Aula 11 - Ciclo de Krebs

Aula 11 - Ciclo de Krebs

Metabolismo de Carboidratos: Ciclo de Krebs

O metabolismo é dividido em catabolismo e anabolismo. O catabolismo são as reações de degradação de macromoléculas a seus precursores e o anabolismo são as reações de síntese dessas macromoléculas a partir dos seus precursores. Geralmente, no catabolismo há produção de ATP e das coenzimas reduzidas (NADH + H+ e FADH2), ou seja, produção de energia química. Essa energia química produzida pode tanto ser utilizada para a manutenção do metabolismo quanto para a produção de novas macromoléculas.

Geralmente, as vias de degradação tanto de aminoácidos quanto de ácidos graxos e glicose geram uma molécula comum: a acetil-coenzima A (acetil-CoA). A acetil-CoA pode ser utilizada em vias de síntese de novas macromoléculas ou pode ser degradada no Ciclo de Krebs, dependendo das necessidades metabólicas do organismo. Durante o Ciclo de Krebs serão geradas coenzimas reduzidas, que doarão seus elétrons para a cadeia de transporte de elétrons (oxidação fosforilativa), que sintetizará o ATP. Assim, a degradação das macromoléculas que formarão acetil-CoA formará energia.

  • Complexo enzimático piruvato-desidrogenase:

O piruvato é formado através das reações de quebra da glicose no citossol:

GLICOSE (6C) → 2 PIRUVATO (3C)

O piruvato pode ser transformado em acetil-CoA. Essa transformação é mediada por um complexo enzimático chamado de piruvato-desidrogenase, presente na mitocôndria. Como a glicólise, que formará piruvato, acontece no citossol, o piruvato deverá ser transportado para dentro da mitocôndria para a formação de acetil-CoA. Esse transporte é feito através do transportador “piruvato-transportase”. A piruvato-transportase faz um co-transporte de piruvato e de prótons H+. Assim, o piruvato só entra na mitocôndria se houver prótons H+.

Dentro da mitocôndria, o piruvato pode enfim ser transformado em acetil-CoA. Essa conversão acontece através de uma descarboxilação (saída de CO2) e a formação de uma coenzima reduzida NADH + H+:

PIRUVATO (3C) + CoA → ACETIL-CoA (2C) + CO2

A saída de CO2 acontece porque o piruvato possui três carbonos e o acetil-CoA só possui dois carbonos. O complexo enzimático piruvato-desidrogenase é composto por três enzimas que são responsáveis pela conversão do piruvato em acetil-CoA, sendo elas E1, E2 e E3. A enzima E1 é a piruvato-desidrogenase propriamente dita, que dá nome ao complexo. A E2 é a diidro-lipoamida-acetiltransferase. A E3 é a diidro-lipoamida-desidrogenase. A reação catalisada pelo complexo enzimático piruvato-desidrogenase necessita, também, de cinco coenzimas: tiamina-pirofosfato, ácido lipóico, coenzima A, FAD e NAD+. A reação acontece em cinco etapas:

  1. A primeira etapa da reação é catalisada pela E1 (piruvato desidrogenase), que utiliza o piruvato como substrato e a tiamina-pirofosfato (TPP) como coenzima. A E1 descarboxila o piruvato, gerando o intermediário “hidroxi-etil-tiamida-pirofosfato” (HETPP), baseado na interação da tiamina-pirofosfato e o piruvato descarboxilado.

  2. A segunda etapa da reação é catalisada pela E2 (diidro-lipoamida-acetiltransferase), que vai retirar o grupo acetil que se ligou ao TPP e transferi-lo. Como o nome já diz, a E2 possui ligada covalentemente à sua estrutura uma lipoamida. Quando a enzima percebe a presença do intermediário da primeira etapa da reação (HETPP), ocorre uma redução na lipoamida, gerando uma diidro-lipoamida, agora capaz de receber o acetil ligado ao TPP, formando um intermediário acetil-diidro-lipoamida.

  3. Ligada, enfim, ao grupo acetil, a E2 pode transferi-lo para a coenzima A e gerar o produto da terceira etapa da reação: acetil-CoA. O subproduto da reação é a diidro-lipoamida ligada à E2.

  4. A quarta etapa da reação é catalisada pela E3 (diidro-lipoamida-desidrogenase). A E3 é uma flavoproteína, ou seja, está ligada à coenzima FAD. O FAD está envolvido em reações de oxirredução e está ligado covalentemente à E3. A E3 reduz o FAD ligado a ela, oxidando a diidro-lipoamida, formando novamente a E2original, com seu complexo lipoamida com capacidade oxidativa.

