CLAE-Cromatografia líquida de alta eficiência

CLAE-Cromatografia líquida de alta eficiência

O chá preto vem despertando a curiosidade e ganhando destaque para fins terapêuticos como, por exemplo, no controle da diabetes mellitus que apresentando um grande crescimento de casos, como mostra o gráfico. A diabetes Mellitus é classificada como uma doença metabólica de etiologia múltipla, caracterizada por hirperglicemia, dislipidemias e obesidade resultante de defeitos na secreção ou na ação da insulina ou em ambas. Essa doença se divide em diabetes tipo1 onde ocorre geralmente destruição autoimune das células β pancreáticas, a diabetes tipo 2 que é mais comum caracterizada pela resistência variável a insulina. A utilização de chá preto como terapia fitoterapia no controle da diabetes mellitus, além de acarretar um tratamento menos agressivo ao paciente e também um tratamento de baixo custo e vem sendo utilizados em países subdesenvolvidos na rede pública de saúde. O chá preto conhecido cientificamente como camellia sinensis de origem asiática que atualmente está adaptado as condições do Brasil, os principais tipos de chás provenientes dessa espécie são distinguíveis pelo seu processamento. A preparação do chá preto consiste na desidratação das folhas e do caule frescos, são secados e fermentados. Além do controle da diabetes mellitus o chá preto auxilia no tratamento de doenças cardiovasculares e do câncer. Os principais compostos causadores desses benefícios são das classes das catequinas, flavonóides poliméricos, flavonóis e metilxantinas. Os flavonóides presentes na chá preto como também no verde pode atuar sobre a diabetes mellitus de diversas formas, podendo exibir efeitos hipoglicêmicos, antioxidantes ou insulino-estimulante. Atualmente o chá preto é classificado como um alimento funcional, que desperta o interesse de vários pesquisadores e laboratórios interessado no impacto positivo dos alimentos para a saúde humana.

Estimativa de casos de diabetes mellitus por país no ano de 2010

EUA China Índia Japão Brasil

Determinação (qualitativa e quantitativa) de cafeína em amostras de chá utilizando a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE).

Separação e análises quantitativas de uma grande variedade de compostos; Escala de tempo de poucos minutos;

Alta resolução;

Alta eficiência;

Alta detectabilidade.

- Balões volumétricos de 10, 25 e 50 mL; - Pipeta graduada de 5 mL;

- Béquer de 250 mL;

- Proveta de 100 mL;

- Vidro de relógio;

- Chapa de aquecimento;

- Pipeta de Pasteur;

- Água MiliQ (nano pura);

- Metanol- Grau cromatográfico;

- Membrana 0,45 µm (d.i. do poro);

- Padrão analítico de cafeína.

- Cromatógrafo Líquido- Shimadzu; - Detector: UV-visível – Modelo: SPD – 10ADVP ( λ = 254 nm).

- Injetor Reodyne com Loop (alça de amostragem) de 20 µL.

- Coluna: Shimadzu – Pack C18: (250 m x 4,6 m D.I., diâmetro da partícula 5 µm e diâmetro do poro = 100 Å).

- Pressão máxima da coluna: 300 Kgf/cm2 .

Fase móvel: Metanol solução aquosa ácida pH 3,5 (35:70 v/v) Vazão: 1 mL/min. Alça de amostragem: 20 µL.

Figura: Diagrama de blocos mostrando os componentes típicos de um sistema CLAE

Podemos acoplar diferentes detectores:

Ultravioleta; Fluorescência;

Índice de refração;

Eletroquímicos.

PROCEDIMENTOS Padrão

Partindo de uma solução padrão de cafeína na concentração de 0,5 mg/mL , preparar as soluções diluídas nas seguintes concentrações : 0,025; 0,05;0,075;0,1 e 0,0125 mg/mL. Estas soluções diluídas deverão ser preparadas em solução de metanol 30% , pH 3,5. Amostra de chá

Mergulhar a amostra de chá preto em 200 mL de água MiliQ á 80°C por 10 minutos. Após atingir á temperatura ambiente, pipetar 2,0 mL da amostra em um balão volumétrico de 10 mL e completar o volume com a solução de metanol 30% pH 3,5. Filtrar em membrana com 0,45µm de porosidade.

