Um arquivo sobre testes com inibição enzimática
Urease
EC 3.5.1.5, uréia amidohidrolase
Uréia + H2O + 2H+ → CO2 + 2 NH4+
Níquel-contendo enzima. A liberação de amônia pode ser determinada com o auxílio de um pH estator medido espectrofotometricamente por um ensaio com o sistema acoplado de reação gutamato desidrogenase.
pH ensaio stat
Solução ensaio
0.2 M uréia (Mr= 60.0; 1.2 g em 100 mL H2O,ajustar pH em 6.1)
0.1 M HCl, solução padrão uréase ( 1 mg mL -1)
Procedimento
9 mL 0.2 M uréia
0.2 mL uréase
A bureta automática é preenchido com 0,1 N HCl e que o pH seja mantido em 6,1 até o pH stat. O volume por altura do titulante adicionado pela auto-titrator por cerca de 10 min é gravado.
Ensaio fotométrico
Uréia + H2O + 2H+ → CO2 + 2 NH4+
2 NH4+ + 2 α-oxoglutarato 2 Glu + 2 NAD+ + 2 H2O
Solução Ensaio
M fosfato de potássio, pH 7.6
2.0 M uréia (Mr= 60.0; 12 g em 100 mL 0.1 M fosfato de potássio pH 7.6)
25 mM ADP (sal de sódio, Mr = 471.2, 118 mg em 10 mL 0.1 M fosfato de Potássio,pH 7.6)
10 mM NADH (sal de sódio, Mr = 709.4; 71 mg em 10 mL 0.1 M fosfato de potássio, pH 7.6)
0.1 M α-oxoglutarato (sla de monossódio, Mr= 168.1; 168 mg em 10 mL 0.1 M fosfato de potássio, pH 7.6)
desidrogenase glutamato de fígado bovino (GluDH, 500 U mL-1 em 0.1 M fosfato de potássio,pH 7.6)
uréase (cerca de 1 mg mL-1,diluído em cerca de 0.1 U mL-1 em 0.1 M fosfato potássio, pH 7.6 antes de usar)
Ensaio mistura Concentrações
8.6 mL 0.1 M fosfato de potássio, pH 7.6 86mM
0.3 mL 25mM ADP 0.75 mM
0.2 mL 10 mM NADH 0.2 mM
0.1 mL 0.1 M α-oxoglutarato 1.0 mM
0.3 mL 2.0 M uréia 60 mM
0.3 mL GluDH 15 U mL-1
Procedimentos
0.98 mL de ensaio mistura
0.02 mL urease
Record de absorbância diminui para 340nm, 25°C, ε340= 6.3 X 103 L mol-1 cm-1
Referências
Sumner, J. B. (1926) J. Biol. Chem.69, 435-441
Sumner, J. b., Hand, D.B.(1928) J. Biol. Chem.76, 149-162
Varner, J.E. (1960) The Enzymes, 2nd edn, Boyer, P.D., Lardy, H.m, Myrbäck, K. (eds) vol 4, pp. 247-256, Academic Press, New York