  5. Os elétrons recebidos pelo FAD são transferidos para o NAD+, gerando novamente a E3 original, com seu FAD capaz de oxidar a E2.

Primeiramente, vale ressaltar a diferença entre o FAD e o NAD: ambos são coenzimas capazes de receber e transferir elétrons, porém o FAD liga-se covalentemente à enzima (formando flavoproteínas) e o NAD não se liga às enzimas. Dessa forma, o NADH + H+ (estado reduzido do NAD) pode ser descrito como subproduto da reação, enquanto o FADH2 (estado reduzido do FAD) não o é, pois este faz parte da enzima.

Enfim, analisando novamente as reações do complexo enzimático piruvato-desidrogenase, pode-se perceber que a E1 e a E2 foram as responsáveis pela formação do acetil-CoA e a E3 foi a responsável pela recuperação do estado natural da lipoamida da E2, para que a E2 seja capaz de realizar novamente sua função.

  • Ciclo de Krebs (Ciclo do Ácido Cítrico)

O ciclo de Krebs é composto por oito reações enzimáticas, que vão oxidar o acetil-CoA. Ele recebe esse nome, pois, diferentemente de outras vias metabólicas em que o substrato é somente precursor do produto, de forma linear, no Ciclo de Krebs, por exemplo, o produto da última reação enzimática é utilizado, novamente, na primeira reação, formando um ciclo. As oito reações do Ciclo de Krebs são catalisadas por oito enzimas. Durante cada volta do Ciclo de Krebs (entrada de um novo acetil-CoA) são produzidas 3 coenzimas reduzidas (NADH + H+), 1 FADH2 e 1 molécula de GTP, que pode ser convertida em ATP. As reações são as seguintes:

  1. Condensação do oxalacetato (4C) com o acetil-CoA (2C). Essa reação é catalisada pela citrato-sintase, formando o citrato (6C). Durante a reação, dois aminoácidos do sítio ativo da citrato-sintase se destacam: o aspartato e a histidina. Eles interagem com os substratos, primeiramente com o acetil-CoA e, depois, com o oxalacetato, catalisando a formação do citrato. Durante a reação é formado um intermediário, o citril-CoA, que perde sua coenzima A e é liberado como citrato.

  2. Catalisada por uma enzima que liga Fe2+, a aconitase. A aconitase vai converter o citrato em isocitrato, primeiramente eliminando uma molécula de H2O e formando o intermediário cis-aconitato e, posteriormente, incorporando uma molécula de H2O, formando finalmente o isocitrato. A diferença do citrato e do isocitrato é a posição do grupamento hidroxila (-OH): essa hidroxila é ligada, no citrato, no carbono 3 e, no isocitrato, no carbono 2. A conversão do citrato a isocitrato é feita porque a enzima que vai catalisar a próxima etapa do ciclo (isocitrato-desidrogenase) não é capaz de reconhecer o citrato, somente o isocitrato.

  3. Catalisada pela isocitrato-desidrogenase. Essa enzima vai oxidar o isocitrato, formando um intermediário oxalsuccinato e, após descarboxilação (saída de CO2) desse intermediário, o produto final α-ceto-glutarato. Para oxidar o isocitrato, a isocitratodesidrogenase vai reduzir um NAD+ a NADH + H+.

  4. Catalisada por um complexo enzimático chamado de α-ceto-glutarato-desidrogenase. Esse complexo enzimático também possui três enzimas:

a) E1 – α-ceto-glutarato-desidrogenase.

b) E2 – succinil-transferase

c) E3 – diidro-lipoamida-desidrogenase

Durante essa reação, forma-se outra molécula de NADH + H+ e é liberada uma molécula de CO2. O produto formado é o succinil-CoA.

  1. Catalisada pela succinil-CoA-sintetase. Essa enzima vai utilizar o succinil-CoA para formação do succinato. Durante a reação, a succinil-CoA-sintetase vai formar uma molécula de GTP. A enzima age através da oxidação temporária de uma histidina do seu sítio ativo. A fosforilação acontece porque, para que a coenzima A saia do succinato, este precisará ganhar um fosfato, formando um intermediário chamado succinil-fosfato. O succinil-fosfato será, então, atacado pela histidina da succinil-CoA-sintetase que vai se fosforilar, formando enfim o succinato. O fosfato ganho pela histidina da succinil-CoA-sintetase será passado para um GDP, formando assim um GTP, que pode ser facilmente transformado em ATP. Essa reação é chamada de “fosforilação em nível de substrato”.

