Oleos e gorduras

Oleos e gorduras

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Cálculo com padrão interno (PI) Empregue o método de padronização interna para determinar o valor absoluto de um ácido graxo na amostra ou na quantificação de ácidos graxos com baixo peso molecular (4 a 6 átomos de carbono) juntamente com ácidos graxos de alto peso molecular (16 a 24 átomos de carbono) na mesma amostra. Ésteres metílicos de ácidos graxos com número ímpar de carbo- nos são freqüentemente usados como padrão interno (Ex: C5:0; C11:0; C13:0; C19:0 ou C23:0).

Expresse o resultado em % de massa do componente (éster metílico):

Capítulo XVI - Óleos e Gorduras C

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M = massa em miligramas da amostra

API = área do PI MPI = massa em miligramas do PI AAGi = área correspondente ao componente i KAgi = fator de correção da resposta do DIC para o ácido graxo i (relativo a KC16) KPI = fator de correção da resposta do DIC para o PI (relativo a KC16)

Nota: quando o resultado for expresso em gramas de ácidos graxos por 100 g de óleo, deve-se multiplicar pelo fator 0,956.

Referências bibliográficas

AMERICAN OIL CHEMISTS’ SOCIETY. Official methods and recommended practices of the American Oil Chemists’ Society. 4th ed. Champaign, USA: A.O.C.S., 1995 (A.O.C.S. Official Method Ce 2-6: Preparation of methyl esters of long chain fatty acids).

AMERICAN OIL CHEMISTS’ SOCIETY. Official methods and recommended practices of the American Oil Chemists’ Society. 4th ed. Champaign, USA: A.O.C.S., 1995 (A.O.C.S. Official Method Ce 1-62: Fatty acid composition by gas chromatography).

AMERICAN OIL CHEMISTS’ SOCIETY. Official methods and recommended practices of the American Oil Chemists’ Society. 4th ed. Champaign , USA: A.O.C.S., 1995 (A.O.C.S. Official Method Ce 1d-91 Determination of fatty acids in edible oils and fats by capillary GLC).

AMERICAN OIL CHEMISTS’ SOCIETY. Official methods and recommended practices of the American Oil Chemists’ Society. 4th ed. Champaign , USA: A.O.C.S., 1997 (A.O.C.S. Official Method Ce 1f-96 Determination of cis and trans fatty acids in hydrogenated and refined oils and fats by capillary GLC).

INTERNATIONAL STANDARD ORGANIZATION. IS0 5508: Animal and vegetable fats and oils – Analysis by gas chromatography of methyl esters of fatty acids. ISO 5508. 1990E

INSTITUTO ADOLFO LUTZ Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1 Métodos Químicos e Físicos para Análise de Alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 266.

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345/IV Determinação de tocoferóis e tocotrienóis por cromatografia líquida de alta eficiência

Este método quantifica tocoferóis (alfa, beta, gama e delta) e tocotrienóis em óleos vegetais ou gorduras. Baseia-se na dissolução da amostra em solvente orgânico e injeção direta em cromatógrafo a líquido para a separação e quantificação dos tocoferóis e tocotrienóis.

Material

Sistema de cromatografia a líquido de alta eficiência (CLAE) composto de: bomba de alta pressão, dispositivo para injeção da amostra, detector de fluorescência ajustado para os comprimentos de onda de 290 nm de excitação e 330 nm de emissão (na indisponibilidade de detector de fluorescência, utilize o de UV ajustado em 292 nm), coluna analítica de CLAE (250mm x 4mm) empacotada com micropartículas de sílica de 5 μm, pré-coluna de sílica; espectrofotômetro UV/VIS; rotavapor; balões volumétricos âmbar de 25, 50 e 100 mL; pipetas volumétricas de 10 mL e pipetas automáticas (20 a 200 μL e 200 a 1000 μL).

Reagentes

Padrões de α, β, γ, δ - tocoferóis de alta pureza (superior a 95%). Metanol. n-Hexano. Isopropanol

Fase móvel para CLAE – Hexano - isopropanol (9,5:0,5). Nitrogênio seco Nota: todos os solventes devem ser grau CLAE

Solução-padrão estoque de α-tocoferol – Pese cerca de 10 mg do padrão em um balão volumétrico âmbar 100 mL e complete o volume com n-hexano. Pipete 10 mL desta solução para um frasco âmbar e remova o solvente num rotavapor. A temperatura não deve exceder a 40oC. Retire o frasco e remova o solvente residual com nitrogênio. Adicione 10 mL de metanol, com pipeta volumétrica, e agite para dissolver o tocoferol. Meça a absorbância desta solução a 292 nm e calcule a concentração (como μg/mL de α-tocoferol) dividindo-se o valor da absorbância lida por 0,0076.

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Soluções-padrão estoque de β, γ, δ-tocoferóis – Prepare a solução-estoque para cada um dos padrões de β, γ, δ-tocoferol e proceda como descrito para a solução-padrão de α-tocoferol. Meça a absorbância de cada uma das soluções nos comprimentos de onda indicados abaixo e utilize os respectivos fatores para o cálculo da concentração e pureza.

