AULA - Técnicas Imunológicas de Diagnóstico Laboratorial

AULA - Técnicas Imunológicas de Diagnóstico Laboratorial

Técnicas Imunológicas de Diagnóstico Laboratorial

Thiago Nobre Gomes Monitoria de Imunologia

Universidade Estadual do Piauí –UESPI

Campus Alexandre Alves de Oliveira

Curso: Licenciatura em Ciências Biológicas

Disciplina: Imunologia

ProfªDra. DulcecleideBezerra de Freitas Período 2010.2

Sumário

Introdução; Anticorpos ou Imunoglobulinas (Igs);

Estrutura dos anticorpos;

Anticorpos: chave para o diagnóstico;

Metodologias que utilizam reagentes não-marcados;

Metodologias que utilizam reagentes marcados;

Referências.

Técnicas Imunológicas de Diagnóstico Laboratorial

Introdução

Imunologia:

Estudo dos mecanismos de resposta do organismo a substâncias estranhas (patógenos) -Antígenos;

Imunidade Adquirida ou Específica:

Humoral; Celular.

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Introdução

Auxílio a outras técnicas que são rotina em ambientes clínicos:

Genética e Biologia Molecular moderna; Bioquímica e fracionamento de proteínas;

Existem centenas de técnicas imunológicas;

As respostas dos linfócitos também são estudadas.

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Anticorpos ou Imunoglobulinas (Igs)

Conceito:

Proteínas solúveis que circulam livremente – Globulinas;

Encontradas em 2 formas:

Secretada (plasmócitos);

Ligada à membrana (receptor de LB naiives).

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Anticorpos ou Imunoglobulinas (Igs)

Funções:

Evitam a entrada e disseminação de patógenos; Mediadores da resposta imune humoral;

Atravessam a placenta (mãe > feto);

Atividade biológica dependente de sua estrutura.

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Estrutura dos Anticorpos Técnicas Imunológicas de Diagnóstico Laboratorial

Anticorpos: chave para o diagnóstico

InteraçõesAntígeno-Anticorpo: Medida qualitativa e quantitativa do Ag ou Ac.

Investigação celular e molecular: localização e caracterização dos antígenos;

A alta especificidade do anticorpo é usada na identificação, isolamento ou quantificação de um antígeno particular.

Imunogenicidade;

Antigenicidade.

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Anticorpos: chave para o diagnóstico

Efeitos da combinaçãoAntígeno-Anticorpo:

Aglutinação: partícula antigênica + Ac específico = agregação de partículas;

Precipitação: Ag solúvel + Ac;

Ativação do Complemento(C): Ag em solução ou em partícula + Ac específico;

Citolise: Célula + anti-célula Ac;

Opsonização: Ag + Ac + C aumenta a fagocitose por monócitos ou macrófagos

Neutralização: Toxinas, viroses, enzimas + Ac específico = inativação.

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Anticorpos: chave para o diagnóstico

Metodologias que utilizam reagentes nãomarcados:

1. Reação de Precipitação;

2.Reação de Aglutinação;

3.Fixação do Complemento.

Metodologias que utilizam reagentes marcados: 4.Quantificação de Antígenos por Imunoensaios;

5. Imunofluorescência;

6.Citometria de Fluxo.

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Interações Antígeno-Anticorpo

1. Reação de Precipitação:

Quantificação de precipitados formados pela reação Ag- Ac;

Pode ocorrem em solução ou gel de agarose.

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Interações Antígeno-Anticorpo

Zona de equivalência: Ag-Ac se ligam equimolarmente formando uma rede estável.

Excesso de Ag: Os complexos podem ser dissolvidos quando há excesso de Ag pois o Ac fica livre para se ligar a novos Ag adicionados diminuindo a formação de complexos insolúveis.

Excesso de Ac: Ocorre redução de imunocomplexos pois todo o Ag está precipitado e fica

Ac livre no sobrenadante. Efeito Pró-Zona

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Interações Antígeno-Anticorpo

Excesso de anticorpos na amostra, que ocorre nos soros fortemente reagentes;

Pode ocasionar falsos-negativos;

Para evitá-lo, emprega-se soro diluído.

Possui sensibilidade de detecção menor quando comparados a outras técnicas imunológicas.

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Interações Antígeno-Anticorpo

2.Reação de Aglutinação:

Formação de agregados visíveis como resultado da interação de Acs específicos e partículas insolúveis que contêm determinantes antigênicos na superfície;

Comparada à precipitação, é mais sensível, necessitando de uma quantidade deAc 500 vezes menor;

Diagnóstico de doenças causadas por vírus, bactérias, protozoários e fungos, doenças auto-imunes, na detecção de hormônios, na tipagem de grupos sanguíneos dos sistemasABO e Rh,etc.

