Baixe Microbiologia Clínica para Controle de Infecção Hospitalar e outras Manuais, Projetos, Pesquisas em PDF para Biologia, somente na Docsity! MINISTÉRIO DA SAÚDE Agência Nacional de Vigilância Sanitária Gerência Geral de Serviços de Saúde Gerência de Controle de Riscos à Saúde Manual de Procedimentos Básicos em MICROBIOLOGIA CLÍNICA para o Controle de Infecção Hospitalar Módulo I Brasília-DF Setembro 2000 Ó 2000 - Ministério da Saúde É permitida a reprodução total desta obra, desde que citada a fonte. 1.ª Edição - 2000 Tiragem: 2.000 exemplares Edição, distribuição e informações Ministério da Saúde Unidade de Controle de Infecção em Serviços de Saúde - Agência Nacional de Vigilância Sanitária SEPN 515, Bloco B, Edifício Ômega CEP: 70770-520 Impresso no Brasil/Printed in Brazil Manual de procedimentos básicos em microbiologia clínica para o controle de infecção hospitalar: Módulo I/Programa Nacional de Controle de Infecção Hospitalar – Brasília: ANVISA / Ministério da Saúde, 2000. 56 p. ISBN 85-334-0185-X 1. Infecção Hospitalar – Controle. 2. Microbiologia Clínica. I. Brasil. ANVISA Ministério da Saúde. Apresentação Grandes avanços têm sido alcançados nas diferentes áreas envolvidas no Controle das Infecções Hospitalares no Brasil. Constata-se, no entanto, importante deficiência ainda não superada na área de Microbiologia, particularmente pela falta de padronização e atualização de técnicas laboratoriais de interesse hospitalar, e de normas para controle de qualidade. O Laboratório de Microbiologia participa de modo destacado no suporte às atividades de Controle de Infecção em serviços de saúde, envolvendo-se a partir do processo de Busca Ativa da Vigilância Epidemiológica, tendo por referência as culturas positivas, oferecendo informações sobre a etiologia dos processos infecciosos, bem como sobre a resistência microbiana, apoio às atividades de investigação de surtos, controle de qualidade, programas educacionais, etc. Há cerca de nove anos, o Ministério da Saúde lançou a primeira edição do Manual de Procedimentos Básicos em Microbiologia Clínica para o Controle de Infecção Hospitalar, com grande aceitação por parte dos profissionais da área. Com a finalidade de atualizar e ampliar os temas anteriormente abordados, optou-se por uma publicação em módulos sendo, no momento, oferecido o primeiro de uma série de seis. Este Manual fornecerá subsídios para um melhor desempenho dos Laboratórios de Microbiologia, com repercussões diretas na interface com as atividades das Comissões de Controle de Infecção Hospitalar. Conhecer melhor a etiologia das infecções hospitalares e o seu padrão de susceptibilidade às drogas antimicrobianas, possibilitará a oportunidade não só de aprimorar as informações como as ações de Vigilância Epidemiológica, oferecendo condições para melhor utilização dos antimicrobianos e monitoramento da resistência bacteriana, que terão conseqüências na melhoria da qualidade da assistência médica em nosso país. Gonzalo Vecina Neto Diretor Presidente da Agência Nacional de Vigilância Sanitária Cláudio Duarte da Fonseca Secretário de Políticas de Saúde Ministério da Saúde Introdução A primeira edição do Manual de Procedimentos Básicos em Microbiologia Clínica para o Controle de Infecção Hospitalar teve como proposta padronizar as técnicas microbiológicas consideradas fundamentais na rotina e que pudessem dar respaldo às atividades das Comissões de Controle de Infecção Hospitalar. Se, por um lado, sua virtude foi a simplicidade e objetividade no desenvolvimento dos temas, suas limitações e a rápida evolução do conhecimento nesta área logo reclamaram sua atualização. Estamos, agora, diante da oportunidade de resgatar algumas falhas daquela primeira edição, procurando ampliar e aprofundar temas considerados essenciais, contando com um seleto e conceituado corpo editorial e de colaboradores. Nossa expectativa é de que os laboratórios de microbiologia, a partir das bases oferecidas por este Manual, possam assimilar e alcançar novos níveis de complexidade laboratorial, atendendo às exigências e características próprias de cada unidade hospitalar. Não tivemos a pretensão de alcançar o conteúdo e a profundidade dos manuais-texto de microbiologia tradicionalmente consultados e que também nos serviram de referência, mas sim, de servir como manual de bancada de técnicas consagradas, procedimentos básicos padronizados e informações atualizadas de utilidade no meio hospitalar. Esta edição revisada e ampliada foi programada em seis módulos, abrangendo os seguintes temas: Módulo I - Requisitos básicos para instalação e funcionamento de um laboratório de microbiologia. Requisição de exames microbiológicos. Coleta, conservação e transporte de materiais clínicos. Exames microscópicos e colorações. Módulo II - Microbiologia das principais síndromes infecciosas. Módulo III - Processamento dos materiais e identificação dos principais microrganismos de importância médica. Módulo IV - Principais métodos de detecção da resistência no Laboratório Clínico. Módulo V - Biossegurança. Controle de Qualidade de meios de cultura, reagentes e equipamentos. Preparo de meios de cultura e corantes. Módulo VI - Laboratório de Microbiologia e sua interação com a Comissão de Controle de Infecção Hospitalar. Consideradas as limitações deste Manual, esperamos atender à grande maioria de microbiologistas que, afastados dos grandes centros, não têm acesso a informações atualizadas na área de Microbiologia e que, melhor capacitados, possam estar à altura das expectativas das Comissões de Controle de Infecção Hospitalar, oferecendo um suporte técnico atualizado e mais eficiente. 1 Requisitos Básicos para Instalação e Funcionamento de um Laboratório de Microbiologia 1.1 Atividades Básicas As atividades básicas de um Laboratório de Microbiologia consistem em: · Elaborar e viabilizar normas para colheita, conservação e transporte de material de interesse clínico; · Estabelecer e executar rotinas microbiológicas, dentro dos padrões técnico-científicos vigentes, que permitam o isolamento e identificação dos principais agentes infecciosos de importância clínica, por gênero e, se possível, por espécie; · Determinar a sensibilidade às drogas antimicrobianas; · Efetuar o controle de qualidade de suas atividades e dos processos de esterilização; · Divulgar e pôr em prática normas de biossegurança; · Participar junto com a Comissão de Controle de Infecção Hospitalar do rastreamento epidemiológico dos surtos de infecção hospitalar; · Fornecer periodicamente dados relacionados com a etiologia das infecções hospitalares e da resistência às drogas; · Executar outras atividades afins de natureza não rotineira e de relevância em determinadas situações como, por exemplo, estudos microbiológicos de materiais inanimados, portadores, desinfetantes, etc. 1.2 Segurança em Laboratório de Microbiologia Os tempos modernos incorporaram consideráveis avanços nos trabalhos do Laboratório de Análises Clínicas. O aumento do número de amostras analisadas e o incremento da demanda, a par da introdução de diversos aparelhos analíticos nas rotinas do laboratório, determinaram cuidados mais criteriosos e expressiva preocupação com os níveis de segurança nessas rotinas de trabalho. No Laboratório de Análises