  2. Catalisada pela succinato-desidrogenase. Essa enzima fica na membrana interna da mitocôndria, enquanto todas as demais enzimas do Ciclo de Krebs encontram-se na matriz mitocondrial. A succinato-desidrogenase é uma flavoproteína, ou seja, quando ela for oxidar alguém, o FAD ligado a ela será reduzido a FADH2. A reação catalisada pela succinato-desidrogenase é a oxidação do succinato a fumarato. Através de seu FADH2 reduzido, a succinato-desidrogenase é uma enzima que doa elétrons para a cadeia respiratória (fosforilação oxidativa). Essa doação de elétrons é mediada por um transportador de elétrons de natureza lipídica, a ubiquinona. O malonato, por ser muito parecido com o succinato (análogo estrutural), atua como inibidor competitivo da succinato-desidrogenase.

  3. A sétima enzima do Ciclo de Krebs é a fumarase. Ela vai converter o fumarato em malato. Essa reação acontece quando a fumarase adiciona uma molécula de H2O ao fumarato, rompendo uma dupla ligação C=C deste fumarato, formando o malato.

  4. A última reação é a oxidação do malato a oxalacetato. Durante a oxidação do malato a oxalacetato, será gerada a terceira molécula de NADH + H+. Esse oxalacetato gerado será utilizado pela primeira reação, em que ele será condensado pela citrato-sintase ao acetil-CoA, para formar o citrato, gerando todo o ciclo novamente.

O Ciclo de Krebs é uma via anfibólica porque seus intermediários podem servir tanto ao catabolismo quanto ao anabolismo. Dessa forma, a degradação de glicose, ácidos graxos e alguns aminoácidos podem gerar acetil-CoA, que será usado no Ciclo de Krebs. Porém, os intermediários desse ciclo podem, também, formar as moléculas precursoras do acetil-CoA. Por exemplo: o oxalacetato pode entrar na síntese de glicose, o citrato pode ajudar na síntese de ácidos graxos e o α-ceto-glutarato pode ser convertido em glutamato, servindo de precursor para outros aminoácidos.

A velocidade do Ciclo de Krebs pode ser regulada através da concentração de intermediários. Como o Ciclo de Krebs é produtor de NADH + H+ e FADH2, existem reações chamadas de “reações anapleróticas” que acontecem para que o Ciclo de Krebs não pare completamente. Por exemplo: em certas condições, pode-se desviar muito oxalacetato do Ciclo de Krebs para a gliconeogênese através de uma outra enzima, a piruvato-carboxilase, que vai carboxilar o piruvato gerando oxalacetato. Assim, ter-se-á mais oxalacetato que poderá ser usado tanto no Ciclo de Krebs quanto na gliconeogênese. Em algumas bactérias e plantas esse oxalacetato é gerado pela enzima fosfoenol-piruvato-carboxilase, que vai converter o fosfoenol-piruvato em oxalacetato. As reações de geração de oxalacetato têm como objetivo impedir que os níveis de oxalacetato, substrato da primeira reação do ciclo, caiam muito e o Ciclo de Krebs pare.

Apesar de o oxalacetato ser um precursor da síntese da glicose, o acetil-CoA não o é, mesmo eles participando da mesma reação de formação de citrato. Isso pode ser percebido pela degradação de ácidos graxos: caso o acetil-CoA fosse um possível precursor da síntese de glicose, a degradação de ácidos graxos formaria glicose, mas experimentalmente sabe-se que isso não acontece. A degradação dos ácidos graxos forma apenas o acetil-CoA, incapaz de se transformar em glicose.

  • Regulação do complexo enzimático Piruvato-Desidrogenase

O complexo da piruvato desidrogenase é fortemente inibido por ATP, acetil-CoA e NADH, os produtos das reações catalisadas por esse complexo. Tanto a E2 quanto a E3 são reguladas alostericamente. A E2 tem como modulador alostérico positivo a coenzima A e a E3 tem como modulador alostérico positivo o NAD+. Isso acontece porque a E2 transfere o acetil para a coenzima A. Assim, conforme a concentração de coenzima A aumenta, a velocidade da reação é aumentada. A E3 transfere seus elétrons ganhos através da oxidação da diidro-lipoamida e redução do seu FADem FADH2 para o complexo NAD+. Dessa forma, quanto maior a concentração de NAD+, mais rápida será a reação.

