Identificação de Bactérias

Identificação de Bactérias

Identificação de Bactérias

  • Microbiologia Clínica

Associação de métodos

  • Diferentes espécies podem apresentar morfologia e metabolismo idênticos. Assim, a identificação requer a observação de um conjunto complexo de características:

  • Morfologia celular: dimensões, forma, arranjos, comportamento tintorial, estruturas e mobilidade.

  • Características culturais: formas de crescimento das colônias em diferentes meios (meio em placas, meio inclinado, meio líquido, gelatina), odor.

  • Ecologia: hábitat, proveniência, condições ambientais, patogenicidade, hospedeiros, resistência.

  • Genética: sequência de genes específicos.

  • Fisiologia: exigências nutritivas, fontes de carbono e nitrogênio, fatores de crescimento

Primeiros procedimentos

  • Observar características morfológicas:

  • Meio de cultura líquido

    • Preparar lâmina a fresco – Motilidade
    • Preparar lâmina corada (Gram) – forma, arranjos, esporos
  • Estriar as bactérias em placas com ágar-nutriente

    • observar morfologia das colônias (cor, formato, tamanho, bordas, textura, elevação)

Cultura em placa

Coloração de Gram

  • É a mais utilizada

  • Permite visualizar a forma, os arranjos, presença de esporos e saber qual é o tipo de parede da bactéria

Coloração BAAR

  • Visualização de bacilos álcool-ácido-resistentes.

  • Coram fracamente pelo gram

  • Circundados por uma parede celular hidrofóbica contendo ácido micólico

  • Resistem a descoloração

  • Misturas de álcool-ácido usadas na identificação

Coloração de esporos

  • Verde malaquita  corante primário;

  • Lavagem;

  • Fucsina (safranina) cora o restante da bactéria;

  • Bactéria  verde e rosa;

Provas Bioquímicas

  • As bactérias podem ser identificadas por características do seu metabolismo, como a capacidade de degradar determinados substratos e produzir gases.

  • As provas bioquímicas utilizam meios de cultura e reagentes específicos para detectar metabólitos resultantes da atividade bacteriana, auxiliando na sua identificação.

  • As provas mais conhecidas são:

    • Utilização de fontes de carbono
    • Utilização de fontes de nitrogênio
    • Produção de enzimas
    • Motilidade

Motilidade

  • A motilidade é observada através do aspecto do meio.

  • Utiliza-se um meio semi-sólido o que permite o crescimento bacteriano no interior do meio, por todo o tubo.

  • Se a bactéria for móvel (motilidade positiva), o aspecto do meio será turvo

  • Se a bactéria for imóvel (motilidade negativa), o crescimento só será observado no local de inoculação.

  • Dica: observar os tubos contra uma folha de papel pautado, se conseguir observar as linhas através do tubo é motilidade negativa.

Catalase

  • Algumas bactérias são capazes de produzir a enzima catalase.

  • Decompõe o peróxido de hidrogênio (H2O2) liberando água e oxigênio molecular (O2) – produção de bolhas.

  • 2 H2O2 → 2 H2O + O2

  • Coloca-se uma gota da cultura líquida em uma lâmina e deposita-se sobre ela uma gota de peróxido de hidrogênio a 3%.

  • O peróxido de hidrogênio pode ser gotejado diretamente sobre uma cultura em placa.

  • Distinção entre Staphylococcus e Streptococcus

Oxidase

  • As bactérias que produzem a enzima oxidase apresentam um sistema de transporte de elétrons denominado sistema citocromo oxidase.

  • Neste sistema, os aceptores eletrônicos naturais podem ser substituídos por substratos artificiais.

  • Na presença de oxigênio atmosférico, são oxidados pela citocromo oxidase, formando um composto colorido.

  • A determinação da oxidase é um teste diferencial importante na identificação de bactérias Gram negativas.