Clínicas, a segurança é de responsabilidade da direção, no sentido de evitar, ao máximo, riscos aos seus empregados, assim como é de responsabilidade de cada trabalhador a execução de suas tarefas dentro dos parâmetros de segurança, pelo que serão estabelecidas regras genéricas e normas específicas pertinentes. A rotina do Laboratório de Microbiologia envolve riscos relacionados à exposição, tanto com material clínico e reagentes químicos, como com potenciais agentes patogênicos concentrados em meio de cultura. A adoção e prática de normas de segurança e uso de equipamentos afins são considerados imprescindíveis. (Este item contará com um capítulo especial nas próximas publicações) Deve-se ter conhecimento das principais vias de transmissão para a adoção de cuidados especiais. Exemplo: a hepatite A tem um período de incubação de 15-35 dias, a urina e as fezes contêm vírus e a infecção geralmente ocorre pela ingestão de alimentos e bebidas contaminadas. No que se refere à hepatite B, cujo período de incubação é de 40-120 dias, o sangue é a principal fonte de infecção e os acidentes, com perfuro e cortantes, a via mais importante de aquisição entre profissionais de saúde. Como o laboratório não pode dispor de informações detalhadas de cada paciente, é ainda importante tratar todas as amostras como sendo potencialmente infecciosas. Existem várias portas de entrada de microrganismos, mas, no laboratório, a via respiratória tem maior importância. Três fatores principais contribuem para isto: a facilidade com que partículas pequenas são produzidas por técnicas comuns de laboratório, o fato de muitas destas partículas serem suficientemente pequenas, não capturadas no trato respiratório superior, e a habilidade que a maioria dos patógenos tem de invadir o pulmão. a) Produção de Aerossóis O uso incorreto de equipamento de laboratório – como pipetas, alças de inoculação, agulhas, seringas, centrífugas e homogeneizadores – pode produzir grandes quantidades de aerossóis potencialmente infectantes. Exemplos de procedimentos que produzem aerossóis: · destampar frascos que foram fechados com tampa de pressão; · esvaziar seringas, eliminar o ar das seringas; · quebrar frascos que contenham cultura de microrganismos; · centrifugar tubos ou frascos sem tampa adequada. Quando houver risco de contaminação por aerossóis, recomenda-se o emprego de capelas de segurança biológica (fluxo laminar), juntamente com o uso de luvas, máscaras e óculos de proteção. Nestas condições, manusear frascos e seringas envolvendo-os com gaze ou algodão, embebidos em álcool a 70% ou hipoclorito a 0,5%. b) Pipetagem de Material Clínico É contra-indicada a pipetagem, com a boca, de material clínico (sangue, liquor, urina, etc.) ou de suspensões bacterianas. Devem-se utilizar, sempre que possível, pipetas automáticas ou bulbos de borracha. c) Flambagem de Alça Bacteriológica A flambagem da alça bacteriológica durante a manipulação do material biológico ou na transferência de massa bacteriana (raspado de colônias) deve ser feita através de chama, que deve estar entre o manipulador e a alça. Recomenda-se esgotar a alça num frasco contendo álcool a 95% e areia. Quando se trabalha com Mycobacterium tuberculosis é recomendável o emprego de fenol a 0,5% ou hipoclorito a 0,5% e areia, flambando-se a alça em seguida. d) Disseminação de Esporos de Fungos Ao se trabalhar com fungos, particularmente os filamentosos, recomenda-se o uso de capelas bacteriológicas apenas com proteção de vidro ou acrílico, sem fluxo de ar. 1.2.4 Medidas Básicas de Proteção a) Lavagem das Mãos Fazendo-se, ou não, uso de luvas, lavar as mãos sempre que houver mudança de atividade, na saída do laboratório e antes de comer, beber e mesmo fumar. A lavagem deve envolver mãos e antebraços, usando-se água e sabão líquido. Friccionar com álcool a 70% contendo 1% a 2% de glicerina. Outra opção é o uso de solução degermante à base de iodeto de polivinilpirrolidona (PVP-I) a 10%. Usar de preferência toalhas descartáveis. b) Uso de Luvas O uso de luvas é obrigatório, quando houver possibilidade de contato com sangue e com fluidos corpóreos, especificando-se: Luva plástica – descartável, deve ser desprezada após cada uso. Indicações: para proteção exclusiva do usuário em situações como colheita de sangue, recebimento ou entrega de material biológico, etc. Luva doméstica – que pode ser antiderrapante; não descartável. Seu uso é indicado para lavagem e desinfecção de materiais e superfícies. Após o uso, lavar as mãos enluvadas com água e sabão e descontaminar as luvas em solução de hipoclorito a 0,5%, por 30 a 60 minutos. Luva cirúrgica (látex) – é de preferência descartável, mas pode ser reprocessada, embora com restrições. Indicada para uso em técnicas assépticas (para proteção do paciente e do usuário), tais como cateterização vesical, exames endoscópicos, punção para obtenção de liquor, líquido articular, líquido pleural, etc. c) Uso de Máscaras, Protetores Oculares e Aventais Máscaras cirúrgicas e protetores oculares (óculos com proteção lateral) – são utilizados para evitar a exposição das mucosas da boca e dos olhos e impedir o risco de inalação nos procedimentos que possam produzir aerossóis ou causar borrifamento de sangue; também devem ser usadas no manuseio de material biológico. Aventais – devem ser usados durante os procedimentos acima descritos, no manuseio de culturas microbiológicas e no contato com material orgânico. Os aventais devem ser de mangas longas e, se possível, de tecido sanfonado (tipo avental cirúrgico). 1.2.5 Medidas a Serem Tomadas em Caso de Acidente De acordo com o Manual de Condutas em Exposição Ocupacional a Material Biológico do Ministério da Saúde, após a exposição ao material biológico, cuidados locais com a área exposta devem ser imediatamente iniciados. Em caso de exposição percutânea, recomenda-se lavagem exaustiva com água e sabão ou solução anti-séptica de degermante (PVP Iodo ou clorexidina ). Após a exposição em mucosa, está recomendada a lavagem exaustiva com água ou solução fisiológica. A indicação do uso de anti-retrovirais deve ser baseada em uma avaliação criteriosa do risco de transmissão do HIV em função do tipo de acidente ocorrido e da toxicidade dessas medicações. 1.2.6 Eliminação de Resíduos, Amostras Clínicas e Material Usado 1.2.6.1 Resíduos químicos tóxicos O resíduo deve ser armazenado no local onde é gerado, em ambiente específico e arejado, acondicionado em saco plástico branco, dentro de suas próprias embalagens primárias. Para o caso da inexistência de suas embalagens, devem-se utilizar frascos de até dois litros, resistentes, com tampa rosqueada, vedante e identificado com o nome e fórmula do produto químico, símbolo e expressão de resíduo químico tóxico. Dependendo do volume gerado e o tempo de acondicionamento para o tratamento ou disposição final, o laboratório deve também possuir local específico para o abrigo de resíduos, fora da unidade geradora e fora da edificação do estabelecimento. 