Tecnicas de Coloração de GRAM

Tecnicas de Coloração de GRAM

UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS

INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS E TECNOLOGIA

CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

MICROBIOLOGIA

5° Relatório

Técnicas de Coloração de Gram

Docente : Prof. Ilia Gilmara

Discente: Samara Detoni

Itacoatiara- AM

04/2011

SUMÁRIO

01.

Introdução

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02.

Objetivo

Pág. 03

03.

Metodologia

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3.1.

  • Materiais

Pág. 04

3.2.

  • Método

Pág. 04

04.

Resultados e Discussões

Pág. 05

05.

Conclusão

Pág. 07

06.

Referências

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  1. INTRODUÇÃO

A observação de microrganismos reveste-se de dificuldades não só devido à sua reduzida dimensão mas, também, porque estes são transparentes e praticamente incolores. Com o propósito de estudar as suas propriedades e/ou de diferenciar os microrganismos em grupos específicos para fins taxonômicos e de diagnóstico, recorre-se normalmente a técnicas de coloração.

A coloração de Gram, desenvolvida em 1884 pelo médico dinamarquês Christian Gram, é um dos métodos de coloração mais aplicados em Bacteriologia. Trata-se de um método de coloração diferencial, dado que permite dividir as bactérias em duas classes - Gram negativas e Gram positivas. É, pois uma ferramenta essencial na classificação e diferenciação de bactérias.

Esta diferenciação baseia-se na diferente estrutura e composição, nomeadamente no diferente teor lipídico, da parede celular de bactérias Gram positivas e Gram negativas.

A parede celular das bactérias Gram negativas tem um teor em lípidos elevado na sua membrana externa, para além de uma camada fina de peptidoglicano que circunda a membrana plasmática. Em consequência, durante o passo de diferenciação pelo álcool, parte dos lípidos é dissolvido pelo álcool, formando-se poros na parede por onde o corante primário (violeta de cristal) sai das células. Estas células ficam transparentes após o passo de diferenciação pelo álcool, sendo posteriormente coradas com o corante secundário (safranina).

A parede celular das bactérias Gram positivas é constituída principalmente por uma camada grossa de peptidoglicano e o seu teor em lípidos é nulo ou muito baixo (em poucas espécies bacterianas). A camada de peptidoglicano atua, assim, como uma barreira impedindo a saída do corante primário e estas células ficam coradas de violeta escuro.

O método de Gram é uma das mais importantes técnicas de coloração em microbiologia médica. Porém, os resultados da coloração de Gram não são universalmente aplicáveis, pois algumas células bacteriana coram-se fracamente ou não adquirem cor. A reação Gram é mais consistente quando usada em bactérias jovens, em crescimento.

A reação de Gram de uma bactéria pode fornecer informações valiosas para o tratamento da doença. As bactérias gram-positivas tendem a ser mortas facilmente por penicilinas e cefalosporinas. As bactérias gram-negativas geralmente são mais resistentes, pois os antibióticos não podem penetrar na camada de lipopolissacarídeo. Parte da resistência a estes antibióticos entre ambas a bactérias gram-positivas e gram-negativas é devida a inativação bacteriana dos antibióticos.

  1. OBJETIVO

1) Evidenciar características morfológicas das bactérias, classificando-as em gram-positivas e gram-negativas

  1. METODOLOGIA

Materias

Lâminas para microscopia

Óleo de imersão

Lamínulas

Microscópio

Alça de platina

Bico de Bunsen

Tubo contendo solução água esterilizada

Corante: Cristal de violeta

Bactéria gram-positiva:

Lugol

  1. Estafilococcus aureus

Safranina

  1. Staphylococcus saprophyticus

Álcool 95%

Bactéria gram-negativa:

  1. Escherichia coli

Gaze

Pisseta água destilada

Métodos

1)Esfregaço da cultura bacteriana líquida:

Flambou-se a alça de platina, resfriou-se em um tubo com água esterilizada. A partir daí todo procedimento foi realizado próximo da chama do bico de bunsen. Em seguida, retirou-se uma amostra da cultura com a alça e foi depositado no centro da lâmina, onde esse material foi espalhado com a alça em movimentos circulares em um só sentido, obtendo-se assim um esfregaço de forma oval, uniforme e fino. Após fixou-se o esfregaço passando a lâmina na chama do bico de bunsen, como se cortando a chama 3 vezes, para que o material fique bem aderido.

