Imunização e Obtenção de Soro Sanguíneo (Relatório)

Imunização e Obtenção de Soro Sanguíneo (Relatório)

IFRJ – Campus Maracanã

Coordenadoria de Biotecnologia

Disciplina: Imunologia

Turma: BM161

Professores: Rodrigo Bisaggio e Dolcydete Biscaya

Relatório de Imunologia

Imunização e Obtenção de Soro Sanguíneo

Avaliação:

Critério:

Nota:

Apresentação

Introdução

Objetivos

Material Utilizado/ Métodos

Resultados

Discussão

Conclusão

Referências Bibliográficas

Total:

Bancada: 3

Alunos: Alexandre G. Garcez

Larissa Rodrigues

Paulo Rezende

Sabrina Fausto

Práticas realizadas em 14/09, 21/09, 28/09 e 05/09 de 2010.

Rio de Janeiro, 19 de outubro de 2010.

Sumário

Introdução

Pág.: 3

Objetivos

Pág.: 5

Material Utilizado e Métodos

Pág.: 5

Resultados

Discussões

Pág.: 7

Pág.: 8

Conclusão

Pág.: 10

Referências Bibliográficas

Pág.: 10

  1. Introdução

Imunização é um conceito que aparece em casos de doenças infecciosas onde se utilizam técnicas para o aumento da resistência do individuo contra os causadores da mesma. Existem dois tipos de imunização, a passiva e a ativa.

A imunização passiva dura poucas semanas, pois se dá pela adição de anticorpos a um indivíduo, sendo que esses não foram produzidos em seu organismo, embora dure pouco, esta tem uma resposta de proteção bastante rápida e eficiente. Quando os anticorpos são colhidos do plasma sanguíneo de seres humanos recebe o nome de imunoglobulinas, mas se forem extraídos de outros animais chama-se soro. Os soros são os mais utilizados para a imunização passiva, em maioria tem uso para tratar intoxicações provocadas por venenos de animais peçonhentos ou toxinas de alguns agentes infecciosos, como o tétano. Para sua produção há uma desidratação do veneno, que provoca sua cristalização, em um processo chamado de liofilização, este veneno liofilizado então é diluído e injetado normalmente em cavalos, em várias doses controladas (hiperimunização) para que não prejudique a saúde do animal e haja uma produção satisfatória de anticorpos em seu organismo, anticorpos esses retirados com uma sangria, assim que se alcança o teor de anticorpos desejados, esta sangria retira cerca de quinze litros de sangue. O plasma sanguíneo (parte líquida do sangue) é então purificado e as hemácias do animal são devolvidas ao mesmo por uma técnica chamada plasmaferese, de modo a evitar efeitos colaterais decorrentes da sangria, e para que seja possível a utilização do mesmo posteriormente para a produção de novos soros.

Os anticorpos presentes no soro não levam a uma estimulação do nosso sistema imunológico por conta de agirem diretamente contra os agentes infecciosos, que são destruídos, portanto não se adquire uma memória imunológica para tais agentes tendo em vista que o processo não leva ao contato com os linfócitos da imunidade adquirida, não descartando o fato de que isto ocorra em simultâneo por fatores não envolvidos à imunização. A imunização passiva também ocorre de modo natural durante a amamentação onde são passados anticorpos da mãe para o filho, o que é muito importante para criança recém-nascida, que possui um sistema imunológico ainda em processo adaptativo.

A respeito da imunização ativa, há uma teórica bastante distinta. Nesta temos, por meio de vacinas, uma estimulação do sistema imunológico do individuo que a recebeu a produzir anticorpos específicos para o combate de um agente infeccioso, e mais importante ainda, a garantia de uma proteção deste organismo em contatos sucessivos com este mesmo agente, por meio da imunidade adquirida. Principalmente é chamada de imunização ativa quando ocorre naturalmente no corpo por conta da instalação de agentes que levam ao reconhecimento de linfócitos, proliferação desses, diferenciação e produção de anticorpos pelos mesmos. Porém quando se dá por forma de vacinas esta imunização pode, assim como quando ocorre naturalmente, durar por anos, e em muitos casos por toda a vida.