1.2.6.2 Resíduos Microbiológicos Amostras Clínicas e Material Usado Todos os materiais empregados no laboratório de microbiologia (meios de cultura inoculados, meios de transporte, espécimes clínicos, swabs empregados na coleta ,etc) devem ser previamente autoclavados antes de serem descartados como resíduo hospitalar. Os materiais perfuro e cortantes (agulhas, seringas, lancetas e outros assemelhados) devem ser descartados em recipientes estanques, rígidos, com tampa, e identificados com símbolo e expressão de resíduo infectante. As agulhas não devem ser reencapadas ou retiradas manualmente e os recipientes não podem ser esvaziados para reaproveitamento. 1.3 Infra-Estrutura Física As unidades laboratoriais de microbiologia devem estar em conformidade com a Portaria GM 1.884/94, de 11 de novembro de 1994, do Ministério da Saúde, ou com regulamentação técnica superveniente. 1.4 Recursos Materiais O equipamento mínimo para funcionamento de um laboratório de microbiologia consiste em: · estufa bacteriológica; · forno de Pasteur; · autoclave; · microscópio binocular; · centrifugador de baixa rotação; · homogeneizador; · banho-maria de pequena dimensão; · destilador para água; · balança para tarar tubos; · balança comum com uma ou duas casas decimais; · bico de Bunsen; · geladeira; · capela de fluxo laminar. Além desse equipamento mínimo, o laboratório poderá contar com outros aparelhos opcionais: · dados laboratoriais que evidenciem o sítio do processo infeccioso (RX, tomografia, urina rotina, hemograma, etc.); · provável origem do processo infeccioso comunitário ou hospitalar. Se hospitalar: relacionado a procedimento invasivo (sonda vesical, cateter, traqueostomia, diálise, alimentação parenteral, cirurgia); · existência de infecção em outra topografia? Qual?; · uso de antíbióticos nos últimos dez dias (por quê e quais?); · paciente com comprometimento imunológico ou com algum fator predisponente à infecção oportunista (prematuridade, transplante de órgãos, uso de droga imunossu-pressora, diabetes, câncer, aids, leucemia, anemia falciforme, talassemia, hemofilia, esplenectomia, cirrose, etc ? Suspeita de doença oportunista. Qual? · paciente transferido ou de alta nos últimos 30 dias de outro hospital? É colonizado ou infectado ou portador de bactérias multirresistentes? · data do pedido médico, nome legível do médico, carimbo e/ou ramal de contato (facilita a comunicação para situações emergenciais como, por exemplo, isolamento de M.tuberculosis, isolamento de nova cepa multirresistente, etc); · data e hora da coleta e nome de quem colheu o material (permite reavaliação de procedimentos e reciclagem, por exemplo, quando se detecta excesso de contaminação em uroculturas, etc); · comentários, quando necessários, sobre o procedimento de coleta. Por exemplo, acidentes ou dificuldades para obtenção do material, condições do paciente, quantidade, etc; · no caso de suspeita de infecção urinária, informar se o paciente é sintomático ou não. 2.3 Identificação da Amostra O profissional responsável pela coleta será também responsável por identificar de forma legível e correta o material a ser encaminhado ao laboratório de microbiologia. Na amostra devem estar identificados: - nome e registro do paciente; - leito ou ambulatório e especialidade; - material colhido; - data, hora e quem realizou a coleta. Quem colhe o material deve ser devidamente treinado e periodicamente reciclado nesta atividade. Deve saber que o material deverá ser destinado, o mais brevemente possível, ao laboratório. Deve conhecer ou obter instruções sobre conservação e/ou transporte do material caso este não possa ser realizado imediatamente. 2.4 Natureza do Teste Solicitado Exame microscópico: - a fresco, campo escuro; - com coloração Gram, Ziehl, Giemsa, ou outra; - pesquisa de Pneumocistis carinii; - pesquisa de Cryptosporidium e Isospora belli. Cultura: - rotina bacteriológica; - rotina para fungos; - rotina para micobactérias. Específicos: - anaeróbios, - micoplasma, - Legionella spp, - Helicobacter spp, - exames especiais de interesse da CCIH (controle de medicamentos, frascos de soros, bolsas de sangue, portadores, equipamentos, etc.); - rotina para vírus (quando disponível); - outros. Testes especiais: - aglutinação com látex para meningite; - testes imunológicos diretamente no material clínico: Chlamydia trachomatis (genital), Streptococcus pyogenes (orofaringe); - pesquisa de toxinas (S. aureus, Limulus teste para endotoxinas de Gram (-) Clostridium difficile etc); - tipagem para fins epidemiológicos em investigação de surtos ou fontes de infecção hospitalar; - PCR para micobactérias, etc; - exames quantitativos (exceto os de rotina, como urina, cateter vascular e lavado broncoalveolar). Por exemplo, hemocultura de sangue periférico ou de cateter, biópsia de tecidos, líquido de diálise peritoneal, etc. Teste de sensibilidade aos antimicrobianos: - rotina( Kirby – Baner) - antibiograma com drogas não padronizadas; - outros testes de sensibilidade aos antimicrobianos (Concentração Inibitória Mínima/ CIM, E test); - pesquisa de antimicrobianos no sangue, LCR, etc., poder bactericida do soro; - teste de sensibilidade de fungos a drogas, etc. 2.5 Resumo de Itens para Requisição de Análises Microbiológicas (Modelos) 2.5.1 Identificação Sobrenome e iniciais Registro n.º Data de nascimento ____/____/____ Sexo:M ( ) F ( ) Clínica ( ) leito ( ) ou ambulatório ( ) Campo para identificação do exame no Laboratório 2.5.2 Informações sobre o Paciente Hipótese diagnóstica Dados clínicos Dados epidemiológicos relevantes Outros dados laboratoriais importantes Provável origem do processo infeccioso: comunitário ( ) hospitalar ( ) Relacionado a procedimento invasivo? Qual? Cirurgia? Qual? Existe infecção em outra topografia Qual? Fez uso nos últimos dez dias de antibióticos? Qual (is)? Existe comprometimento imunológico? Sim ( ) Não ( ) É paciente transferido de outro hospital? Sim ( ) Não ( ) É portador de bactérias multirresistentes? Sim ( ) Não ( ) Para urocultura informar: sintomático ( ) assintomático ( )____/____/____ ____________________________________________________ Data do pedido Nome legível do médico/CRM, carimbo e/ou telefone de contato ____/____/____ ________________________________________________ Data e hora da coleta Nome e identificação de quem colheu o material 3.3 Critérios de Rejeição para Amostras Clínicas Enviadas ao Laboratório de Microbiologia O recebimento criterioso das amostras clínicas pelo laboratório de microbiologia garante uma melhor correlação clínico/laboratorial. 3.3.1 Principais Erros de Identificação · Discrepância entre a identificação da amostra e o pedido médico. · Falta de identificação da amostra. · Origem da amostra ou tipo de amostra não identificada. · Teste a ser realizado não especificado. 