Técnica asséptica. Técnica de cultura pura. Diluições Decimais

Técnica asséptica. Técnica de cultura pura. Diluições Decimais

(Parte 1 de 5)

Protocolos de Microbiologia – Engenharia Biomédica

Trabalho Experimental 3. Técnica asséptica. Técnica de cultura pura. Diluições decimais.

3.1 Técnica asséptica

Quando se pretende cultivar uma cultura de um único microrganismo é importante que não existam contaminações provenientes dos meios e materiais utilizados na manipulação dessa cultura e do meio ambiente, isto é, que se trabalhe em condições de assepsia. Todos os cuidados de assepsia devem observar dois princípios fundamentais: - Não permitir que microrganismos existentes no laboratório contaminem as amostras.

- Não permitir que as culturas em estudo contaminem o laboratório. Todos os objectos que entrem em contacto com as culturas (incluindo os meios de cultura) devem ser esterilizados. A transferência de culturas de um meio para outro deve ser realizada junto a uma chama de um bico de Bunsen ou dentro de uma câmara de fluxo laminar.

3.2 Técnica de cultura pura. Uma população microbiana, em condições naturais, contém muitas espécies diferentes. Quando uma cultura de microrganismos se destina à sua identificação ou a estudos bioquímicos ou fisiológicos, o primeiro passo reside na obtenção de uma cultura pura, i.e., uma cultura em que apenas se encontra presente um tipo de microrganismo. Para obter uma cultura pura podem ser utilizadas as técnicas de estrias, de espalhamento ou de incorporação em meio sólido. A técnica de purificação pelo método das estrias baseia-se no espalhamento de um inóculo de uma cultura mista várias vezes sobre o ágar e permite obter colónias isoladas podendo ser utilizada para passar colónias de um meio sólido para outro, bem como para separar misturas de microrganismos em suspensão (ver Figura 3.1).

Figura 3.1 Culturas obtidas pelo método das estrias.

Designa-se por colónia, uma população de células descendentes de um único microrganismo e, apesar de muitas espécies de bactérias darem origem a colónias de aspecto similar, é possível iniciar a identificação de espécies bacterianas pela morfologia das colónias formadas.

Passagem inicial

Colónias isoladas

Protocolos de Microbiologia – Engenharia Biomédica

Logo que os microrganismos tenham sido isolados em cultura pura, é necessário manter as culturas vivas pelo período de tempo necessário ao seu estudo e caracterização. Com este intuito deve-se proceder à conservação dos microrganismos seja por períodos mais ou menos longos. À excepção de alguns microrganismos psicrófilos, a utilização de temperaturas abaixo de 0 ºC previne o crescimento dos microrganismos, uma vez que inibe o seu metabolismo. A conservação por refrigeração (temperaturas entre 4 a 10 ºC) é um método adequado para um período de tempo curto (alguns meses), enquanto que os métodos de congelação a -20 ºC, liofilização e armazenagem em azoto líquido (-196 ºC) permitem uma conservação de longa duração (até alguns anos).

3.3 Diluições decimais A quantidade de organismos presentes em água, leite ou outros alimentos pode ser determinada utilizando o método da contagem de colónias formadas. É um método simples, aplicado universalmente, produzindo, em geral, bons resultados. Esta técnica pode ser também utilizada para calcular o número de organismos numa cultura de bactérias. Normalmente, numa amostra, esse número é demasiado elevado para ser contado directamente. No entanto, se se diluir a amostra colocando-a depois numa superfície de ágar de forma que uma só bactéria forme uma colónia isolada visível, o número de colónias pode ser utilizado para quantificar o número de células vivas viáveis correspondentes a essa diluição conhecida. Normalmente, a amostra é diluída em factores de 10 e cultivada em ágar, como ilustrado na figura seguinte.

Depois da incubação, determina-se o número de colónias nas placas que apresentem entre 30 e 300 colónias. Esta gama de 30 a 300 colónias é escolhida por ser considerada estatisticamente

Cultura

1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml

9 ml

Número demasiado159 17 2 0

elevado de colónias colónias colónias colónias colónias

Protocolos de Microbiologia – Engenharia Biomédica significativa. Se existirem menos de 30 colónias, pequenos erros na técnica de diluição ou a presença de contaminantes terão um efeito drástico na contagem final. De forma semelhante, se existirem mais de 300 colónias poderá ser difícil isolá-las claramente. Poderá obter-se uma maior precisão nos resultados, utilizando mais do que uma placa de Petri para cada diluição.

Protocolos de Microbiologia – Engenharia Biomédica

Material necessário

Reagentes • Ágar nutritivo

• Meio NB

• Suspensão de E. coli em NB

• S. cerevisiae em ágar nutritivo

• Água esterilizada

Material • Ansa

• Espalhador

• Espátula

• Fósforos

• Funis

• Lamparina

• Marcador

• Placas de Petri

• Pontas de micropipeta esterilizadas

• Suportes para tubos de ensaio

• Tubos de ensaio

• Frasco

Equipamento • Autoclave

• Estufa

• Medidor de pH

• Microondas

• Agitador magnético

Protocolos de Microbiologia – Engenharia Biomédica

Procedimento experimental

Parte A. Técnica asséptica

Remoção de microrganismos de uma cultura em caldo NB (organismos em meio líquido):

• Esterilizar a ansa passando-a através da chama até que todo o fio fique rubro. Desta forma todos os contaminantes do fio são incinerados. Nunca afastar a ansa depois de esterilizá-la ou poderá voltar a ficar contaminada. Esperar que a ansa arrefeça um pouco para evitar eliminar o inóculo.

• Segurar o tubo com uma mão agitando ligeiramente o tubo de forma a suspender os organismos e, na outra mão, segurar a ansa esterilizada como se fosse um lápis.

• Remover a tampa do tubo com cultura pura com o dedo mindinho da mão que tem a ansa. Não pousar a tampa para que não fique contaminada.

(Parte 1 de 5)

Comentários