2)Esfregaço da cultura bacteriana sólida:

Flambou-se a alça de platina, resfriou-se em um tubo com água esterilizada. A partir daí todo procedimento foi realizado próximo da chama do bico de bunsen. Em seguida, foi retirada uma gota de água estéril e depositou-se na lâmina. Foi novamente flambado a alça, resfriou-se e assim foi coletada uma amostra da cultura sólida, onde foi levada até a água depositada sobre a lâmina. Foi homogeneizado com movimentos circulares, obtendo-se um esfregaço oval, uniforme e fino. Após fixou-se o esfregaço passando a lâmina na chama do bico de bunsen, como se cortando a chama 3 vezes, para que o material fique bem aderido.

3)Adição de Corantes:

Colocou-se a lâmina com o esfregaço sobre um suporte na pia. Onde foi realizada a coloração seguindo-se a seguinte sequencia: 1- Cobriu-se a lâmina com cristal violeta(Gram I) foi deixado agir por 1minuto. 2- A lâmina foi lavada em jato fraco de água esterilizada contida na pisseta de forma corrente, dos dois lados. 3- Cobriu-se então após lavagem da lâmina com lugol (Gram II), onde foi deixado agir por 1 minuto e depois foi lavada novamente a lâmina no mesmo procedimento anterior. 5- Cobriu-se a lâmina com álcool (Gram III), e esperou-se 20 segundos e lavou-se bem a lâmina. 6- Cobriu-se a lâmina com safranina (Gram IV) e foi deixado agir por 30 segundos, e, novamente lavou-se a lâmina. Após a lâmina foi secada do lado oposto ao esfregaço com uma gaze e, em seguida levada ao microscópio, onde foi primeiro observada na objetiva de 10x para se ter uma visão se tem esfregaço ou não. E depois de observada na objetiva de imersão.

Observações:

É fundamental que o esfregaço fique totalmente coberto com cada um dos reagentes e que o reagente anterior seja completamente removido antes de se adicionar o seguinte.

* Este é o passo fundamental da técnica pois:

- se deixarmos atuar o descorante tempo demais este vai retirar o corante a bactérias que deviam ficar coradas de cristal de violeta, ou seja, faz com que as células Gram positivo apareçam como Gram negativo.

- se o descorante atuar tempo a menos não se remove completamente os complexos formados entre o corante primário e o mordente e assim aparecem coradas de violeta bactérias Gram negativo às quais o descorante não conseguiu retirar convenientemente o corante primário.

  1. RESULTADO E DISCUSSÕES

  1. Lâmina da bactéria Estaphylococcus epidermidis

Sua cepa macroscopicamente apresenta uma coloração violeta.

Microscopicamente observada depois da coloração de gram, apresentou bacilos vermelhos, indicando assim uma contaminação.

  1. Estafilococcus aureus e Staphylococcus saprophyticus: Cocos que apresentaram contaminação por bacilos

  1. Escherichia coli : A lâmina microscopicamente apresentou bacilos pequenos vermelhos, mas também bacilos grandes violetas, indicando uma cepa com contaminação.

Meio Sólido

2. Resultados obtidos com a Coloração de Gram.

Bactéria

SOLUÇÃO

Gram positiva

Gram negativa

Cristal violeta

Cora de violeta

Cora de violeta

Lugol

Permanece Violeta

Permanece Violeta

Álcool

Permanece Violeta

Torna-se INCOLOR

Safranina

Permanece Violeta

Tinge de Vermelho

1) corante primário: violeta de cristal

É o primeiro a ser usado e cora todas as células de violeta.