3.3.2 Amostras Inadequadas · Material clínico recebido em solução de fixação (formalina). · Ponta de cateter de Foley. · Material conservado inadequadamente com relação a temperatura (urinas colhidas há mais de 24 horas, que ficaram guardadas em geladeira, ou colhidas há mais de duas horas, sem refrigeração). · Frascos não estéreis. · Presença de vazamentos, frascos quebrados ou sem tampa, com contaminação na superfície externa. · Mais de uma amostra de urina, fezes, escarro, ferida colhida no mesmo dia e da mesma origem. · Swab único com múltiplas requisições de testes microbiológicos. · Swab seco. · Culturas para anaeróbios recebidas em condições não apropriadas. Amostras com as características acima descritas são inadequadas e demandam um contato prévio com o médico solicitante para melhores esclarecimentos. Amostras não Recomendadas para o Exame Microbiológico por Fornecerem Resultados Questionáveis Amostra Alternativa ou Comentário Swab de amostra de queimadura Processar biópsia ou aspirado Swab de úlcera de decúbito Processar biópsia ou aspirado Swab de abscesso perirretal Processar biópsia ou aspirado Swab de lesão de gangrena Processar biópsia ou aspirado Swab de lesão periodontal Processar biópsia ou aspirado Swab de úlcera varicosa Processar biópsia ou aspirado Vômito Não processar Material de colostomia Não processar Ponta de cateter de Foley Não processar Aspirado gástrico de recém-nascido Não processar 3.4 Transporte das Amostras Transportar as amostras IMEDIATAMENTE ao laboratório para: · assegurar a sobrevivência e isolamento do microrganismo, pois o laboratório de microbiologia trabalha basicamente em função da viabilidade dos microrganismos; · evitar o contato prolongado dos microrganismos com anestésicos utilizados durante a coleta, pois eles poderão exercer atividade bactericida; · evitar erros de interpretação nas culturas quantitativas, principalmente urina e lavado broncoalveolar. Consultar o laboratório para verificar a disponibilidade dos meios de transporte. Tempo Crítico para Entrega da Amostra ao Laboratório e Meios de Transporte Amostra Tempo Crítico Frascos e meios de transporte Liquor Imediatamente (não refrigerar) Tubo seco estéril. Líquido pleural Imediatamente (não refrigerar) Tubo seco estéril Swab Imediatamente (não refrigerar) Tubo seco estéril ou meio semi-sólido (Stuart, Amies). Suspeita de anaeróbios 30 minutos Meio de transporte apropriado. Evitar o transporte em seringa com agulha. Feridas e tecidos 30 minutos ou até 12 horas (meio de transporte) Meio de transporte apropriado. Hemocultura 30 minutos (não refrigerar) Frascos com meios de cultura para rotina manual ou automati-zada. Trato respiratório 30 minutos Tubo seco estéril. Trato gastrointestinal 1 hora Tubo seco estéril. Urina Até 1 hora ou refrigerada até 24 horasPote seco estéril. Fezes Até 12 horas se em meio de transporte Cary Blair, meio modificado para transporte de fezes, com pH 8,4. Boa recuperação também para Campylobacter sp e Vibrio sp. 3.5 Instruções de Coleta 3.5.1 Hemoculturas a) Técnicas de Coleta · Colher antes da administração de antibióticos. · Lavar as mãos e secá-las. · Remover os selos da tampa dos frascos de hemocultura e fazer assepsia prévia nas tampas com álcool 70%. · Garrotear o braço do paciente e selecionar uma veia adequada. Esta área não deverá mais ser tocada com os dedos. Fazer a anti-sepsia com álcool 70% de forma circular e de dentro para fora. Aplicar solução de iodo (tintura de iodo 1% a 2% ou PVPI 10%) também com movimentos circulares e de dentro para fora. Para ação adequada do iodo, deixar secar por um a dois minutos antes de efetuar a coleta. · Coletar a quantidade de sangue e o número de amostras recomendados de acordo com as orientações descritas ou se discriminadas no pedido médico. · Remover o iodo do braço do paciente com álcool 70% para evitar reação alérgica. · Identificar cada frasco com todas as informações padronizadas e enviar ao laboratório, juntamente com a solicitação médica devidamente preenchida. Observações: 1. Não é recomendada a técnica de coleta através de cateteres ou cânulas quando se podem utilizar punções venosas. 2. Punções arteriais não trazem benefícios na recuperação dos microrganismos quando comparadas com punções venosas. 3. Não se recomenda a troca de agulhas entre a punção de coleta e distribuição do sangue no frasco de hemocultura. 4. Método de coleta do sangue e o volume coletado influenciam diretamente no sucesso de recuperação de microrganismos e uma interpretação adequada dos resultados. 5. Cada instituição deverá ter suas normas de coleta particularizadas de acordo com o tipo de sistema utilizado (manual x automatizado) e do tipo de paciente. Fatores que influenciam diretamente os resultados de hemoculturas: 1 Volume de sangue coletado por frasco. O volume ideal corresponde a 10% do volume total do frasco de coleta. Quanto maior o volume de sangue inoculado no meio de cultura, por amostra, melhor recuperação do microrganismo, respeitando-se a proporção sangue/meio citada, pois o sangue em desproporção com o meio pode inibir o crescimento de microrganismos. Frascos que possibilitem uma coleta de até 10 ml são os mais indicados. Exemplo: frascos com 40 ml: coletar de 4 ml a 5 ml de sangue. O anticoagulante recomendado é o SPS (Polianetolsulfonato sódico). respiratório. Hemocultura, lavado brônquico ou aspirado transtraqueal podem fornecer resultados mais confiáveis. · Orientar o paciente da importância da coleta do escarro e não da saliva. As amostras de saliva são impróprias para análise bacteriológica, pois não representam o processo infeccioso. · Colher somente uma amostra por dia, se possível o primeiro escarro da manhã, antes da ingestão de alimentos. · Orientar o paciente para escovar os dentes, somente com água (não utilizar pasta dental) e enxaguar a boca várias vezes, inclusive com gargarejos. · Respirar fundo várias vezes e tossir profundamente, recolhendo a amostra em um frasco de boca larga. Se o material obtido for escasso, coletar a amostra depois de nebulização. · Encaminhar imediatamente ao laboratório. · Na suspeita de infecção por micobactérias ou fungos, coletar pelo menos três amostras, em dias consecutivos (somente uma amostra por dia). · Em caso de pacientes com dificuldades para escarrar, esta amostra poderá ser induzida por inalação ou ser realizada coleta por aspiração transtraqueal. 3.5.5 Secreção Traqueal A coleta deste material é realizada em pacientes entubados, através de sonda de aspiração. Os resultados microbiológicos dessas amostras podem refletir colonização local, sendo a interpretação clínica extremamente complicada. Como procedimento para diagnóstico etiológico de pneumonias hospitalares, não se recomenda esse procedimento, que poderá levar a condutas terapêuticas inadequadas. 3.5.6 Aspirado Transtraquial (ATT) Procedimento realizado por equipe médica especializada. O material é obtido diretamente por material transtraqueal, evitando-se contaminação com o trato respiratório alto. 3.5.7 Lavado Bronco-Alveolar (BAL) Utilizado para obtenção etiológica das pneumonias associadas a ventilação mecânica e em paciente imunodeprimidos, sendo considerado o método mais fidedigno para investigação microbiológica do trato respiratório inferior. Os agentes etiológicos da pneumonia estão geralmente presentes em altas concentrações nas secreções pulmonares ( >10 5 - 10 6 ufc/ml). O valor de corte sugerido para distinguir colonização de infecção é de 105 ufc/ml. Este valor foi determinado por alguns estudos, podendo ocorrer variações. O tempo do transporte da amostra é essencial, devendo estar em torno de 30 minutos, sendo o máximo aceitável de 1 a 2 horas. O material deverá ser obtido antes das biópsias de escovados para se evitar excesso de sangue. Este procedimento deve ser realizado por equipe médica especializada. Colher as alíquotas em recipientes distintos: · A primeira alíquota deverá ser colocada em frasco identificado como primeira amostra (utilizada para esfregaços microbiológicos). · Todas as outras amostras poderão ser coletadas em um único frasco estéril (POOL). Somente esta amostra deverá ser utilizada para a cultura quantitativa, evitando falsas contagens. Cultura para anaeróbios do trato respiratório: Coletar tecido pulmonar, aspirado transtraqueal, aspirado percutâneo, aspirado transcutâneo e lavado brônquico via cateter protegido. 