urease

urease

Urease

EC 3.5.1.5, uréia amidohidrolase

Uréia + H2O + 2H+ → CO2 + 2 NH4+

Níquel-contendo enzima. A liberação de amônia pode ser determinada com o auxílio de um pH estator medido espectrofotometricamente por um ensaio com o sistema acoplado de reação gutamato desidrogenase.

  1. pH ensaio stat

Solução ensaio

0.2 M uréia (Mr= 60.0; 1.2 g em 100 mL H2O,ajustar pH em 6.1)

0.1 M HCl, solução padrão uréase ( 1 mg mL -1)

Procedimento

9 mL 0.2 M uréia

0.2 mL uréase

A bureta automática é preenchido com 0,1 N HCl e que o pH seja mantido em 6,1 até o pH stat. O volume por altura do titulante adicionado pela auto-titrator por cerca de 10 min é gravado.

  1. Ensaio fotométrico

Uréia + H2O + 2H+ → CO2 + 2 NH4+

2 NH4+ + 2 α-oxoglutarato 2 Glu + 2 NAD+ + 2 H2O

Solução Ensaio

    1. M fosfato de potássio, pH 7.6

2.0 M uréia (Mr= 60.0; 12 g em 100 mL 0.1 M fosfato de potássio pH 7.6)

25 mM ADP (sal de sódio, Mr = 471.2, 118 mg em 10 mL 0.1 M fosfato de Potássio,pH 7.6)

10 mM NADH (sal de sódio, Mr = 709.4; 71 mg em 10 mL 0.1 M fosfato de potássio, pH 7.6)

0.1 M α-oxoglutarato (sla de monossódio, Mr= 168.1; 168 mg em 10 mL 0.1 M fosfato de potássio, pH 7.6)

desidrogenase glutamato de fígado bovino (GluDH, 500 U mL-1 em 0.1 M fosfato de potássio,pH 7.6)

uréase (cerca de 1 mg mL-1,diluído em cerca de 0.1 U mL-1 em 0.1 M fosfato potássio, pH 7.6 antes de usar)

Ensaio mistura Concentrações

8.6 mL 0.1 M fosfato de potássio, pH 7.6 86mM

0.3 mL 25mM ADP 0.75 mM

0.2 mL 10 mM NADH 0.2 mM

0.1 mL 0.1 M α-oxoglutarato 1.0 mM

0.3 mL 2.0 M uréia 60 mM

0.3 mL GluDH 15 U mL-1

Procedimentos

0.98 mL de ensaio mistura

0.02 mL urease

Record de absorbância diminui para 340nm, 25°C, ε340= 6.3 X 103 L mol-1 cm-1

Referências

Sumner, J. B. (1926) J. Biol. Chem.69, 435-441

Sumner, J. b., Hand, D.B.(1928) J. Biol. Chem.76, 149-162

Varner, J.E. (1960) The Enzymes, 2nd edn, Boyer, P.D., Lardy, H.m, Myrbäck, K. (eds) vol 4, pp. 247-256, Academic Press, New York

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