Curva padrão de cafeína em chá preto:

Figura: Curva de calibração da cafeína. Linear Regression for caffeine:

Y = A + B * X Parameter Value Error A 1.33117E6 898633.82219 B 3.35813E8 1.08379E7 R SD N P 0.99844 856813.73088 5 <0.0001

Concentração de cafeína (mg/mL)

ANALITO PROPORÇÃO FASE MOVEL COMPRIMENTO DE ONDA ÁREA (u.a) TEMPO (min.) Chá preto 35:65 254 nm 19911492 8,221

Padrão 0,025 mg/mL 40:60 254 nm 10631958 6,717

Padrão 0,025 mg/mL 40:60 272 nm 10255947 6,853

Tabela: Dados da analise experimental de separação por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada com um detector UV-visível.

Figura: Espectro de separação cromatográfica líquida de alta eficiência utilizando um detector UV -Vis da amostra de chá preto.

Cálculo da concentração de cafeína no chá preto:

Temos a seguinte equação da reta na curva padrão Y = 1331170 + 335813000 x

Encontramos a área do espectro da cafeína que corresponde á 19911492 u.a, substituindo na equação da curva padrão temos:

19911492 = 1331170 + 335813000x X = (19911492 – 1331170) / 335813000 X = 0,05532937 mg/mL Como a amostra foi diluída para analise temos:

C1 . V1 = C2 .V2 C1 . 2,0 mL = 0,05532937 mg/mL . 10,0 mL C1 = 0,276 mg/mL de cafeína na amostra de chá preto

A amostra apresenta na rotulagem uma concentração de cafeína de cerca de 0,17 mg/mL, portanto tivemos um erro :

Uma possível explicação para esse erro é devido à preparação do chá preto, onde podemos ter deixado mais concentrado do que deveria.

Calculo do coeficiente de variação: Infelizmente não tivemos acesso à concentração de todos os grupos apenas de alguns.

Número do Grupo Concentração Grupo 1 0,217 mg/mL

Grupo 2 0,199 mg/mL Grupo 8 (Minha concentração) 0,276 mg/mL

Essa porcentagem é alta devido que a variação das concentrações apresentou uma razoavelmente grande, temos um intervalo de concentração de 0,077 .

1.Mecanismo de separação em cromatografia líquida em fase reversa:

O tipo de CLAE mais utilizado é a cromatografia por partição, na qual a fase estacionária é um segundo líquido que é imiscível com o líquido da fase móvel. A cromatografia por partição pode ser subdividida em cromatografia líquido-líquido e cromatografia líquida com fase ligada. A diferença entre as duas está na forma com a qual a fase estacionária é imobilizada nas partículas de suporte do recheio. O líquido é imobilizado por adsorção física em cromatografia líquido-líquido, enquanto é retido por meio de ligações químicas na cromatografia líquida com fase ligada. Inicialmente a cromatografia por partição era exclusivamente do tipo líquido-líquido; atualmente, contudo, os métodos de fase ligada predominam por causa de sua maior estabilidade. Os recheios do tipo líquido-líquido estão hoje em dia relegados a certas aplicações especiais. O método consiste de uma fase líquida (estacionária) que por absorção física é retida na superfície da coluna empacotada geralmente com sílica e de uma fase móvel, também líquida, que passa sobre esta fase estacionária sendo uma destas polar e a outra apolar. A separação baseia-se na solubilidade da amostra em relação ao solvente (fase móvel) e a fase estacionária, sendo assim os componentes da amostra que são mais solúveis na fase móvel são eluidos primeiro enquanto os que têm maior afinidade com a fase estacionária são seletivamente retidos por ela

2. Como otimizar as condições de cromatográficas( proporção dos componentes da fase móvel e comprimento de onda)

Proporção dos componentes:

A medida que modificamos a proporção de reagentes na fase móvel modificamos a polaridade dessa fase assim alteramos o tempo de análise, por exemplo no caso da cafeína a medida que mudamos a proporção de 35:65 para 40:60 diminuímos o tempo de análise de 8,221 minutos para 6,717 minutos essa foi uma forma de otimizar a análise.