3.5.8 Secreção de Orofaringe A contaminação com saliva, que contém uma flora bacteriana variada, pode dificultar o isolamento do verdadeiro agente infeccioso. As amostras devem ser cultivadas para recuperação do Streptococcus pyogenes. · Solicitar ao paciente que abra bem a boca. · Usando abaixador de língua e swab estéril, fazer esfregaços sobre as amígdalas e faringe posterior, evitando tocar na língua e na mucosa bucal. · Procurar o material nas áreas com hiperemia, próximas aos pontos de supuração ou remover o pus ou a placa, colhendo o material abaixo da mucosa. Coletar a amostra exatamente na área inflamada, evitando outros sítios na cavidade oral. · Colher dois swabs. · Enviar imediatamente ao laboratório para evitar a excessiva secagem do material. 3.5.9 Fluidos Orgânicos Estéreis (Líquidos: Pleural, Ascítico, Biliar, de Articulações e outros) · Proceder a anti-sepsia no sítio da punção com álcool 70% e com solução de iodo (tintura de iodo 1% a 2 % ou PVPI 10%), que deverá ser removida após o procedimento, com álcool de 70% para evitar queimadura ou reação alérgica. · Obter a amostra através de punção percutânea ou cirúrgica. Quanto maior o volume da amostra, maior a probabilidade de isolamento do agente etiológico. Coleta por procedimento médico. · Encaminhar o líquido coletado em tubo seco e estéril ou inoculado diretamente nos frascos do equipamento de automação de hemoculturas. · Transportar imediatamente ao laboratório, com a orientação do tipo de cultura (aeróbia, anaeróbia, fungos, micobactérias, etc.) necessariamente especificada no pedido médico. a) Liquor · Procedimento realizado por equipe médica especializada. · Recomenda-se jejum Caso a coleta permita somente a disponibilidade de um tubo, o laboratório de microbiologia deverá ser o primeiro a manipulá-lo. Caso haja coleta de dois ou mais tubos, o Laboratório de Microbiologia deverá ficar com o tubo que contiver menos sangue. · Ao transportar a amostra, nunca refrigerar. Transportar a amostra imediatamente ao laboratório, acompanhada de pedido médico, adequadamente preenchido, nos casos de paciente com idade crítica. Os exames a serem realizados devem ser especificados e priorizados de acordo com o volume coletado. 3.5.10 Feridas, Abscessos e Exsudatos O termo “secreção de ferida” não é apropriado como informação da origem do material coletado. O sítio anatômico específico, bem como as informações adicionais (material de ferida superficial ou profunda), são extremamente valiosos para o laboratório, auxiliando na interpretação dos resultados. a) As margens e superfície da lesão devem ser descontaminadas com solução de povidine-iodine (PVPI) e soro fisiológico (metade/metade). b) Proceder à limpeza com solução fisiológica. c) Coletar o material purulento localizado na parte mais profunda da ferida, utilizando- se, de preferência, aspirado com seringa e agulha. Quando a punção com agulha não for possível, aspirar o material somente com seringa tipo insulina. d) Swabs (menos recomendados) serão utilizados quando os procedimentos acima citados não forem possíveis. 3.5.13 Secreção Ocular As culturas deverão ser coletadas antes da aplicação de antibióticos, soluções, colírios ou outros medicamentos. · Desprezar a secreção purulenta superficial e, com swab, colher o material da parte interna da pálpebra inferior. · Identificar corretamente a amostra e enviar imediatamente ao laboratório, evitando a excessiva secagem do material. 3.5.13 Material Genital Amostras e Sítios Genitais para Cultura Não indicados para o Cultivo de Anaeróbios Indicados para o Cultivo de Anaeróbios TRATO FEMININO Endocérvix Placenta (origem de cesárea) Vagina Endométrio Uretra Trompa de Falópio Placenta Aspirado cervical Vulva Ovário Genital feminino externo Glândulas de Bartholin Períneo TRATO MASCULINO Uretra Fluido prostático Fluido seminal a) Considerações Gerais · A seleção de materiais genitais, bem como sua coleta adequada, são fatores importantes na interpretação das culturas deste tipo de material, uma vez que estes possuem uma quantidade grande de microrganismos comensais. · Culturas vaginais de rotina não são indicadas pelo motivo acima exposto. · Culturas anaeróbias são limitadas a certos materiais, conforme tabela anterior. · Muitos agentes de infecção genital em mulheres são limitados a certos sítios anatômicos, conforme tabela a seguir. · Nos casos de suspeita de infecção por Chlamydia trachomatis deverá ser solicitado exame por imunofluorescência ou por biologia molecular (PCR). Pode ocorrer associação entre infecções por Chlamydia trachomatis e Neisseria gonorrhoeae. · Material purulento, proveniente da glândula de Bartholin, poderá ser obtido diretamente do ducto, após massagem digital ou colhida através de seringa. · Endométrio: este tipo de material é melhor coletado por curetagem. Recomenda-se o uso de swabs protegidos para coleta via cérvix, para evitar contaminação com a flora vaginal. · DIP (Doença Inflamatória Pélvica): o material é coletado por técnica invasiva. Líquido peritoneal pode ser coletado por aspiração do fundo de saco vaginal (culdocentese). Material retirado diretamente dos ovários ou trompas são coletados cirurgicamente. · Vulva: raspados, aspirados ou biópsia não têm muito valor para cultura a não ser em casos de suspeita de sífilis. Nos casos de suspeita de sífilis, a lesão deverá sofrer uma abrasão cuidadosa com gaze seca até que um fluido seroso comece a fluir, tomando cuidado para evitar sangramento, o que acarreta interferência no exame em campo escuro. Após o acúmulo de fluido seroso, colocar uma gota em uma lâmina limpa e examinar imediatamente. · DIU (Dispositivo Intra-Uterino): deve ser removido pelo médico evitando-se contaminação cervical ou vaginal. Coloque todo o DIU dentro de um recipiente estéril para ser transportado para o laboratório. · Cultura semi-quantitativa para Mycoplasma hominis e Ureaplasma urealyticum podem ser realizadas com kits comercializados. Consultar a bula para maiores informações. Infecções por Chlamydia trachomatis: não aceitar secreção vaginal para pesquisa de Chlamydia, uma vez que este microrganismo não pode crescer nas células epiteliais escamosas da vagina. Chlamydia são parasitas intracelulares obrigatórios do epitélio colunar do cérvix. Realizar coleta de material endocervical, raspando-se o endocérvix para obter células e secreção. O swab deverá ser inoculado imediatamente em meio de transporte especial ou preparar as lâminas para coloração especial. · Detecção de estreptococos do grupo “B” em mulheres: culturas cervicais não são aceitáveis e não se devem utilizar espéculos. Sugere-se coleta com swab do intróito vaginal e outro do orifício anorretal. Os swabs devem ser colocados em meios de transporte. · Secreção prostática: poderá ser coletada após massagem digital pelo reto, podendo ser acompanhada de amostras de urina pré e