Determinação de Proteína pelo Método de Biureto

Métodos de análise de proteínas



MÉTODOS DE ANÁLISE DE PROTEÍNAS
BROMATOLOGIA
PROFª MÁRCIA CRESTANI BIN
Avaliação de proteínas em alimentos
Métodos químicos
Métodos físicos
Métodos biológicos
Métodos microbiológicos e enzimáticos
MÉTODOS QUÍMICOS
Métodos que analisam teor de C:
- digestão mais fácil do que para o nitrogênio;
- menores erros no resultado por causa da maior quantidade em relação ao nitrogênio;
- fator de correção mais constante que para o nitrogênio;
- maior dificuldade em separar os carbonos pertencentes à proteína dos carbonos de outros componentes.
MÉTODOS QUÍMICOS
MÉTODO DE KJELDAHL
Etapa de digestão
K2SO4: aumenta o ponto de ebulição do H2SO4 (de 337ºC para mais de 400ºC), torna a digestão mais eficiente;
CuSO4: Catalisador. Acelera o processo de oxidação da matéria orgânica.
Etapa de neutralização e destilação
Etapa de titulação
Etapa de titulação
Conversão do teor de N para proteína bruta
A maioria dos alimentos possui em média 16% de nitrogênio, portanto:
16g N ___ 100g proteínas
1g N ____ Xg
Xg = 100/16 = 6,25
O conteúdo de proteína para alimentos específicos pode utilizar fatores específicos:
O conteúdo de proteína para alimentos específicos pode utilizar fatores específicos:
Método de Kjeldahl
Vantagens
- Aplicável a todos os tipos de alimentos
- Relativamente simples
- Não é caro
- Preciso. Trata-se de um método oficial para a determinação de proteínas
- Pode ser utilizado para análise de microgramas de proteína (micro Kjeldhal)
Desvantagens
- Mede Nitrogênio orgânico total, não apenas nitrogênio de proteínas
- Demorado
- - Utiliza reagentes corrosivos.
Método de Kjeldahl
Outras possíveis fontes de N na amostra:
Métodos químicos por grupos
METODO DE BIURETO
Substâncias contendo duas ou mais ligações peptídicas formam um complexo de cor roxa com sais de cobre em soluções alcalinas.
A intensidade da cor é proporcional a quantidade de proteínas
METODO DE BIURETO
Vantagens
- Ser bastante específico por não apresentar problemas de interferentes.
- É simples, rápido e barato.
- Por envolver uma reação com a ligação peptídica, o método determina proteína, ao contrário do método de Kjeldahl que determina N total
Desvantagens
- A necessidade de uma curva de calibração tomada com um padrão conhecido de proteína, por exemplo, uma proteína determinada por Kjeldahl.
- A cor formada no complexo não é idêntica para todas as proteínas, porém os desvios causados são menores do que em outros métodos colorimétricos
Métodos químicos por grupos
MÉTODO DO FENOL (Folin-Ciocalteau – Lowry)
Baseia-se na interação das proteínas com o reagente fenol e cobre em condições alcalinas;
Reação colorimétrica envolve uma oxidação catalisada por cobre, de aas aromáticos por um reagente heteropolifosfato, desenvolvendo uma cor azul que vai ser medida num colorímetro e comparada com uma curva padrão.
Métodos químicos por grupos
ESPECTROFOTOMETRIA NO ULTRAVIOLETA
Proteínas possuem absorção UV em 280 nm devido à presença de tirosina, triptofano e fenilalanina
MÉTODOS TURBIDIMÉTRICOS
Medida baseada na turbidez causada pela proteína precipitada por algum agente precipitante, como TCA, ferricianato de potássio e ácido sulfossalicílico
Métodos químicos por grupos
MÉTODOS DE DYE-BINDING
Quando uma amostra é tratada com corante (excesso) que reage com proteína quantitativamente para formar um complexo insolúvel que pode ser separado. O excesso de corante não reagido em solução é medido colorimetricamente;
Utilizado em amostras de grãos de cereais, sementes oleaginosas, produtos vegetais e animais e laticínios;
Boa correlação com o método oficial.
MÉTODOS FÍSICOS
Não muito utilizados;
Utiliza-se para avaliação da qualidade de proteínas e não da quantidade;
Índice de refração, densidade específica, viscosidade; tensão superficial; condutividade; polarização.
MÉTODOS BIOLÓGICOS
Princípios importantes:
Balanço de nitrogênio
Crescimento
Valor biológico da proteína
Digestibilidade da proteína
Balanço de N
Crescimento
PER: Quociente de eficiência protéica: ganho de peso pela quantidade de proteína ingerida em um grupo de ratos
NPR: Quociente de eficiência líquida da proteína: ganho de peso expresso em gramas frente a um grupo controle que não recebeu proteína. Avalia a capacidade de sustentar o crescimento e capacidade de sustentar a manutenção do organismo através da proteína.
Crescimento
Simulam a perda de peso sem usar 2 grupos:
MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS
Certos micro-organismos são usados para medir o valor nutritivo de proteínas.
Baseia-se na avaliação de aminoácidos essenciais comuns entre homem e microorganismos.
Verifica-se o crescimento de micro-organismos na presença da proteína teste.
MÉTODOS ENZIMÁTICOS
Utilizados para medir a digestibilidade e biodisponibilidade de aminoácidos essenciais. Utiliza pepsina, pancreatina.
Simula in vitro as condições estomacais e intestinais para pesquisar a digestibilidade.
Outro método a proteína é digerida por 3 enzimas (quimiotripsina, tripsina pancreática e peptidase intestinal suína).