As vacinas costumam ser produzidas pelo próprio agente patogênico ou toxinas que pretendem combater, porém há um enfraquecimento prévio desses, sem o perigo de causar uma doença podemos ter então a estimulação do sistema imunológico por esses agentes para produção de anticorpos que os combatam.

As vacinas podem conter organismos vivos que foram atenuados por um processo laboratorial, e estes ainda possuem a capacidade de proliferação no hospedeiro para assim estimular o sistema imunológico, esta multiplicação não costuma ser capaz de causar doenças, porém por meio de prevenção e também pelos sintomas decorridos da resposta inflamatória deste, não se costuma usar vacinas desse tipo. Ainda há as vacinas inativadas em que os micro-organismos estão mortos, e portanto não se dividem, este tipo de vacina estimula muito mais uma resposta imunológica humoral, além disto esse tipo de vacina pode precisar de múltiplas doses para que façam efeito, diferentemente das vacinas com organismos vivos, também pode ser preciso uma dose de reforço como forma de manutenção desta imunidade, o intervalo entre doses pode variar e este é descoberto de forma aleatória em experimentos laboratoriais que dizem qual intervalo parece melhor para que o efeito tenha maior eficiência. Diz-se toda vacina conter imunógenos, já que estes são qualquer substância capaz de induzir uma resposta imunológica, que é o que ocorre no processo de vacinas. Serão melhores imunógenos aqueles de origem proteica ou glicídica, enquanto são considerados imunógenos ruins ácidos nucléicos e lipídeos. Quanto maior a complexidade química, o tamanho, o grau de estranheza e a capacidade de degradação do imunógeno mais imunogênico será, logo, faz-se vacinas controlando-se todos esses fatores para a eficiência da mesma.

Para que a resposta à vacina ainda tenha maior segurança há o acréscimo de adjuvantes que possam estimular também o sistema imunológico a sua resposta ao imunógeno inserido no organismo. Um adjuvante muito comum em experimentos laboratoriais é o Adjuvante de Freund, este é inserido em emulsão juntamente com o imunógeno. O Adjuvante Completo de Freund possui micobactérias inativadas embebecidas em óleo, que por ser uma substância irritante excita o sistema imunológico junto às micobactérias, além disto há um agente emulsificante para que se misture ao imunógeno desejado da vacina. Por conta das reações dolorosas no local da injeção, além das possibilidades de causar úlceras ou necrose na pele dos animais utilizados neste experimento muitos países optaram pela utilização apenas do chamado Adjuvante Incompleto de Freund que é o mesmo que o Adjuvante completo, porém sem a utilização das micobactérias. No Brasil não há proibição quanto ao uso, mas procura-se utilizar o adjuvante completo apenas na primeira dose da imunização, trocando-se pelo incompleto nas seguintes, para evitar o sofrimento do animal.

  1. Objetivos

  • Objetivos gerais:

A prática teve como objetivo obter o soro sanguíneo imunizado de quatro camundongos nos quais foram inoculadas, peritoneal ou dorsalmente, concentrações diferentes da proteína ovalbumina, havendo uma inoculação por semana durante três semanas.

  • Objetivos específicos:

Obter o soro sanguíneo de quatro camundongos após cada um deles terem sido submetidos à inoculação pela via dorsal de cerca de 10mL de proteína ovalbumina de concentração 1,0mL/L uma vez por semana, durante um período de três semanas.

  1. Material Utilizado e Métodos

  • Material Utilizado:

Materiais

▪Pinça

▪Seringa de vidro

▪Recipiente de vidro

▪Placa de Petri contendo parafina

▪Éter

▪Eterizadores

▪Algodão

▪Tubo para micro-centrífuga do tipo “eppendorf” (1,5mL)

▪Seringa descartável

▪Luvas descartáveis de látex para procedimento

▪Papel toalha

Reagentes

▪Adjuvante completo de Freund

▪Adjuvante incompleto de Freund

▪Tampão PBS pH 7,4

▪Proteína ovalbumina 100mg/mL

▪Álcool 70%

Equipamentos

▪Micro-pipeta automáticas p200 Gilson®

▪Pipetas de 1,0 e 10,0 mL

▪Micro-centrífuga

  • Métodos:

Imunizações:

Primeiramente, foi feita a diluição de fator 1:100 de uma solução de ovoalbumina cuja concentração era de 100 mg/mL em tampão PBS (pH 7,4). Para isso, foi transferido 0,03 mL desta solução e aproximadamente 2,97 mL da solução tampão para um tubo de ensaio devidamente rotulado, de modo a se obter 3,00 mL de solução de ovoalbumina à concentração de 1,0 mg/mL.