pós-massagem. O material ejaculado também poderá ser submetido à análise. · Na suspeita de Neisseria gonorrhoeae em mulheres, a cultura é o método de escolha, sendo o material coletado do endocérvix. O encaminhamento deve ser feito em meio de transporte ou plaqueado imediatamente. b) Secreção Cervical e Vaginal Considerações para Coleta de Exames Microbiológicos Amostra a ser coletada Exames realizados Material necessário para coleta SECREÇÃO VAGINAL Bacterioscopia Swab seco para duas lâminas Cultura para fungo/aeróbio Swab com meio de transporte SECREÇÃO ENDOCERVICAL Bacterioscopia Swab seco para duas lâminas Cultura para micoplasma e ureaplasma Meio de transporte específico PCR para Chlamydia Meio de transporte específico PCR para HPV Meio de transporte específico c) Preparo da Paciente Recomenda-se: · Não estar menstruada. · Evitar ducha e cremes vaginais na véspera da coleta. · Três dias de abstinência sexual. d) Coleta Vaginal · Inserir um espéculo (sem lubrificante; usar água morna) na vagina e retirar o excesso de muco cervical com swab de algodão. · Em seguida, inserir os swabs indicados, rodar por alguns segundos sobre o fundo do saco, retirar e voltar aos meios indicados no kit: - Swab seco: realizar as lâminas para bacterioscopia da secreção fresca. - Swab do meio de transporte para cultura aeróbia/fungos. e) Coleta Endocervical · Inserir um espéculo (sem lubrificante) na vagina e retirar o excesso de muco cervical com swab de algodão. · Em seguida, inserir os swabs indicados no canal endocervical até a ponta do swab não ser mais visível, rodar por alguns segundos, retirar evitando o contato com a parede vaginal, e voltar aos meios indicados no kit: - Swab seco: realizar as lâminas para bacterioscopia da secreção fresca. - Swab seco: Mycoplasma/Ureaplasma - mergulhar o swab dentro da solução do tubo fornecido e agitar. Remover o swab e identificar o tubo. - Swab do meio de transporte específico para Chlamydia trachomatis - mergulhar o swab dentro da solução do tubo fornecido e agitar vigorosamente. · Comprimir o swab contra a parede do tubo. Qualquer excesso de muco deve ser retirado da amostra. · Remover o swab e identificar o tubo. Cultura para anaeróbios do trato genital feminino · Descontaminar o canal cervical com swab embebido de PVPI aquoso a 10%. · Coletar amostra do trato genital superior de forma a obter material celular da parede uterina. · Amostras coletadas por laparoscopia, culdocenteses ou cirurgia, também são apropriadas para cultura de anaeróbios. · Cultura de dispositivo intra-uterino (DIU) tem valor estratégico para cultivo anaeróbio de Actinomyces sp. f) Secreção Uretral Da rapidez na entrega da amostra ao laboratório depende o sucesso da cultura. N. gonorrhoeae é uma bactéria muito sensível e pode morrer rapidamente se não for semeada imediatamente após a coleta. · Desprezar as primeiras gotas da secreção. · Coletar a secreção purulenta, de preferência pela manhã, antes da primeira micção ou há pelo menos duas horas ou mais sem ter urinado. · Coletar com alça bacteriológica descartável ou swab estéril fino. · Colocar a amostra em meio de transporte e realizar as lâminas para bacterioscopia da secreção fresca. · Encaminhar imediatamente para o laboratório. Em pacientes assintomáticos, deve-se coletar a amostra através de massagem prostática ou com pequeno swab inserido alguns centímetros na uretra. 3.5.15 Secreção Anal · Inserir o swab cerca de 1 cm do canal anal e fazer movimentos de lado a lado para coletar material das criptas anais. · Colocar a amostra em meio de transporte e enviar o swab imediatamente ao laboratório. 3.6 Anaeróbios 3.6.1 Princípio Anaeróbios podem estar envolvidos em infecções nas mais diversas partes do organismo humano. A coleta deve ser feita evitando-se contaminação com a flora normal endógena. Na solicitação médica deve constar também cultura para germes aeróbios. A boa comunicação entre o corpo clínico e o laboratório com o fornecimento de informações como impressão clínica, estado do paciente ou suspeita de organismo incomum assegura o sucesso da cultura anaeróbia. 3.6.2 Coleta da Amostra Sempre que possível, mediante uma solicitação de cultura para anaeróbios, a amostra deve ser coletada através de aspirado com agulha e seringa ou através de fragmentos do tecido infectado. A coleta com swab é a menos recomendada pelas seguintes razões: · O material pode ser facilmente contaminado com organismos presentes na pele ou na superfície mucosa. · Os anaeróbios ficarão expostos ao oxigênio ambiente. · O material está sujeito à secagem excessiva. · A quantidade de material encaminhada é relativamente pequena. · Swabs são menos satisfatórios que os aspirados para preparação de esfregaços utilizados na análise microscópica, assim como para exame direto macroscópico (grânulos de enxofre - típico em actinomicose). · O uso de swab com meio de transporte específico deverá ser utilizado como última opção. Avaliação das Amostras para Cultura de Anaeróbios Sítio Amostra Aceitável Amostra Inaceitável CABEÇA E PESCOÇO Aspirado do abscesso coletado com agulha e seringa após descontaminação da superfície. Material de biópsia coletado por cirurgia. Swab obtido por cirurgia quando for impraticável a aspiração. Swab de orofaringe e nasofaringe. Swab gengival. Material superficial coletado com swab. PULMÃO Aspirado transtraqueal. Material obtido de punção pulmonar percutânea. Material de biópsia obtido cirurgicamente. Amostra broncoscópica obtida com cateter “double-lumen” evitando contaminação. Escarro expectorado. Escarro induzido. Aspirado endotraqueal. Material broncoscópico não coletado adequadamente. SNC Liquor. Aspirado de abscesso obtido com agulha e seringa. Material de biópsia obtido por cirurgia. Swab aeróbio. ABDÔMEN Fluido peritoneal obtido com agulha e seringa. Aspirado de abscesso obtido com agulha e seringa. Bile. Material de biópsia obtido por cirurgia. Swab aeróbio. TRATO URINÁRIO Aspirado suprapúbico. Urina. Urina de cateter. TRATO GENITAL FEMININO Material de laparoscopia. Aspirado endometrial obtido por sucção ou cureta-gem após descontaminação. Material de biópsia obtido por cirurgia. DIU (Dispositivo intra-uterino), somente para Acti-nomyces sp. Swab vaginal ou cervical. OSSOS E ARTICULAÇÕES Aspirado obtido com agulha e seringa. Material de biópsia obtido por cirurgia. Material de superfície cole-tado com swab. TECIDOS MOLES Aspirado obtido com agulha e seringa. Material de biópsia obtido por cirurgia. Aspirado do trato sinusal obtido com cateter plás-tico. Aspirado profundo de ferida aberta obtido após descontaminação da pele. Material de superfície cole-tado da pele ou bordos da ferida. Material coletado com swab. ESTÔMAGO E INTESTINO DELGADO Somente na Síndrome de Alça Cega ou Síndrome de Má Absorção. INTESTINO GROSSO Somente para cultura ou pesquisa de toxinas quan-do houver suspeita de C. difficile ou C. botulinum. 3.6.3 Transporte da Amostra · O material aspirado deve ser precedido da eliminação do ar residual. · Transportar em frascos e meios apropriados visando ao isolamento de bactérias anaeróbias. Tempo de Transporte x Volume de Amostra e/ou Método Coletado Amostra Tempo ótimo para transporte ao laboratório Aspirados: - inferior a 1ml - superior a 1ml 15 minutos – temperatura ambiente. 