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Interações Antígeno-Anticorpo

2. Reação de Aglutinação Direta:

Partículas que apresentam determinantes antigênicos naturais em sua superfície;

Hemácias, bactérias, protozoários, etc;

Diluições em série do anticorpo, frente a uma quantidade constante de antígeno;

Tipagem ABO e Rh.

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Interações Antígeno-Anticorpo

2.Reação de Aglutinação Indireta:

Partículas que apresentam determinantes antigênicos associados a outras superfícies (partículas de látex ou poliestireno) ou superfície de hemácias;

Adsorção passiva, adsorção via agentes químicos e conjugação do antígeno;

Sua aplicação é muito variada: grande diversidade de Ags que podem se ligar às células.

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Interações Antígeno-Anticorpo

3. Fixação do Complemento:

Formação de complexos imunes e fixação do complemento por via clássica;

Determinação da quantidade deAg eAc na amostra;

Detecções deAc em níveis inferiores a 1 µg/mL;

Antígeno misturado com o soro teste; Complemento é ativado;

Eritrócitos recobertos com anticorpo são adicionados;

A quantidade de lise é limitada ou não.

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Interações Antígeno-Anticorpo

Etapas:

ComplexoAg-Ac = complexos imunes; Fixação e consumo do complemento;

Se houver complemento: lise celular;

Se o complemento foi consumido:não há lise celular.

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Anticorpos: chave para o diagnóstico

Metodologias que utilizam reagentes não marcados: 1. Reação de Precipitação;

2.Reação de Aglutinação;

3.Fixação de Complemento.

Metodologias que utilizam reagentes marcados:

4.Quantificação de Antígenos por Imunoensaios;

5. Imunofluorescência;

6.Citometria de Fluxo.

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Interações Antígeno-Anticorpo

4.Quantificação deAgs por Imunoensaios:

São os mais utilizados; Ensaios de captura de 2 fases ou pelo ensaio competitivo;

Ensaios de fase sólida p/ Acs utilizando ligantes de isótopos radioativos ou com enzimas;

Radioimunoensaio (RIE);

Ensaio Imunossorvente Ligado à Enzimática (ELISA – Enzime-Linked Immunosorbent Assay);

A versão mais comumente usada é o “ensaio em sanduíche”.

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ELISA Sanduíche

Utilização:

Dosagem de hormônios, marcadores tumorais e outras proteínas séricas;

Detecção de antígenos virais e outros patógenos em fezes, urina e secreções.

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ELISA por Competição Técnicas Imunológicas de Diagnóstico Laboratorial

Vantagens do ELISA

Sensibilidade e especificidade maior que o RIA;

Reação Ag-Ac é mediada pela atividade enzimática;

Utiliza reagentes estáveis;

Não utiliza radioisótopos;

Não depende de formação de precipitado, aglutinado, etc;

Pode ser adaptado tanto a testes simples quanto à automação;

Vários testes podem ser realizados simultaneamente.

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Interações Antígeno-Anticorpo

5. Imunofluorescência:

Um das mais utilizadas no diagnóstico de laboratório para a pesquisa de Acs para Ags celulares e teciduais;

Baseia-se na capacidade das moléculas de Ac se ligarem covalentemente a fluorocromos sem perder sua reatividade específica com o Ag;

Resultado: microscópio de fluorescência. Técnicas Imunológicas de Diagnóstico Laboratorial

Interações Antígeno-Anticorpo

5. Imunofluorescência: Diagnóstico de doenças auto-imunes;

Anticorpos monoclonais para a pesquisa de microrganismos e seus componentes em espécimes clínicas.

Intensidade de fluorescência de cada célula;

Isolamento de diferentes populações

celulares c/ diferentes Ags de superfície, corados por diferentes Acs de fluorescência;

Direta ou Indireta. Técnicas Imunológicas de Diagnóstico Laboratorial

Interações Antígeno-Anticorpo

Direta: se o Ac reagir com o Ag, é visto como uma mancha verde sob luz ultravioleta;

Indireta: Ac fluorescente dirigido contra Acs, também funcionando como Ag; melhor visualização que a direta.

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6. Citometria de Fluxo: Separação de células marcadas por fluorescência;

Acs dirigidos contra moléculas de membrana ou Ags do Conjunto de Diferenciação (CD);

CadaAc é marcado com um fluorocromo diferente;

Teste qualitativo e quantitativo.

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Interações Antígeno-Anticorpo

Determinar o tipo e nº de células brancas sanguíneas;

Isolamento e avaliação de sub- populações celulares, como CD4 e CD8;

Distribuição de células de acordo com a densidade dosAgs;

Tamanho celular;

Uso de múltiplos Acs fluorescentes:

diagnóstico do HIV e leucemias agudas. Técnicas Imunológicas de Diagnóstico Laboratorial

Referências

Imunologia Celular e Molecular. 6 ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2008.

Imunologia. 4 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan,2002.

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