Hidrólise da gelatina

  • Determina a habilidade do microrganismo de produzir enzimas proteolíticas (gelatinases) que liquefazem/hidrolisam gelatina;

  • Identificar e classificar bactérias fermentadoras, não fermentadoras e bacilos Gram positivos esporulados.

Vermelho de Metila (VM)

  • Avalia se as bactérias produzem ácidos a partir da fermentação da glicose pela via ácida mista.

  • Podem ser produzidos: ácido fórmico, lático, acético, provocando redução do pH abaixo de 4,4 ( viragem do indicador).

  • Todas as enterobactérias fermentam glicose.

  • Porém, algumas, durante a fase final de incubação, convertem esses ácidos a produtos não ácidos como o etanol e a acetoína, resultando num pH mais elevado (pH 6).

  • O indicador de pH é o vermelho de metila

    • pH abaixo de 4,4 é vermelho
    • acima de 6 é amarelo

Voges Proskauer (VP)

  • Há bactérias que utilizam a fermentação butilenoglicólica.

  • Fermentam a glicose produzindo acetil-metil-carbinol (acetoína), butilenoglicol e pequenas quantidades de ácidos.

  • Quando KOH é adicionado, e na presença de O2 atmosférico, a acetoína é oxidada a diacetil.

  • A adição de alfa-naftol nesta reação catalisa a produção de um anel vermelho tijolo, após 10-15 minutos.

Hidrólise do Amido

  • Amido - polissacarídeo - alto peso molecular.

  • Para ser transportado para o interior da célula e ser utilizado - quebra em unidades menores.

  • A habilidade para hidrolisar esse polímero depende da produção e secreção de várias amilases.

  • A quebra do amido é detectada utilizando-se culturas em ágar amido que são cobertas com uma solução de iodo.

  • O iodo reage com o amido para formar um complexo azul escuro.

  • As colônias que podem hidrolisar o amido apresentarão uma zona clara a seu redor.

Citrato

  • Determina se a bactéria é capaz de utilizar o citrato de sódio como única fonte de carbono para crescer.

  • Deve ser utilizado o meio Citrato de Simmons, contendo citrato de sódio, fosfato de amônia e azul de bromotimol.

  • Com a facilidade do transporte de citrato pela citrato-permease há a sua utilização pela citrase, com produção de hidróxido de amônia que eleva o pH, fazendo com que a reação se torne azul.

  • Nesse teste, utilizam-se tubos com meio inclinado para a cultura ter mais acesso ao oxigênio, que é necessário para utilização do citrato.

  • O CO2 produzido reage com o sódio do citrato formando carbonatos de reação alcalina.

Malonato (FM)

  • Determina a capacidade de uma bactéria de utilizar malonato como única fonte de carbono, alcalinizando o meio.

  • O malonato liga-se competitivamente à desidrogenase succínica, impedindo sua ação catalítica sobre o ácido succínico.

  • Interrompe o Ciclo de Krebs, tirando da bactéria sua principal fonte de energia e impedindo a formação de outros intermediários necessários ao metabolismo.

  • Indicador azul de bromotimol.

Fermentação de açúcares

  • Um determinado carboidrato pode ser fermentado originando diferentes produtos finais, o que depende do microrganismo envolvido.

  • Geração de gases

    • Em meio líquido - presença de bolhas no tubo de Durham
    • Em meio sólido – quebra ou deslocamento do meio de cultura
  • Geração de ácidos orgânicos

    • Podem ser detectados pela mudança de cor do indicador
  • Diferenciar bacilos Gram negativos com base na fermentação de carboidratos, produção de sulfato de hidrogênio e gás.

Produção de H2S

  • Algumas bactérias são capazes de degradar compostos contendo enxofre através da tiossulfato redutase.

  • Ocorre a produção de H2S que é incolor.

  • O H2S reage com o ferro (indicador) formando um precipitado preto (sulfeto ferroso).

  • Para que esta reação ocorra é necessário que o meio esteja ácido.

Fenilalanina

  • Há bactérias que produzem enzimas que removem o grupo amina da fenilalanina presente no meio

  • Origina o ácido fenilpirúvico.