30 minutos – temperatura ambiente. Meio de transporte anaeróbio. 2 horas – temperatura ambiente. Tecido ou material de biópsia: - recipiente estéril. - meio de transporte ou bolsa anaeróbia. 30 minutos – temperatura ambiente. 2 horas – temperatura ambiente. Swabs anaeróbios: - em tubo com atmosfera anaeróbia. - em meio de transporte anaeróbio. 1 hora – temperatura ambiente. 2 horas - temperatura ambiente. 4.2.1 Equipamentos e Materiais Necessários · Lâminas de vidro limpas e desengorduradas 7,5 cm x 2,5 cm · Tubos estéreis · Alça bacteriológica · Meio de cultura · Pipeta e ponteiras estéreis · Luvas (quando necessário) · Cronômetro · Salina estéril 0,85% · Centrífuga e/ou citocentrífuga · Lata para descartar o material contaminado · Incinerador ou bico de Bunsen · Óleo de imersão · Agitador tipo Vortex · Lâminas de bisturi · Chapa com aquecimento brando para fixação dos esfregaços (50ºC) · Microscópio · Metanol ou etanol absoluto para fixação Nota: 1. Os materiais citados acima são opcionais, dependendo da amostra clínica coletada e da rotina laboratorial. 2. Observar normas de biossegurança. 4.2.2 Utilização · Para bacterioscopia da maioria dos materiais biológicos ou culturas de microrganismos em meios sólidos ou líquidos. · Nas amostras analisadas de culturas jovens (<< 24h) de meio de cultura sem inibidores e amostras clínicas recém-coletadas (são as que fornecem melhores resultados). · Na verificação da morfologia bacteriana a partir de esfregaços de cultura em caldo. 4.2.3 Esfregaços Os esfregaços devem ser preparados com um gradiente de espessura suficientemente denso para facilitar a visualização, mas, também, bastante esparso para revelar as características do agrupamento. Utilizar, de preferência, lâminas limpas e novas (não oxidadas). Os melhores resultados serão obtidos se as mesmas permanecerem no álcool até o momento do uso. A. Material Clínico A.1. Amostra coletada com swab Rodar o swab suavemente pela lâmina limpa, evitando a destruição dos elementos celulares e dos grupamentos. Quando somente um swab for coletado, colocá-lo em um tubo estéril contendo uma pequena quantidade de salina estéril (0,4 ml) e agitar (vortex). Comprimir o swab contra as paredes do tubo e utilizá-lo para fazer o esfregaço. O restante do material pode ser inoculado nos meios de cultura. Nota: 1. Materiais clínicos coletados com swab são menos recomendados para cultura. 2. Coletar, sempre que possível, dois swabs: um será utilizado para fazer o esfregaço e o outro para cultura. A.2. Aspirados, exsudatos, etc. Materiais recebidos em seringas serão transferidos para um tubo estéril e agitados (vortex), quando necessário. Selecionar a porção mais purulenta ou mucosa com pipeta ou alça bacteriológica. Amostras muito espessas ou purulentas podem ser diluídas com uma gota de salina estéril e espalhadas sobre uma grande área da lâmina formando um esfregaço delgado. A.3. Escarro Com auxílio de alça bacteriológica ou um palito de madeira, “pescar” uma porção purulenta do escarro que seja representativa. Rolar esta porção na parede do frasco para separar do material salivar. Em seguida, colocar o material na extremidade de uma lâmina limpa, confeccionando um esfregaço delgado. Quando a quantidade de saliva for grande e pequenas porções purulentas forem visíveis, transferir a amostra para uma placa de Petri para facilitar a retirada do material representativo. A.4. Liquor ou outros fluidos orgânicos Alguns laboratórios utilizam a citocentrífuga (cytospin) para concentrar os líquidos orgânicos e fazer os esfregaços. Este método tem sido utilizado para aumentar a sensibilidade da coloração de Gram, diminuir o tempo de centrifugação e agilizar o resultado. Materiais aparentemente límpidos devem ser previamente centrifugados a 2.000-5.000 rpm/ 15 minutos e o esfregaço feito a partir do sedimento. Após a centrifugação, remover o sobrenadante com uma pipeta estéril, deixando, aproximadamente, 0,5 ml de sedimento. Colocar uma gota do sedimento numa lâmina limpa, sem espalhar. Deixar secar. Para aumentar a concentração do fluido a ser examinado, adicionar uma segunda gota na mesma área da lâmina, anteriormente utilizada. A.5. Urina jato médio Homogeneizar bem o material e utilizar uma gota da amostra, sem centrifugação. A.6. Biópsias ou fragmentos de tecido Colocar o material em uma placa de Petri estéril e triturar com auxílio de um bisturi. Preparar os esfregaços fazendo vários imprints numa lâmina limpa, de preferência, estéril. B. Cultura em caldo Transferir uma a duas gotas para uma lâmina limpa utilizando alça bacteriológica ou pipeta. Espalhar suavemente o material a fim de obter um esfregaço delgado. C. Colônias obtidas de meio sólido Utilizar uma gota de salina estéril em uma lâmina limpa. Transferir uma pequena porção da colônia com alça bacteriológica. Misturar suavemente para obter um esfregaço levemente turvo e homogêneo. Nota: Para evitar a formação de aerossóis, nunca misturar o material vigorosamente. 4.2.4 Fixação do Esfregaço · Calor Todo o esfregaço, antes de ser submetido a coloração, deverá estar seco (exposto ao ar), sendo fixado com calor brando (50ºC). A fixação excessiva e o superaquecimento irão distorcer a morfologia celular e a fixação insuficiente permitirá a saída do material durante o processo de coloração. Deixar a lâmina esfriar antes de iniciar a coloração. · Metanol ou Etanol A fixação pelo metanol ou etanol também pode ser utilizada. Além de prevenir a lise das hemácias, evita que os esfregaços, principalmente os de urina, desprendam-se no momento da coloração. Deixar o esfregaço secar numa superfície plana; após, colocar uma a duas gotas de álcool (1min), drenando o excesso, sem lavar. Não aquecer a lâmina antes da coloração. 4.2.5 Preparo do reagente para a coloração de GRAM (modificado por Hucker) Cristal-violeta - solução estoque Solução A - Cristal-violeta 40 g Células e Polimorfonucleares (PMN) Média em 10 campos (10X de aumento) Microrganismos Média em 15 a 20 campos (100 X aumento) Neg. + ++ +++ + ++ +++ ++++ Neg. Raras Pouca Muitas Raros Poucos Muitos Numerosos 0 1-9 10-24 >>25 <<1 1-5 6-19 >>20 4.2.9 Causas Comuns de Erro · Precipitação do corante ÞÞ simula cocos Gram-positivos. · Uso de lâminas que não tenham sido pré-limpas ou desengorduradas. · Espessura do esfregaço ÞÞ pode corar irregularmente. · Superaquecimento na fixação pelo calor ÞÞ destruição da morfologia. · A descoloração insuficiente com álcool-acetona permite a retenção do cristal-violeta, o que dificulta a observação de bactérias Gram-negativas. Por outro lado, esfregaços obtidos de culturas velhas ou contendo numerosas bactérias mortas ou expostas à ação de antibióticos apresentam irregularidades na coloração. As bactérias Gram-positivas perdem a capacidade de reter o cristal-violeta, apresentando-se Gram-negativas; as Gram-negativas podem corar- se mais fracamente pela safranina, podendo simular a ocorrência de infecções mistas (Gram- positivas/Gram-negativas). · A discordância de resultado entre o esfregaço corado pelo Gram e a cultura pode estar relacionada com a coleta ou meios de transportes e conservantes inadequados. · Um resultado positivo de Gram com cultura negativa pode sugerir contaminação do corante, presença de agentes antimicrobianos na amostra do paciente ou falha no crescimento de microrganismos devido às condições utilizadas (atmosfera, ação seletiva dos meios de cultura, etc.). 