296 nm β-tocoferol = 0,0089 298 nm γ-tocoferol = 0,0091 298 nm δ-tocoferol = 0,0087

Notas Os fatores citados são derivados dos valores da absorção específica dos tocoferóis nos respectivos comprimentos de onda. Estoque as soluções-padrão em frasco de vidro âmbar, ao abrigo da luz e sob refrigeração pelo período de uma semana. Solução de trabalho de mistura de tocoferóis – Combine volumes apropriados das soluções-padrão estoque para obter soluções de trabalho com concentrações dos tocoferóis entre 1 e 5 μg/mL. Escolha no mínimo cinco pontos para a curva de calibração. Utilize n-hexano nas diluições.

Nota: Quando utilizar detector UV prepare uma solução mais concentrada dos padrões. Procedimentos

Otimização dos parâmetros analíticos – Condicione a coluna, se necessário. Ajuste o fluxo da fase móvel [n-hexano/isopropanol (9,5:0,5 v/v)] em 1 mL/min e deixe pelo menos 30 min. Injete cerca de 20 μL da mistura dos padrões de tocoferóis e, se necessário, ajuste a proporção de isopropanol da fase móvel e o fluxo. O fluxo da fase móvel adequado deve estar entre (0,7 - 1,5)mL/min. O tempo de retenção do α-tocoferol não deve ser menor que 5 minutos. O Fator de resolução (R) para o β e γ-tocoferol não deve ser menor que 1,0. Fator de resolução (R) é calculado por:

Rd1 = distância de retenção do γ-tocoferol Rd2 = distância de retenção do β-tocoferol W1 = largura da base do pico do γ-tocoferol W2 = largura da base do pico do β-tocoferol

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Preparação da amostra – A amostra líquida de óleo deve ser homogeneizada (não filtre). Para amostra sólida, transfira uma certa quantidade representativa (não menos que 10% do peso total da amostra) para um béquer e homogeneíze cuidadosamente. Faça a fusão em um banho-maria onde a temperatura não exceda a 40oC. O preparo da amostra deve ser feito na ausência de luz. Pese com precisão, entre 0,2 e 0,5 g da amostra de óleo e transfira para um balão volumétrico de 25 mL com n-hexano. Agite para dissolver e complete o volume com o mesmo solvente. Quando utilizar um detector de fluorescência, podem ser necessárias algumas diluições para a obtenção de um cromatograma adequado. A amostra deve estar protegida da luz durante os procedimentos de preparo e deve ser analisada no mesmo dia.

Determinação de tocoferóis na amostra – Injete 20 μL da amostra e identifique os tocoferóis (e tocotrienóis) presentes por comparação com os tempos de retenção dos padrões. Registre as áreas dos picos dos tocoferóis e dos tocotrienóis. Faça duas determinações sucessivas para cada tocoferol, usando alíquotas-teste preparadas recentemente. O resultado final deve ser a média de duas determinações obedecendo a exigência da repetitividade (vide resultados estatísticos do estudo colaborativo do método IUPAC 2432).

Curva de calibração – Injete cerca de 20 μL das soluções de mistura dos padrões de tocoferóis. Repita a injeção e verifique se os cromatogramas obtidos são reprodutíveis. Construa as curvas de calibração pelo método de padronização externa.

Cálculos

A quantificação dos tocoferóis é feita por padronização externa. Os teores dos tocoferóis são calculados a partir de curvas de calibração construídas pelos softwares dos equipamentos ou em planilhas de cálculo (ex: excel). Para a construção da curva utilize no mínimo cinco pontos, isto é, no mínimo cinco níveis de concentração de cada padrão. As curvas obtidas relacionam a concentração dos padrões e a resposta do detector (área).

O teor de α-tocoferol presente em uma amostra, em μg/g, é dado por:

C = concentração do padrão de α-tocoferol (μg/mL) A = medida da área do pico obtido pelo padrão de α-tocoferol a = medida do área do pico obtida pela amostra de α-tocoferol m = massa da amostra D = fator da diluição

Os teores de β, γ e δ-tocoferóis da amostra são calculados como o procedimento anterior usando os dados do cromatograma do correspondente padrão de tocoferol.

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Nota: os tocotrienóis contidos na amostra podem ser estimados usando os valores de C e A para o correspondente tocoferol. De acordo com a literatura a intensidade da fluo- rescência para os tocoferóis é a mesma do correspondente tocotrienol e a absorbância no UV é similar.

Referência bibliográfica

INTERNATIONAL UNION OF PURE AND APPLIED CHEMISTRY. IUPAC 2432: Determination of tocopherols and tocotrienols in vegetable oils and fats by high performance liquid chromatography. Pure & Appl. Chem., v. 60, n. 6. p. 887-892,

346/IV Determinação de tocoferóis e tocotrienóis por cromatografia líquida de alta eficiência em produtos processados contendo ésteres de tocoferóis.

Produtos processados contendo ésteres de tocoferóis, como por exemplo, margarinas, são saponificados e a matéria insaponificável obtida é dissolvida em solvente orgânico e injetada em cromatógrafo a líquido para a separação e quantificação dos tocoferóis e tocotrienóis.

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