Analogamente, os moduladores alostéricos negativos da E2 e da E3 são, respectivamente, o acetil-CoA e o NADH + H+. Ambos os moduladores negativos são produtos das reações catalisadas pelas enzimas. Dessa forma, os produtos, quando em grande quantidade, sinalizam que a conversão de substrato em mais produto é desnecessária.

A E1 (piruvato-desidrogenase) é modulada por uma modificação covalente em sua estrutura: a fosforilação. Quando a E1 está desfosforilada, ela encontra-se ativa. Quando ela está fosforilada, encontra-se inativa. A piruvato-desidrogenase-quinase vai fosforilar a E1. A piruvato-desidrogenase-fosfatase vai desfosforilar a E1. A quinase e a fosfatase fosforilam e desfosforilam a E1 respondendo a certas modificações alostéricas:

QUINASE – a quinase vai fosforilar E1 quando houver NADH + H+ e acetil-CoA no meio, ou seja, quando o produto HETPP for desnecessário, tornando a E1 inativa. O ADP e o piruvato vão atuar negativamente na quinase, tornando-a inativa e fazendo com que não haja fosforilação da E1, tornando-a ativa. O piruvato vai modular positivamente a E1 porque indica alta taxa de glicólise e conseqüente necessidade de acetil-CoA. O ADP modula positivamente E1 porque há escassez de ATP e E1 fará com que haja acetil-CoA suficiente para formação de mais ATP. Esquematizando:

↑ NADH + H+ - ↑ Quinase - ↑ Fosforilação de E1 -↓ Atividade de E1

↑ ADP e Piruvato - ↓ Quinase - ↓ Fosforilação de E1 - ↑ Atividade de E1

FOSFATASE – a fosfatase vai desfosforilar E1-Pi (inativa) quando a atividade dessa enzima for novamente necessária. A fosfatase é geralmente ativa na presença de Ca2+. O Ca2+ modula positivamente a fosfatase e, conseqüentemente, a E1, pois a alta concentração de Ca2+ indica alta taxa de contração muscular. Para essa contração muscular acontecer é necessário, além do Ca2+, ATP. Dessa forma, a E1 será modulada positivamente para que produza o ATP necessário. Esquematizando:

↑ Ca2+ - ↑ Fosfatase - ↑ Desfosforilação de E1-Pi - ↑ Atividade de E1

A regulação do complexo piruvato desidrogenase afeta o Ciclo de Krebs porque altera as taxas de formação de acetil-CoA, produto essencial para o ciclo.

  • Regulação das enzimas do Ciclo de Krebs

São três as enzimas reguladas no Ciclo de Krebs: a isocitrato-desidrogenase, a citrato-sintase e a α-ceto-glutarato-desidrogenase.

A isocitrato-desidrogenase sofre apenas regulação alostérica. Os moduladores alostéricos positivos dessa enzima são o FAD+ e o ADP. O modulador alostérico negativo é o NADH + H+. Em bactérias, a isocitrato-desidrogenase é, também, regulada por modificações covalentes, sendo inativada por fosforilação.

A citrato-sintase e a α-ceto-glutarato-desidrogenase sofrem regulação alostérica. O modulador alostérico positivo da citrato-sintase é o ADP e seus moduladores negativos são o NADH + H+, o succinil-CoA, o citrato (produto da enzima) e o ATP.

A α-ceto-glutarato-desidrogenase tem como modulador alostérico positivo o Ca2+ e como modulador alostérico negativo o succinil-CoA e o NADH + H+.

O succinil-CoA é modulador alostérico negativo da citrato-sintase mesmo sem jamais ser utilizado pela citrato-sintase. Ele inibe a citrato-sintase através de meios de feedback negativo para que a velocidade do Ciclo de Krebs diminua.

Em algumas plantas, pode acontecer o ciclo do bioxalato. Este ciclo também acontece a partir do acetil-CoA e possui algumas enzimas em comum com o Ciclo de Krebs, produzindo, no final do ciclo, o oxalacetato. No ciclo do bioxalato, há duas enzimas que não existem no Ciclo de Krebs: a isocitrato-liase e a malato-sintase. A isocitrato-liase degrada o isocitrato em succinato e bioxalato. O bioxalato gera o malato através da malato-sintase. O acetil-CoA dessas plantas, ao contrário do acetil-CoA humano, é gliconeogênico.

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