2) mordente: lugol - solução de iodo

Este reagente é uma substância que forma um complexo insolúvel ligando-se ao corante primário. O complexo resultante serve para intensificar a cor do corante, ou seja, o lugol ajuda o cristal de violeta a penetrar nas células e a resistir à descoloração. Nas bactérias Gram positivo este complexo é mais difícil de ser removido do que nas bactérias Gram negativo.

3) descorante: álcool etílico a 95 %

Este reagente serve de solvente de lípidos e de agente desidratante das proteínas. Assim, a sua ação é determinada pela concentração lipídica das paredes celulares microbianas.

Nas células Gram positivo a concentração baixa de lípidos é importante para reter o complexo corante-mordente. Os lipidos são dissolvidos pela ação do álcool causando a formação de pequenos poros na parede celular. Mas estes são prontamente fechados pela ação desidratadora do álcool e como consequência o corante primário é difícil de ser removido e as células mantêm-se violetas.

Nas células Gram negativo a alta concentração de lipidos na membrana externa da parede celular é dissolvida pelo álcool, formando-se grandes poros na parede celular que não fecham apreciavelmente durante a desidratação das proteínas da parede celular. Isto facilita a libertação do complexo corante-mordente deixando as células incolores.

4) corante de contraste: safranina

Este é o último reagente a ser aplicado e cora de vermelho as células que foram previamente descoradas. Uma vez que as células Gram negativo ficaram descoradas elas podem agora absorver o corante de contraste. As células Gram positivo mantêm a cor do corante primário.

  • A diferença na coloração das bactérias Gram positivo e Gram negativo deve-se à resistência à descoloração pelo álcool:

  • Bactérias Gram positivo: são aquelas que retêm o corante inicial e aparecem coradas de violeta.

  • Bactérias Gram negativo: são aquelas que perdem o corante inicial quando lavadas com o álcool 95% e depois coram de vermelho com o corante de contrate.

  • Culturas Velhas:

À medida que as células envelhecem, especialmente no caso das células Gram positivo, os microrganismos tendem a perder a capacidade de retenção do corante primário e podem surgir como Gram variáveis: umas células coram de violeta (Gram positivo) e outras de vermelho (Gram negativo).

  1. CONCLUSÃO

Ficou observado nos esfregaços que foram preparados que as bactérias do tipo gram-negativas adquiriram uma coloração aproximada do róseo e vermelho, efeito esse relacionado com a composição de sua parede celular.

Já as bactérias que assumiram uma coloração mais violeta ou azul, caracterizaram as bactérias ditas gram-positivas, cuja característica da parede celular foi decisiva para esse efeito dos corantes na colônia. Ou seja, as gram-negativas possuem mais lipídeos em sua composição, e são mais permeáveis, por ter menos peptidioglicanos. Assim, quando aplicamos o álcool 95%, os lipídeos de sua parede celular são dissolvidos, perdendo-se a coloração violeta do cristal violeta. Aplicando-se safranina, de cor avermelhada, a bactéria gram-negativa adquire a coloração desta substância. Já as bactérias gram-positivas, têm menos lipídeos em sua parede celular e possuem uma camada muito mais espessa de peptidioglicanos, sendo assim menos susceptíveis de dissolução ou permeabilidade ao álcool 95%. Portanto, ela permanece com a coloração fornecida pelo cristal violeta: violeta. Sendo que o lugol apenas permite a melhor visualização do cristal violeta.

O que fica bastante evidenciado nessa prática é que a técnica de detecção de gram é absolutamente importante para determinarmos as características iniciais da bactéria, nos permitindo domar melhor as potencialidades da bactéria e junto de outros testes nos possibilitando indicar melhor tratamento para o combate da colônia.

  1. REFERÊNCIAS

FILHO, G. N. S., Microbiologia. Manual de aulas práticas. Ed.Da UFSC, 2004

TORTORA, G. J., FUNKE, B. R., CASE, C. L.. Microbiologia. 8ed. Porto Alegre –Artmed,2005.

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