Determinação da concentração protéica

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Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos Departamento de Ciências Básicas

Bioquímica Fundamental- ZAB0361 Prof. Dr. Marcelo de Cerqueira César

Relatório 3: Determinação da concentração protéica

Fernanda Yamanaka Hayashi

Pirassununga - SP Maio/2011

1. Introdução	2
2. Objetivos	6
3. Materiais e Métodos	6
3.1 Materiais	6
3.2 Métodos	6
4. Resultado e Discussão	7
5. Conclusão	10

Sumário 6. Referências Bibliográficas .......................................................................... 1

1. Introdução

O leite é considerado um alimento perfeito da natureza e apresenta composição rica em proteínas, vitaminas, gordura, carboidratos e minerais (principalmente cálcio), alimento importante à saúde do homem, sendo indicado para todas as idades; as restrições ao seu uso são limitadas a casos excepcionais [1].

Os componentes principais do leite, segundo dados de Sperling, Victor, são os seguintes:

Componentes Média em leite normal Média em leite desnatado

Ele é uma emulsão de glóbulos graxos, estabilizada por substâncias albuminóides num soro que contém em solução: um açúcar- a lactose, matérias protéicas, sais minerais e orgânicos e pequena quantidade de vários produtos, tais como: lecitina, uréia, aminoácidos, ácido cítrico, ácido láctico, ácido acético, álcool, lactocromo, vitaminas, enzimas, etc [2].

As principais proteínas do leite são a caseína, a b-lactoglobulina e a alactoalbumina. Os cinco tipos de caseínas (fosfoproteínas) representam 85% das proteínas do leite, o restante é constituído pelas outras proteínas [1].

Algumas outras proteínas, como, por exemplo, as enzimas, as imunoglobulinas e os hormônios, são encontrados em pequenas quantidades. Tanto a b-lactoglobulina como a a-lactoalbumina são nutricionalmente melhores que a caseína, devido ao maior conteúdo de aminoácidos essenciais, como lisina, metionina e triptofano [1].

A gordura, ou simplesmente “lipídeos”, é a fração mais variável do leite e pode modificar-se durante a ordenha, sendo que o primeiro leite é relativamente magro (0,7%), enquanto que o último ordenhado é mais gordo (1%) e possui constituição muito complexa, formada por 9,5% de compostos lipídicos e 0,5% de compostos lipossolúveis [3].

diminuição de gordura ambos mantém o teor de cálcio e proteínas do leite [4]

Segundo a Associação Brasileira da Indústria de Leite Longa Vida, o leite integral é considerado uma excelente fonte de cálcio e proteínas, além de possuir no mínimo 3% de gordura. Enquanto o leite semidesnatado apresenta uma diminuição no teor de gordura (de 0,6 a 2,9 % de gordura) e o leite desnatado apresenta uma diminuição ainda maior no teor de gordura em relação ao semidesnatado: no máximo 0,5 % de gordura. Mas apesar da

As proteínas desempenham papéis extremamente importantes, na maioria dos processos biológicos, atuando como enzimas, hormônios, neurotransmissores, transportadores através das membranas celulares e outros [5].

O desenvolvimento de metodologias para determinar proteínas tem, cada vez mais, se tornado de fundamental relevância em várias áreas do conhecimento, como por exemplo, em análises clínicas, favorecendo o diagnóstico de certas doenças correlacionadas com a alteração da quantidade de proteínas nos fluidos biológicos; em nutrição animal, ressaltando o aproveitamento racional de nutrientes; em problemas relacionados à nutrição humana, como obesidade, anorexia nervosa, desnutrição; em tecnologia e ciências de alimentos, objetivando o aproveitamento racional da matéria prima e o melhoramento dos produtos novos e já existentes e na área de química de proteínas objetivando purificar novas proteínas e enzimas [5].

Muitos métodos espectrofotométricos, ao longo dos anos, têm sido propostos para a determinação de proteínas totais, mas não existe uma metodologia considerada de uso universal para todos os meios. Os métodos geralmente mais utilizados são o do biureto, de Lowry, do “Coomassie brilliant blue” BG-250 ou reagente de Bradford, do BCA ou reagente de Smith, e de absorção de proteínas no ultravioleta [5].

Para se quantificar ou identificar este grupo de substâncias, normalmente é feito o fracionamento das amostras dos tecidos vegetais e, com base em reações químicas específicas entre o reagente e a estrutura do componente, consegue-se fazer a sua quantificação. Os produtos dessas reações podem ser quantificados por vários métodos, sendo o da colorimetria o mais utilizado [6].

A colorimetria visa determinar a concentração de uma substância, em condições bem definidas, pela medida da absorção de luz, tomando como referência a absorção da substância numa concentração conhecida. A principal vantagem desse método é de proporcionar um meio simples para determinar pequenas quantidades de substâncias [6].

Entre os métodos colorimétricos destaca-se a espectrofotometria, um processo analítico sensível, rápido, e cujos resultados são mais precisos, comumente utilizado na determinação da concentração de constituintes biológicos.