  • O ácido fenilpirúvico reage com o cloreto férrico (10%) adicionado ao meio, formando uma cor verde.

  • Diferenciar gêneros e espécies de enterobactérias.

Lisina

  • Algumas bactérias possuem a lisina descarboxilase (LDC) que atua sobre a porção carboxila dos aminoácidos.

  • Formam-se aminas, de reação alcalina (por ex. cadaverina), e CO2.

  • A reação ocorre preferencialmente em condições anaeróbias e ligeiramente ácidas

  • Inicialmente ocorre a utilização da glicose do meio para enriquecimento da cultura e acidificação do meio.

  • O meio contém o indicador bromocresol púrpura.

  • Nas etapas iniciais de incubação, o tubo torna-se amarelo devido à fermentação da glicose.

  • Se o aminoácido é descarboxilado o meio retorna à cor púrpura. A reação se processa em anaerobiose, podendo-se cobrir o meio com óleo mineral para agilizar o processo

Indol

  • O indol é produzido pela ação da enzima triptofanase sobre o triptofano existente no meio de cultura

  • Ocorre a produção de ácido pirúvico e amônia.

  • O indol pode ser detectado pela formação de um anel rosa (pink) na parte superior do tubo, após a adição do reativo de Erlich.

Uréia

  • Há bactérias que possuem a enzima urease - capacidade de degradar a uréia presente no meio liberando amônia, CO2 e H2O.

  • A amônia reage formando carbonato de amônia que alcaliniza o meio.

  • O indicador de pH é o vermelho de fenol, que em meio alcalino toma a coloração pink.

  • Uma coloração meio rosa é suficiente para considerar a reação positiva.

  • BGN fermentadores e não fermentadores / Staphylococcus e Haemophilus.

Redução de nitratos

  • Muitas bactérias são capazes de reduzir nitratos a nitritos.

  • Ocorre mais rapidamente em condições anaeróbias (condição em que o nitrato substitui o oxigênio como aceptor final de elétrons).

  • Adicionando-se algumas gotas dos reativos de Griess-Ilosva, o nitrito é evidenciado através da formação de um composto avermelhado.

Coagulase

  • A bactéria produz a enzima coagulase, que na presença do plasma provoca sua coagulação.

  • Prova aceita universalmente para a diferenciação do S. aureus

Meio IAL

  • Utilizado para a identificação de enterobactérias.

  • Em apenas 1 tubo é possível fazer 9 provas bioquímicas diferentes

  • Fácil manuseio, porém, interpretação difícil.

  • E. coli, Shigella, Enterobacter, Klebsiella, Providencia spp., Morganella morganii, Proteus, Salmonella, Citrobacter, Serratia, Vibrio e Não fermentadoras

Testes comerciais

  • Existem testes que são comercializados para uso laboratorial

  • Feitos em pequena escala – poupam espaço

  • Os meios vêm prontos ou desidratados – economizam tempo e material

Laminocultivo

  • Laminocultivos são estruturas, geralmente plásticas de tampa e rosca, estéreis.

  • Contêm meios de cultura que são acondicionados em lâminas com três divisões inseridas em um tubo transparente.

  • Os meios de cultivo que compõem os Laminocultivos destinam-se a propiciar o crescimento e o estudo das bactérias de interesse médico.

  • Ex.: laminocultivo para urocultura - Contém: ágar Cled, Citrato de Simmons e Meio I (ágar MacConkey modificado).

Antibiograma

  • Teste de sensibilidade a diversos antibióticos.

  • Deve-se espalhar o inóculo de maneira uniforme sobre a placa (grande), garantindo que nenhum espaço fique vazio.

  • Fazer o cultivo em meio líquido, padronizar e mergulhar um swab.

  • Passar o swab em todas as direções em uma placa contendo ágar Mueller Hinton.

  • Colocar os antibióticos a serem testados com o auxílio de uma pinça.

  • Esperar crescer e medir o halo de inibição.

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