Determinação de proteinas pelo metodo kjedahl

Determinação de proteinas pelo metodo kjedahl

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Faculdade Metropolitana de Campinas

VERIS

Curso de Nutrição

Bromatologia

Determinação de proteínas pelo método de Kjeldahl

Campinas

2011

Determinação de proteínas pelo método de Kjeldahl

Relatório apresentado à disciplina de bromatologia, ministrado pela, como forma de avaliação prática do conteúdo.

Campinas

2011

Sumário

Sumário 3

Introdução 1

Objetivos 2

Materiais: 3

Métodos 4

Resultados 5

Discussão 7

Conclusão 9

Referências bibliográficas: 10

Introdução

Proteínas são macronutrientes constituídos por uma cadeia de aminoácidos unidos por ligações peptídicas. Possuem funções estruturais, de transporte, hormonal, de armazenamento e defesa. Diferenciam-se quimicamente das outras frações de nutrientes que constituem um alimento por possuírem um átomo de nitrogênio em sua composição.

A partir desta particularidade, pode-se determinar a quantidade de proteínas presentes nos alimentos. O método mais utilizado é pelo processo de digestão Kjeldahl, proposto em 1883 pelo mentor de mesmo nome. Este processo é constituído de três etapas, digestão, destilação e titulação. A proteína sofre uma hidrolise ácida e, assim a matéria orgânica é decomposta e o nitrogênio transformado em amônia. Sendo o conteúdo de nitrogênio das diferentes proteínas aproximadamente 16%, introduz-se o fator empírico 6,25 para transformar o numero de g de nitrogênio encontrado em número de g de proteínas.

Objetivos

Objetivo geral:

Conhecer as etapas do método de digestão de Kjeldahl, para determinar a concentração de proteínas na amostra.

Objetivo especifico:

Analisar as etapas de digestão, destilação e titulação da amostra, analisando detalhadamente cada uma a fim de compreender os processos a que a amostra foi submetida e como estes interferem na determinação da concentração proteica.

Materiais e métodos

Materiais:

- 1 béquer de 50 ml

- 2 Erlenmeyer de 250 ml

- 4 Tubos micro Kjedahl

- Leite em pó

- 1 Balança Analítica

- 1 Bloco Digestor

- 1 Destilador de Proteína

- 1l Solução de NaOH 40 %

- 1l Solução de H3BO3 a 2 % p/v

- 100 ml Vermelho de metila, 0,1 % em álcool

- 100 ml Verde de bromo cresol, 0,1 % em álcool

- Solução padronizada de HCL 0,02N

- Bureta de 50 ml com suporte

- 100 g mistura catalisadora: 96% de k2SO4, 4 % CuSO4.5H2O bem moídos e misturados

- 500 ml Ácido sulfúrico concentrado, com baixo teor de nitrogênio

Métodos

Foram pesados 200 g de leite em pó, 1,5 g de mistura catalisadora e 3 ml de ácido sulfúrico concentrado. Em seguida a amostra foi transferida para o tubo micro-kjedahl, e colocada no bloco digestor por cerca de 1 a 6 horas e, resfriada. Assim, este processo foi realizado antes da aula, pela técnica de laboratório.

Após resfriada a amostra sofreu o processo de destilação, foram adicionados 3 ml de água ao tubo micro-kjedahl e, 10 ml de hidróxido de sódio ao copo destilador. No aparelho destilador a amostra foi destilada pela presença de hidróxido de sódio que volatiliza a amônia, esta foi recolhida em um Erlenmeyer de 250 ml contendo, 10 ml de solução de ácido bórico, com os indicadores vermelho de metila, 4 gotas, e verde de bromocresol, 6 gotas. O ácido bórico fixou a amônia, formando o borato de amônia. A destilação persistiu por alguns minutos, até que a solução contida no Erlenmeyer obtivesse uma coloração azul, foram recolhidos 100 ml, com o cuidado de não desligar o aparelho destilador, para não haver refluxo para o tubo com ácido concentrado.

O destilado foi titulado com ácido clorídrico (HCl) 0,0 2 N. Uma bureta de 50 ml foi completada com HCl , e gotejada na amostra ate que esta passasse da cor verde azulado para roxo claro.

Resultados

O método de Kjeldahl consiste na digestão da amostra protéica por ácido sulfúrico, destilação com fixação da amônia pelo ácido bórico e, titulação com ácido clorídrico onde, o volume deste utilizado na titulação vai determinar a quantidade de nitrogênio da amostra e, conseqüentemente a quantidade de proteína, visto que, em geral o nitrogênio corresponde a 16% do peso da amostra protéica.

No experimento realizado em primeira aula pratica, obteve-se 4,3 ml de ácido clorídrico (HCl) na titulação, com este volume a solução de borato de amônia tornou-se roxa claro, o que indica que o ácido desprendeu a amônia da molécula de borato.

Levando-se em consideração que a massa atômica do HCl é aproximadamente 36, com massa atômica 1 do hidrogênio e 35 do cloro e, que segundo Cecchi (2003), o método é uma titulometria de neutralização onde 1 mol de HCl é igual a 1 mol de nitrogênio (N), obteve-se os seguintes resultados:

1 mol HCl__________ 36 g

X mol _____________ 0.043 g

Logo, em 0,043 g de HCl, tem-se 0,0119 mols, que é igual a 0,0119 mols de N.

A massa atômica do nitrogênio é de aproximadamente 16. Fazendo a conversão:

Massa de N= Volume de HCl . Massa de HCl . mol de N (CECCHI, 2003).