A partir da leitura dos valores de absorbância, de soluções padrões de concentrações conhecidas, obtém-se a curva padrão ou curva de calibração. Com esta curva, pode-se determinar a concentração de uma determinada substância presente em uma dada amostra [6].

A espectrofotometria é fundamental para a pesquisa bioquímica, destacando-se as seguintes situações: (a) se o índice de absorbância a um comprimento de onda específico for conhecido, a concentração de um composto pode ser estimada por meio da determinação de sua densidade ótica naquele comprimento de onda. (b) medindo-se a taxa de formação ou degradação de um composto que absorva a radiação, o curso de uma reação pode ser determinado e (c) compostos podem ser identificados através da determinação de seus espectros de absorção nas regiões visível e ultravioleta de espectro de energia radiante [6].

Nesta aula utilizou-se o método de Bradford que é baseado na interação entre o corante BG-250 e macromoléculas de proteínas que contém aminoácidos de cadeias laterais básicas ou aromáticas. No pH de reação, a interação entre a proteína de alto peso molecular e o corante BG-250 provoca o deslocamento do equilíbrio do corante para a forma aniônica, que absorve fortemente em 595 nm [5].

Este método tem sido utilizado para a determinação de proteínas totais em diversos meios: plasma ou soro sangüíneo, líquor, saliva humana, produtos alimentícios, leite humano, tecidos de plantas, suspensões de células, avidina e estreptavidina, urina e detergentes [5].

Algumas metodologias utilizando equipamentos automatizados estão tornando este método mais rápido. Mas o mesmo apresenta algumas desvantagens, tais como a variação da absortividade específica para diferentes proteínas, devido à baixa solubilidade ou baixo peso molecular das mesmas, e fornecimento de resultados nem sempre reprodutíveis devido ao grau de pureza do corante BG-250 que varia conforme a procedência, sendo recomendável a padronização das condições de reação para cada lote de corante adquirido [5].

Para tentar tornar mais uniforme a absortividade específica de diferentes proteínas, algumas alternativas são sugeridas: aumentar a concentração do corante; aumentar a solubilização das proteínas que vão reagir com o corante, usando detergentes, hidróxido de sódio ou fenol; ou aquecer com uréia e 2- mercaptoetanol. Entretanto, no caso de amostras com proteínas de baixo peso molecular, não é recomendável a utilização deste método [5].

Existem poucas substâncias, citadas na literatura, que são interferentes no método de Bradford. Estes interferentes normalmente reagem com as proteínas impedindo a reação com o corante BG-250 ou reagem com o corante causando aumento na absorbância [5].

Diversos fatores devem ser analisados antes da escolha de uma metodologia para a determinação de proteínas totais, porém, um deles é essencial: o conhecimento, o mais preciso possível, da natureza dos constituintes da amostra e de suas concentrações aproximadas. Isto facilitará a identificação dos possíveis interferentes e consequentemente ajudará na escolha do método mais apropriado para cada situação [7].

Outros fatores, também importantes, são a sensibilidade necessária, que é dependente da concentração de proteína na amostra e do volume de amostra disponível; a rapidez e o custo da metodologia; e, não menos importante, o grau de confiabilidade nos resultados obtidos devido aos interferentes no método escolhido [5].

2. Objetivos

Determinar a concentração protéica em amostras de leite integral e desnatado com auxílio do método de espectrofotometria.

3. Materiais e Métodos

3.1. Materiais Tubos de ensaio

Tampão PBS 1X

Amostras de leite integral e desnatado

Reagente Dye Pipetas

Parafilme

Espectrofotômetro

Identificaram-se 2 tubos como “amostra A” para o leite integral e “amostra

B” para o leite desnatado.

Diluiram-se as amostras em tampão PBS 1X na proporção 1:50, ou seja, 10 μL de leite para 490 μL de tampão.

Identificaram-se mais 8 tubos, um como “branco” e os outros foram enumerados de 1 a 7 para que cada número correspondesse a uma concentração de proteínas padrão.

Agitou-se o reagente Dye e adicionou-se 1 mL em cada tubo. Adicionaram-se ainda 20 μL do tampão PBS 1X no tubo “branco”. Em seguida, pipetaram-se 20 μL de cada amostra em seus tubos correspondentes, em triplicata.

Posteriormente, fecharam-se os tubos com parafilme e agitou-se cada um por 3 vezes e os mesmos foram incubados por 10 minutos.

Comparou-se visualmente a coloração das amostras com a dos padrões, após isso, passou-se o conteúdo de cada um dos tubos para uma cubeta e houve leitura da absorbância em um espectrofotômetro a 595 nm.

4. Resultado e Discussão

Após realização de todos os procedimentos e espera de 10 minutos, notouse a coloração dos tubos padrões variando desde um verde acinzentado até um tom azul petróleo, como pode ser visto na Figura 1.

Figura 1. Variação de cores dos tubos padrões.

Feita a comparação visual entre a amostra A, amostra B e os tubos padrões, a coloração se aproximou da melhor maneira do tubo 2 e 7, respectivamente. Como mostrado nas Figuras 2 e 3.

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