urease

Urease

EC 3.5.1.5, uréia amidohidrolase

Uréia + H₂O + 2H⁺ → CO₂ + 2 NH₄⁺

Níquel-contendo enzima. A liberação de amônia pode ser determinada com o auxílio de um pH estator medido espectrofotometricamente por um ensaio com o sistema acoplado de reação gutamato desidrogenase.

1. pH ensaio stat

Solução ensaio

0.2 M uréia (M_r= 60.0; 1.2 g em 100 mL H₂O,ajustar pH em 6.1)

0.1 M HCl, solução padrão uréase ( 1 mg mL ^-1)

Procedimento

9 mL 0.2 M uréia

0.2 mL uréase

A bureta automática é preenchido com 0,1 N HCl e que o pH seja mantido em 6,1 até o pH stat. O volume por altura do titulante adicionado pela auto-titrator por cerca de 10 min é gravado.

1. Ensaio fotométrico

Uréia + H₂O + 2H⁺ → CO₂ + 2 NH₄⁺

2 NH₄⁺ + 2 α-oxoglutarato 2 Glu + 2 NAD⁺ + 2 H₂O

Solução Ensaio

1. M fosfato de potássio, pH 7.6

2.0 M uréia (M_r= 60.0; 12 g em 100 mL 0.1 M fosfato de potássio pH 7.6)

25 mM ADP (sal de sódio, M_r = 471.2, 118 mg em 10 mL 0.1 M fosfato de Potássio,pH 7.6)

10 mM NADH (sal de sódio, M_{r =} 709.4; 71 mg em 10 mL 0.1 M fosfato de potássio, pH 7.6)

0.1 M α-oxoglutarato (sla de monossódio, M_r= 168.1; 168 mg em 10 mL 0.1 M fosfato de potássio, pH 7.6)

desidrogenase glutamato de fígado bovino (GluDH, 500 U mL^-1 em 0.1 M fosfato de potássio,pH 7.6)

uréase (cerca de 1 mg mL^-1,diluído em cerca de 0.1 U mL^-1 em 0.1 M fosfato potássio, pH 7.6 antes de usar)

Ensaio mistura Concentrações

8.6 mL 0.1 M fosfato de potássio, pH 7.6 86mM

0.3 mL 25mM ADP 0.75 mM

0.2 mL 10 mM NADH 0.2 mM

0.1 mL 0.1 M α-oxoglutarato 1.0 mM

0.3 mL 2.0 M uréia 60 mM

0.3 mL GluDH 15 U mL^-1

Procedimentos

0.98 mL de ensaio mistura

0.02 mL urease

Record de absorbância diminui para 340nm, 25°C, ε₃₄₀= 6.3 X 10³ L mol^-1 cm^-1

Referências

Sumner, J. B. (1926) J. Biol. Chem.69, 435-441

Sumner, J. b., Hand, D.B.(1928) J. Biol. Chem.76, 149-162

Varner, J.E. (1960) The Enzymes, 2nd edn, Boyer, P.D., Lardy, H.m, Myrbäck, K. (eds) vol 4, pp. 247-256, Academic Press, New York