Massa de N = 0.043. 0.0119 . 14

Massa de N = 0.716

Proteína total = Nitrogênio total. Fator

Proteína total = 0.716. 6.25

Proteína total= 4.475 %

Em uma segunda amostra, titulou-se mais de 150 ml de HCl sem que a amostra passasse da cor azul para roxo claro, isto pode ter ocorrido devido a superaquecimento do aparelho de destilação. A alta temperatura pode ter volatizado a amônia e, assim houve grande perda de nitrogênio.

Discussão

A qualidade nutricional de uma proteína pode ser medida através do conhecimento da sua concentração nos alimentos e da sua composição de aminoácidos. Para a determinação dos aminoácidos em um alimento, são utilizadas técnicas cromatográficas. O método mais utilizado para a determinação da concentração de protéica é o de Kjeldahl, que parte do conceito de que a fração de nitrogênio não-protéico de um alimento é irrelevante e, na determinação de nitrogênio total obtém-se o conteúdo de proteínas. (COULTATE, 2004).

A proporção de nitrogênio para a maioria das proteínas é de 16% do peso total, ou seja, em 100 g de proteínas, 16 g corresponde a nitrogênio. Assim, um fator de 6.25, que é a diferença entre o peso total e o peso correspondente ao nitrogênio, é utilizado para converter o teor deste em concentração de proteínas. Em alguns alimentos, como cereais, que têm variações na concentração de aminoácidos, um fator diferenciado é utilizado para obter-se maior precisão. (COULTATE, 2004; ZENEBON et al, 2008).

No método referido, primeiramente a amostra protéica passa por uma hidrolise ácida, com ácido sulfúrico concentrado, na presença de calor e de uma mistura catalisadora que acelera a reação. Sendo a proteína formada por cadeias de aminoácidos unidos por ligações peptídicas que, segundo Mahan (2005), “é formada entre o grupo carboxila do primeiro aminoácido e o nitrogênio do segundo’’, o ácido hidrolisa os grupamentos amina.

A mistura catalisadora, utilizada na hidrólise ácida, é composta de substancias que aumentam a velocidade da reação, fornecendo um mecanismo de reação diferente entre reagentes e produtos. Os catalisadores mais utilizados são mercúrio, cobre e selênio, geralmente é utilizada uma mistura, pois, em pequenas concentrações evita-se os problemas de toxidez e perda de nitrogênio causada por estes. (ANDRADE, 2009; CECCHI, 2003).

Após permanecer no bloco digestor por algum tempo, a amostra torna-se transparente, o que indica que esta totalmente digerida e, transformada em sulfato de amônia. Esta amostra passa pelo processo de destilação, no tubo micro-kjeldahl é adicionado água e hidróxido de sódio (NaOH) 40% para alcalinizar a amostra , esta é destilada pelo aparelho. A amônia desprendida é recolhida em um erlenmyer com ácido bórico, que fixa a amônia formando o borato de amônia de coloração azul. (CECCHI, 2003).

Para perceber-se o ponto de equivalência entre o titulante e a amostra são utilizados indicadores, como o verde de bromocresol e vermelho de metila, estes sofrem a mudança de cor indicando que o ponto de equivalência foi atingido.

A titulação é feita com ácido clorídrico. Na aula pratica utilizou-se HCl 0,02 N, segundo Rosenberg (2002), a normalidade exprime o número de equivalentes-gramas de soluto existente em um litro de solução.Assim, 20 g de soluto estavam presentes em 1 litro da solução ácida utilizada.

O borato de amônia obtido na destilação, é titulado com este ácido , que desloca a amônia da molécula de borato. O ponto de equivalência é atingido quando a amostra adquire a cor roxa claro. (CECCHI, 2003.)

Na aula pratica, com 4,3 ml de HCl atingiu-se o ponto de equivalência. Em uma segunda amostra utilizou-se mais de 150 ml de ácido sem que a amostra passasse de azul para roxo. Isto pode ter ocorrido devido a superaquecimento do aparelho de destilação, causando a volatilização da amônia, perdendo assim o nitrogênio da amostra.

Conclusão

O método de Kjeldahl para determinação de proteínas, é uma técnica relativamente simples e econômica para analise de alimentos. Entretanto, as etapas de digestão, destilação e titulação têm que ser realizadas cuidadosamente, pois a concentração dos reagentes interfere no resultado final, além disso, o aparelho digestor deve estar calibrado para que não haja superaquecimento e, conseqüente perda de nitrogênio por volatilização da amostra.

A determinação da concentração de proteínas nos alimentos esta relacionada com a qualidade protéica dos mesmos, e o nitrogênio pode ser utilizado como parâmetro, pois a sua presença na composição das proteínas é uma particularidade da mesma.

Referências bibliográficas:

ANDRADE, Edira Castello Branco; Análise de alimentos uma visão química da nutrição, 2ª edição, Varela, São Paulo, 2009, pg 62-65.

CECCHI, Heloisa Mascia; Fundamentos teóricos e práticos da análise de alimentos, 2ª edição, UNICAMP, Campinas, 2003, pg 61-64

COULTATE, T.P.; Alimentos a química de seus componentes , 3ª edição, Artmed, Porto Alegre, 2004, pg 113-116

MAHAN, L. Kathleen; Krause, Alimentos, Nutrição e Dietoterapia, 11[ edição, Roca, São Paulo, 2005.

ROZENBERG, Izrael Mordka; Química geral, 2ª edição , Edgard Blucher Ltda., São Paulo, 2002 , pg 452-453

ZENEBON, Odair, PASCUET; Neus Sadocco; TIGELA, Paulo; Métodos físico-químicos para analise de alimentos, 4 edição, Instituto Adolfo Lutz, São Paulo, 2008, pg 122-124.

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