Comprimento de onda:

Para otimizar as condições cromatográficas em relação ao comprimento de onda, devemos trabalhar no comprimento de onda máximo como é indicado na lei de Beer que no caso da cafeína é de 272nm, porém trabalhamos no comprimento de onda de 254 nm e obtivemos um erro positivo em relação a lei de Beer, o erro foi razoavelmente baixo, devido podermos trabalhar em uma faixa de comprimentos de onda máximo, tanto em relação a área quanto em relação ao tempo, mas o correto para se otimizar uma determinada substância é utilizar o comprimento de onda máximo.

3. Discutir os métodos de eluição por gradiente e isocrática:

Para ilustra nossa discussão, selecionamos um separação cromatográfica encontrada na bibliografia 3, onde temos uma separação por gradiente e outra isocrática. O modo de análise isocrática consiste em analisar uma amostra em que a fase móvel permanece em proporção constante durante toda a análise. O modo de eluição por gradiente consiste em uma modificação programada da proporção dos reagentes da fase móvel.

Figura: Diferentes modos de separação (a) por gradiente, (b) isocrática.

Podemos perceber que a ordem de eluição dos componentes permanece a mesma, porém a intensidade dos picos variou muito, temos que na análise por gradiente a maior intensidade de pico foi do pentaclorobenzeno já por análise isocrática foi do monoclorobezeno. Outro fator interessante é a proximidade dos picos gerando uma análise mais rápida pro gradiente.

Modo Tempo Proximidade entre os picos Resolução

Gradiente Menor, devido a mudança da polaridade da fase móvel que assim gera uma rapidez na eluição de compostos de diferentes polaridades.

Mais próximos devido a tempo de eluição ser menor pela mudança de polaridade, isso pode ser uma vantagem pelo quesito tempo, mas também uma desvantagem devido à proximidade pode ocorrer sobreposições de picos.

Resolução satisfatória, porém os picos estavam razoavelmente próximos o que poderia geral uma possível sobreposição que no caso acima não ocorreu.

Isocrática Maior, devido a constante polaridade da fase móvel que assim gera uma maior tempo de eluição para composto de diferentes polaridades.

A proximidade entre os picos varia de próximos a distantes, com isso podemos determinar a polaridade dos compostos.

Resolução de qualidade ruim em relação aos últimos picos que apresentam caudas laterais.

A análise pelo modo de eluição por gradiente é mais conveniente devido sua rapidez e sua resolução, porém a análise isocrática é indicada para análise o compostos específicos.

A separação por cromatografia líquida de alta eficiência, proporção uma separação razoavelmente boa, porém esse equipamento é de custo elevado dependendo do tipo de coluna empregada e do detector. O trabalho sendo realizado em uma amostra real no caso de chá foi muito interessante devido a complexidade da amostra, e as perspectivas que obtivemos sobre o chá preto nas quais contribuem para a saúde e a qualidade de vida de pessoas com doenças crônicas.

1. Silva, S.R.S.; Oliveira, T. T.; Nagem, T.J.; Uso de chá preto (Camellia sinensis)no controle de diabetes mellitus; revista de ciências farmacêutica básica e aplicada., 2010; 31(3):133-142.

2D. A. Skoog, F. J. Holler, T. A. Nieman, Princípios de Análise Instrumental, 5ª

Ed., Bookman, 2006.

3. Skoog, West, Holler; Fundamentos de Química Analítica, Ed. Thomson , 8°Ed.

4. Collins. C. H., Braga G. L., Bonato P. S. ; Fundamentos de cromatografia, Ed. Unicamp, 2007.

Comentários