Determinação de Colinesterase

Determinação de Colinesterase

1. Finalidade:

Determinação da atividade de colinesterase no sangue com intuito de monitoramento de exposição ocupacional, e para isso, foram utilizados o métodos de Sílva & Mídio e o método de Ellman et al. Sendo o primeiro um método diferencial de campo, que visa a rapidez, para a triagem das amostras; e o segundo método, que é um método espectrofotométrico para a monitorização precisa da atividade da colinesterase em sangue. A determinação da colinesterase foi feita em amostras de soro e plasma.

2. Fundamentos dos métodos:

Os inseticidas organofosforados, organoclorados e/ou carbamatos apresentam com mecanismo de ação tóxica a inibição da acetilcolinesterase neural, impedindo assim a degradação do neurotransmissor chamado de acetilcolina, de maneira que os sinais e sintomas da intoxicação por esses compostos se devem ao acúmulo de acetilcolina nas terminações nervosas. Como esse tipo de enzima também está presente no sangue e é igualmente inibida, a determinação da atividade de colinesterase no sangue é de grande importância para a verificação do grau de exposição a inseticidas organofosforados e carbonatos. Em função da porcentagem de inibição verificada em um indivíduo, associada ao quadro clínico apresentado pode saber se a exposição ao inseticida está sendo excessiva ou não.

Os métodos utilizados baseiam-se na medida da velocidade de hidrólise da acetilcolina pelas colinesterases: Método Colorimétrico, no qual se baseia na variação do pH do meio de reação, pelo ácido acético liberado na hidrólise da acetilcolina pela enzima colinesterase, verificada através do indicador azul de bromotimol, que assume diferentes colorações em função da atividade enzimática, e o Método Espectrofotométrico, que é baseado na medida colorimétrica da velocidade de hidrólise da acetilcolina pelas colinesterases sanguíneas. A tiocolina liberada reage com o ácido 5,5-ditiobis(2-nitrobenzóico) (DTNB) liberando um composto de cor amarela que é quantificado espectrofotometricamente em comprimento de onda de 430nm. Em ambos os métodos utilizamos o soro e o plasma, pois, a verdadeira colinesterase

(acetilcolinesterase) é encontrada nas hemácias e a pseudocolinesterase (acilcolina acil-hidrolase) é encontrada no soro.

No método de Silva & Mídio foi preparada uma escala de variações de corres para o reagente azul de bromotimol na presença de ácido acético.

Figura 1 - Estrutura do Azul de Bromotimol

Para avaliação da amostra foi adiciono o substrato da colinesterase, a acetilcolina, que após a reação gera ácido acético e tiocolina; permitindo a reação do ácido acético com o azul de bromotimol gerando uma coloração relativa a quantidade de ácido acético, como no esquema representado abaixo.

No método espectrofotométrico, não utilizamos uma escala de cores, e sim fazemos a leitura da absorbância gerada pela complexação a tiocolina e o Reagentes de Ellman (DTNB). Como é descrito nas reações abaixo.

Colinesterase Acetilcolina Ácido Acético + Tiocolina

+ Azul de Bromotimol

Coloração

3. Fluxograma dos Métodos Método de Sílva & Mídio

Coloração amarelada

Método de Ellman

4. Resultados e Discussão

Para cada diluição feita na escala de cores corresponde a uma diferente porcentagem de atividade enzimática, conforme mostra tabela abaixo:

Tubos Atividade Enzimática (%)

Para amostra foi utilizados o sangue de um indivíduo não exposto para verificar mos o tempo necessário para a reação, o tempo gasto pela amostra do indivíduo que tinha 100% da atividade de colinesterase chegou à cor do tubo 10 no tempo de 30 minutos. Para a amostra do indivíduo exposto após o 30 minutos necessários para que a colinesterase exercesse atividade, notamos que a coloração do tubo correspondia a coloração do tubo 3 da escala de cores. Portanto o indivíduo estava com a atividade enzimática na faixa de 50,0% - 62,5%. Como a atividade foi inferior a 75,0% e esse não é um método específico é necessária a uma nova coleta para uma análise espectrofotométrica pelo método de Ellman. Através dos cálculos realizados pela equação abaixo:

Onde ΔAbs é a variação entre os valores de absorbância observados, Δt é a variação do tempo entre as leituras e v é o volume da amostra considerando a diluição. Que depois foi corrigida multiplicando-a pelo fator de correção para a temperatura. Temos os intervalos de valores que são considerados normais:

Atividade colinesterásica do sangue total (ST) 15,5 – 31,0

Atividade colinesterásica do plasma (PL) 1,3 – 7,8 Atividade colinesterásica eritrocitária (E) 32,0 – 58,0

Para a amostra que nos analisamos encontramos os seguintes valores: Atividade colinesterásica do sangue total (ST) = 8,8094 Atividade colinesterásica do plasma (PL) = 2,784 Atividade colinesterásica eritrocitária (E) = 18,8998

5. Laudo frente ao resultado

Pelo método de Sílva & Mídio foi possível fazer a triagem rápida para verificarmos como estava a atividade da colinesterase de uma indivíduo que provavelmente teve ma exposição indevida a algum inseticidas que possuía em sua composição agentes químicos organofosforados e/ou organoclorados. O teste de campo nos permitiu constatar que a atividade colinesterásica estava na faixa de 50,0% – 62,5%; porém foi necessário o uso de outro método mais específico para a monitorização do nível da atividade enzimática. No método de Ellman, ou método espectrofotométrico, foi possível constatar que a atividade colinesterásica do sangue total está abaixo da faixa de normalidade. Porém a atividade colinesterásica do plasma está dento da faixa considerada de normalidade, entretanto a colinesterase plasmática é na verdade uma pseudocolinesterase. A atividade colinesterásica eritrocitária, que é a colinesterase verdadeira, esta abaixo da faixa de normalidade; portanto concluímos que o indivíduo apresenta-se numa condição de intoxicação por organofosforados e/ou organoclorados.

6. Referências Bibliográficas

ELLMAN et al. A new rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity. Biochemic Pharmacol, v.7, p. 8-95, 1961.

SILVA, S.E. & MIDIO, F.A. Field Method for the determination of whole blood cholinesterases. Med Lav., 1995.

CONCEIÇÃO FILHO, J.N. Avaliação da atividade de colinesterase sérica em pacientes intoxicados por Aldicarb atendidos pelo CIAVE-Ba. Monografia (Curso de Especialização em Análises Clínicas) Universidade Católica do Salvador, 2002.

CAVALIERE, M.J.; CALORE, E.E.; PEREZ, N.M.; PUGA, F.R. Miotoxicidade por organofosforados. Rev. Saúde Pública, v. 30, p. 267-272, 1996.

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