Amostras Área do pico

Amostras 1 e 2 correspondem homens com mais de 30 anos; a amostra A, corresponde a uma mulher com menos 30 anos; e a amostra B, corresponde a um homem com menos de 30 anos.

Calculando a media dos valores de pico para as amostras que foram feitas em replicatas e utilizando a equação da curva padrão podemos encontrar a concentração de AH através da diferença entre área do pico da amostra e o valor do branco, isso para todas as amostras. A tabela abaixo mostra os valores calculados para as amostras:

Amostras AH (mg/mL)

Levando-se em consideração a produção diária de urina contém em média 1,5 g de creatina, podemos fazer a correção dos valores de AH em g/ g de creatinina.

Amostras AH (g/g de creatinina)

5. Laudo frente ao resultado

concluir que para as amostras A e B o valores (-0,1057 g AH/g creatinina e

Utilizando os valores referências para indivíduos não expostos ocupacionalmente a tolueno ou xileno descritos por Siqueira e Paiva, Podemos -0,3323 g AH/g creatinina, respectivamente) foram negativos devido o nível de Ácido Hipúrico dos indivíduos estarem abaixo do valor utilizado como branco, logo podemos concluir que para a amostra A e para a amostra B, que pertencem a indivíduos com mais de 30 anos, estão abaixo do valor de referência médio de 0,21±0,10 g AH/g creatinina para a faixa etária de 36-60 anos . Sabendo que as amostras 1 e 2 (0,0065 g AH/g creatinina e 0,3577g AH/g creatinina,respectivamente) que são de indivíduos com menos de 30 anos de idade, estão abaixo do valor de referência médio de 0,16±0,09 g AH/g creatinina para a faixa etária de 18-35 anos.

6. Referências Bibliográficas

LORENZETTI, G. G.; LETTIERI, M. T. Avaliação de ácido hipúrico como biomarcador de exposição ocupacional em trabalhadores de postos de combustíveis. Revista Saúde e Pesquisa, v. 2, n.3, p. 319-324, 2009.

SILVA, Z. L.; NICÁCIO, J. S.; JACINTO, M.; AMORIN, L. C. A.; ALVAREZLEITE, E. M. Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences. Vol. 38, n. 2, 2002.

SIQUEIRA, M. E. P. B.; PAIVA, M. J. N. Hippuric acid in urine: reference values. Revista Saúde Pública, 36 (6), p. 723-727, 2002.

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