Do conteúdo do tubo de ensaio foram pipetados, com o auxílio de uma micropipeta P200, 400 μL para um recipiente de vidro. A este mesmo recipiente, adicionou-se 400 μL do adjuvante completo de Freund. Então, utilizando uma seringa de vidro formou-se, a partir do conteúdo do recipiente, uma emulsão no ponto de claras em neve.

Em seguida, utilizando uma seringa descartável, foi extraída a maior quantidade possível da emulsão, verificando o volume extraído, que não poderia ser inferior a 40 mL, e tomando os devidos cuidados para a retirada do ar da seringa.

Então, o primeiro camundongo foi levado à capela para ser anestesiado ao ser colocado em um recipiente de vidro contendo algodão embebido em éter etílico. Após a anestesia, foram inoculados através da seringa 10 mL da emulsão no dorso do animal. Este animal foi devolvido à caixa após ter o pelo marcado com ácido pícrico para evitar possíveis confusões. Isto se repetiu em outros três camundongos.

Os procedimentos relatados referem-se à primeira imunização. A segunda e terceira imunizações ocorreram de maneira bastante semelhante, sendo a única diferença em relação à primeira, a utilização do adjuvante incompleto de Freund no lugar do completo. Os animais utilizados em todas as imunizações eram os mesmos, e as imunizações e posterior obtenção do soro sanguíneo foram realizadas em intervalos de uma semana.

Sangria:

Realizadas as três imunizações, foi necessária a técnica de sangria nos quatro camundongos a fim de se obter e analisar seus soros sanguíneos. Para isso, estes animais, um de cada vez, foram submetidos à uma anestesia mais intensa ao serem deixados por mais tempo no eterizador na capela, cautelosamente para evitar a eutanásia. Em seguida, na bancada, realizou-se, com o auxílio de uma pinça, o deslocamento de um dos globos oculares, e o sangue advindo de tal deslocamento foi coletado em quatro tubos de microcentrifugação equivalentes aos quatro camundongos.

Assim, após isto, os animais foram eutanasiados a partir do deslocamento cervical e envolvidos em papel toalha para serem descartados no local designado. Além disso, a bancada e o material utilizado foram devidamente desinfectados utilizando álcool 70%.

Os tubos foram submetidos à centrifugação por dois minutos à velocidade de 14.000 rpm. Então, transferiram-se os sobrenadantes com o auxílio de uma micropipeta P200, para novos tubos, misturando àqueles com aspecto semelhante. Ao final, obtiveram-se dois tubos de microcentrifugação com os soros sanguíneos.

  1. Resultados

Com a preparação do líquido a ser injetado, obteve-se uma mistura branca leitosa de alta viscosidade.

Após injetar o preparado no dorso dos animais, era possível visualizar na semana seguinte, a formação de uma proeminência na região onde foi aplicado o líquido injetado. Assim no final das imunizações o animal já possuía alguma destas proeminências no seu dorso. Fora esta, os animais não apresentaram mais nenhuma mudança física visível.

Ao final da etapa de imunizações, a partir da sangria dos animais, obteve-se quatro tubos de micro-centrífuga do tipo “eppendorf” com sangue, o primeiro com um volume maior do que em cada um dos outros três. Houve coagulação deste sangue coletado, que após a centrifugação do material, pode-se observar a formação de duas fases, uma fase amarelada superior e uma fase vermelho escura na base do tubo.

  1. Discussão

A mistura entre o óleo adjuvante e a solução de proteínas não era termodinamicamente estável, então foi necessário energia para formá-la através de agitação. Esta emulsão foi feita para que fosse obtida uma mistura estável entre dois líquidos imiscíveis.

