técnicas de contagem

PRÁTICA : TÉCNICAS DE CONTAGEM

PROFESSORA : OLGA MARTINS MARQUES

OBJETIVOS:

Determinar a concentração de células de leveduras pelo uso das seguintes técnicas: Técnica do Plaqueamento, Contagem direta ao microscópio (pelo uso da câmara de Neubauer),e por turbidimetria.

1. Contagem de Células Viáveis pela Técnica do Plaqueamento

Material

- Amostra: Saccharomyces cervisiae (solução de fermento prensado em água)

- Meio de cultura: Glicose Agar

- Diversos: Pipetas de 1ml, Placas de Petri, tubos de ensaio com 9ml de água estéril, Erlenmeyer com 99ml de água estéril, Bico de Bunsen

Procedimento Experimental

• para a contagem em placa, da amostra contendo a cultura S. cerevisiae fazer diluições até 1x10^-7 e plaquear em duplicata 1ml das diluições de 1x 10^-4 a 1x10^-7.

• colocar 1 ml de cada diluição em placas e adicionar 10-20ml de meio de cultura (GA) , homogeneizar, esperar solidificar.

- incubar a temperatura ambiente por 24-48 horas.

FIG 1: Esquema de diluição da técnica das diluições sucessivas

2. Concentração Celular e Contagem de Células Viáveis de Leveduras pelo Uso da Câmara de Neubauer

A contagem direta por microscópio, é a mais rápida, e é levada a efeito com a contagem de organismos num volume conhecido da cultura. Esta enumeração é feita com o auxílio de lâminas espessas, conhecidas como câmaras de contagem. As mais comuns são as de Petroff-Hausser, Neubauer e as de Helber. estas câmaras apresentam uma área reticulada, com pequenos quadrados de superfície conhecida. Fazendo parte do conjunto, existe uma lamínula que recobre os pequenos quadrados, de modo que a altura destes à lamínula é conhecida.

No nosso experimento, as leveduras serão contadas numa câmara de Neubauer, que apresenta uma área dividida em quadrados com 1/400mm²; a câmara é coberta com uma lamínula, deixando uma altura de 1/10mm, i.é., de cada quadrado à lamínula. Assim sendo o volume que fica acima de cada quadrado é de 1/4000 mm³.

Esta contagem inclui organismos viáveis e mortos, sendo denominada de contagem total de células.

Este método de contagem direta, tem a vantagem de fornecer um resultado quase imediato, no entanto tem a desvantagem de não se ter a distinção entre células vivas e mortas.

Material

- Microrganismo: Cultura de Saccharomyces cervisiae

- Reagentes: Solução salina fisiológica (0,85% NaCl)

-Equipamentos:Microscópio ótico comum, Câmara de contagem de Neubauer

Bico de Bunsen

- Diversos: Pipeta Pasteur

Procedimento Experimental

• Pipeta 1ml da amostra de suspensão celular para um tubo de ensaio;

• Adicionar 1ml de corante celular (solução 0,02% de azul de metileno em solução a 2% de citrato de sódio)

• Homogeneizar e deixar em repouso por 15 minutos

• Adicionar com uma pipeta Pasteur ou similar, uma gota da suspensão da cultura de levedura sobre a área reticulada da câmara;

• Ajustar a câmara à platina do microscópio;

• Colocar a lamínula sobre a gota. Alternativamente, pode-se colocar primeiro a lamínula, e deixar-se que a suspensão do microrganismo, que sai da pipeta, escorra por ação capilar sob a lamínula;

• Esperar cerca de dez minutos, até que o material sedimente;

• Usando a objetiva de 40-45X, contar as leveduras em cerca de 10 quadrados dispostos em “X” (ver figura 1).

OBSERVAÇÃO

• Na contagem das células devem ser desprezados os “brotamentos” a menos que seu tamanho seja maior que metade da célula original;

• O número de células por quadrado deve estar situado entre 20 e 30.

• Caso a concentração no campo ótico seja superior à faixa desejada, fazer diluições da suspensão original e em seguida corar as células com a solução de azul de metileno;

• As células situadas sobre as linhas divisórias à esquerda e abaixo dos quadrados, são contadas como pertencentes àquele quadrado.

CÁLCULO:

Concentração Celular

- Calcular o número de leveduras/mL, contidas em uma suspensão utiliza-se a seguinte fórmula

Concentração Celular (leveduras/mL) = n x 25000 x diluição

onde n= número de células dos quadrados

Exemplo:

n = 232

diluição 1:100

Concentração celular = 232 x 25000 x 100 = 5,8 x 10⁸ células/mL

VIABILIDADE CELULAR (%) = N_v x 100

N_t

Onde: N_v = número de células vivas,

N_t = número total de células (vivas e mortas)

6 1
2 7
3 / 8
4 9
5 10

FIG.1- Câmara de Neubauer