4.2.10 Controle de Qualidade · Verificar diariamente a aparência dos reagentes. Se a solução de cristal-violeta precipitar, refiltre antes de usar. A evaporação pode afetar a eficácia dos reagentes. Recomenda-se que as soluções de trabalho sejam trocadas regularmente, dependen-do da demanda. · Diariamente e quando novos reagentes forem preparados, corar, juntamente com os esfregaços da rotina, lâminas controles. Esfregaços de Escherichia coli (ATCC 25922) e Staphylococcus epidermidis (ATCC 12228) ou Staphylococcus aureus (ATCC 25922) são preparados e fixados. Resultados esperados: a) bacilos Gram-negativos, coloração rósea. b) cocos Gram-positivos, coloração violeta. · Sistema de revisão dos resultados do Gram: c) a revisão diária de lâminas de Gram, selecionadas pelo supervisor, pode ajudar a determinar a necessidade de treinamento e adicionar informações de relevância clínica. d) comparar resultados da cultura com a leitura do Gram. · Fazer manutenção preventiva e limpeza dos microscópios. 4.3 Outras Colorações 4.3.1 Albert Layborn (Corinebactérias) Solução A Azul-de-toluidina.......................................................... 0,15g Verde-malaquita............................................................. 0,20g Ácido acético glacial................................................ 1ml Álcool 95%.................................................................... 2ml Água destilada............................................................... 100ml Solução B Iodo............................................................................... 2g Iodeto de potássio......................................................... 3g Água destilada.............................................................. 300ml Execução: · corar três minutos com solução A; · escorrer e, lavar com água corrente, cobrir com solução B; · após dois minutos, lavar com água corrente rapidamente; · enxugar com papel de filtro e secar sem passar na chama. Observar o corpo bacteriano corado em verde e os grânulos metacromáticos (castanho- escuro). 4.3.2 Coloração de Flagelos Impregnação pelo método de Rhodes (Suassuna & Suassuna, 1972) a) Mordente Ácido tânico, solução aquosa a 10%............................................ 10ml Alúmen de potássio (solução aquosa saturada)............................ 5ml Óleo de anilina, solução saturada................................................. 1ml. Dissolver, por agitação, o precipitado que se forma. Completar com cloreto férrico, solução a 5%, 1ml. b) Nitrato de prata amoniacal Dissolver 5g em 10ml de água destilada. Separar 5ml e, ao restante, acrescentar, gota a gota, solução concentrada de amônio, agitando sempre até formar-se um precipitado castanho, que volta a se dissolver. Juntar gota a gota a solução inicial de nitrato de prata que se havia separado, até surgir leve turvação que persiste com a agitação. Execução: · preparar esfregaço; · filtrar o mordente sobre o esfregaço e deixar três a cinco minutos; · lavar abundantemente com água; · cobrir com o nitrato de prata amoniacal e aquecer suavemente até a emissão de vapores, por três a cinco minutos. Resultado: Células em castanho-escuro e os flagelos mais claros em fundo ligeiramente granuloso. 4.3.3 Coloração de ZIEHL-NEELSEN a) Solução de carbolfucsina Fucsina básica ..................................................... 0,3 g Álcool etílico a 95%............................................ 10 ml Cristais de fenol derretidos................................. 5 ml Água destilada.................................................... 95 ml Dissolver a fucsina básica no álcool e o fenol na água. Misturar as duas soluções. Deixar repousar por vários dias antes de usar. b) Ácido-álcool Álcool etílico.................................................... 97 ml Ácido clorídrico concentrado........................... 3 ml c) Coloração de fundo (azul-de-metileno) Azul-de-metileno........................................... 0,3 ml Água destilada................................................ 100 ml Execução: · Cobrir a superfície da lâmina com a solução de carbolfucsina. · Aquecer a lâmina coberta com o corante, lentamente com auxílio de um bico de Bunsen, até a emissão de vapores, tomando o cuidado para não deixar ferver. Aquecer com calor baixo ou intermitente por um período de três a cinco minutos . Guideline. NCCLS document GP2-A2 (ISBN 1-56238-156-3) NCCLS, 771 East Lancaster Avenue, Villanova, Pennsylvania 19085, 1992. 6 - FORBES,B. A.,D.F.SAHM,and A. S. WEISSFELD.BAILEY & SCOTT’S Diagnostic Microbiology 7 - GILLIGAN, P. H., J. M. JANDA, M. A. KARMALI, and J. M. MILLER. Cumitech 12A Laboratory Diagnosis of Bacterial Diarrhea. Coordinating ed., F.S. Nolte. American Society for Microbiology, Washington, D.C., 1992. 8 - ISENBERG, H. D., F. D. SCHOENKNECHT, and A. VON. G. CUMITECH 9, Collection and Processing of Bacteriological Specimens. Coordinating ed., S.J.Rubin. American Society for Microbiology, Washington, D.C., 1979. 9 - ISENBERG, H. D., Clinical Microbiology Procedures Handbook. American Society for Microbiology, Washington, D.C., 1992. 10 - ISENBERG, H. D. Essential procedures for Clinical Microbiology. American Society for Microbiology, Washington, D.C., 1992. 11 - KONEMAN,E. W. et al. Color Atlas Textbook of Diagnostic Micorbiology. 5. Ed Philadelphia, J. B. Lippincott Company,1997 12 - MILLER, J. M. A Guide to Specimen Management in Clinical Microbiology. American Society for Microbiology, Washington, D.C..1996. 13 - MINISTÉRIO DA SAÚDE. SECRETARIA NACIONAL DE ASSISTÊNCIA À SAÚDE. Manual de procedimentos básicos em microbiologia clínica para o controle da infecção hospitalar. Brasília, 1991. 14 - MINISTÉRIO DA SAÚDE. SECRETARIA DE POLÍTICAS DE SAÚDE. Manual de condutas em exposição ocupacional a material biológico. Brasília, 1999. 15 - MURRAY, P. R., E. J. BARON, M. A. PFALLER, F. C. TENOVER, R. H. YOLKEN. Manual of Clinical Microbiology, 6th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C.. 1995. 16 - RELLER, L. B., P. R. MURRAY, and J. D. MACLOWRY. Cumitech 1A. Blood Cultures II. Coordinating ed., J.A. Washington II. American Society for Microbiology, Washington, D.C., 1982. 17 - RODLOFF, A. C., P. C. APPELBAUM, and R. F. ZABRANSKY. Cumitech 5A, Practical Anaerobic Bacteriology. Coordinating ed., A.C. Rodloff. American Society for Microbiology, Washington, D.C., 1991. 18 - Portaria GM 1.884/94 –DOU de 11 de novembro de 1994. Equipe de elaboração Carlos Emílio Levy - Médico Microbiologista Clínico Cássia Maria Zoccoli - Farmacêutica Bioquímica Elsa Masae Mamizuka - Farmacêutica Bioquímica Flávia Rossi - Médica Microbiologista Clínica Copidesque: Waldir Rodrigues Pereira Digitação: José Armando Costa Cunha Projeto gráfico: Sergio Lima Ferreira Revisão: Mara Pamplona Apoio Técnico da Unidade de Controle de Infecção em Serviços de Saúde –GGTSS/ANVISA Eni Rosa Aires Borba Mesiano – Enfermeira Glória Maria Andrade – Médica Lucila Pedroso da Cruz – Gerente Geral de Tecnologia em Serviços de Saúde Cláudio Maierovitch Peçanha Henriques – Diretor Adjunto da Agência Nacional de Vigilância Sanitária