O adjuvante de Freund é usado como uma emulsão de água ou solução aquosa em óleo, que possui duas formas, a formulação completa e a incompleta. Sendo ele um adjuvante, ele amplifica a resposta imune desejada de um animal e é comumente utilizado em imunizações, embora este seja rejeitado em alguns países por causa dos efeitos colaterais causados ao ser aplicado e assim revoltando ativistas dos direitos dos animais.

O adjuvante completo de Freund possui dois componentes essenciais:

• Óleo mineral, que não pode ser metabolizado e, portanto garante um efeito residual.

• Mycobacterium tuberculosis inativada pelo calor que são responsáveis pela forte estimulção do sistema imune.

• A Arlacel como emulsionante para manter a estabilidade da emulsão água e óleo.

O adjuvante incompleto de Freund dispensa a adição de micobactérias e foi injetado por repetidas vezes para fortalecer (booster) a resposta imune após a primeira injeção do adjuvante completo.

O adjuvante de Freund ainda é um dos adjuvantes mais eficazes para provocar e fazer com que haja uma amplificação da resposta imune. Porém devido às discussões causadas entorno do uso deste adjuvante, há outras substancias que podem ser usadas como gel de hidróxido de alumínio, que gerarão um estresse menor sobre o animal.

As proeminências observadas no dorso dos animais eram decorrentes da parte residual do adjuvante que permanecia no local e de uma inflamação que o conteúdo injetado causa no local, o que resulta, entre outros sintomas, em um inchaço.

Injetou-se o conteúdo da seringa no dorso do animal, isto é, houve a inoculação de um conteúdo não próprio, que deve ser reconhecido pelo sistema imune do animal e, além disto, causar ativação deste sistema, o que a classificaria a amostra injetada como um imunógeno. Uma vez injetada na porção subcutânea, certamente através da circulação linfática houve o direcionamento do imunógeno para a um linfonodo ou outro órgão linfoide secundário onde de fato ocorreu a ativação, pois estes locais são especializados na captação de antígenos, sendo também um ambiente perfeito para a ativação da imunidade adquirida e um reservatório de células da imunidade.

Animais como humanos e camundongos contam com milhões de diferentes linfócitos B, por conterem diferentes constituições de BCR, cada qual capaz de responder a um antígeno específico e após ocorrer o reconhecimento, ou seja, a complementaridade entre BCR e antígeno há a ativação do linfócito B que se prolifera e se diferenciam em linfócitos B de memória e em linfócitos B efetores que têm como função secretar imunoglobulinas que são quimicamente semelhantes ao seu receptor, a resposta imunológica será mediada através destes anticorpos secretados que terão funções contra o antígeno.

Ao mesmo tempo células apresentadoras de antígeno (APC) profissionais como mastócitos, linfócitos B e células dendríticas, podem processar o antígeno e “apresentar” fragmentos deste (peptídeos) através do complexo de histocompatibilidade (MHC) de classe II para que possam ser reconhecidos pelos linfócitos T auxiliares e a partir daí estes liberam proteínas co-estimuladoras como interleucina-2, e outras proteínas que atraem fagócitos e aumentam a capacidade de fagocitose dos macrófagos para que ocorra um ataque citotóxico, ou seja, mediado por células contra o antígeno específico.

Uma vez que o sangue foi retirado sem controle de coagulação, ele tende a coagular, o sangue neste estado está com as proteínas plasmáticas de coagulação ativadas e quando submetido à centrifugação tem-se a separação das fases, a superior no caso seria o plasma sem estes fatores de coagulação, também conhecido como soro sanguíneo, e na parte inferior uma massa composta principalmente por células, eritrócitos, plaquetas e proteínas, que é descartada.

Ao comparar com o resultado dos outros grupos, pode-se perceber que a concentração pouco influenciou nos sinais visíveis que eram desenvolvidos pelos camundongos, o que mais influenciava nesse desenvolvimento de sinais era o local onde era aplicada a injeção, por exemplo, no dorso teve-se a formação das proeminências e no peritônio não ocorreu o mesmo. Mas a intensidade dessas proeminências no dorso, essas sim eram relacionadas com as concentrações aplicadas, uma vez que maior a concentração, maior a proeminência e também no caso da maior concentração foi avistado piogenia na região da aplicação.

  1. Conclusão

Após a discussão dos resultados obtidos, concluiu-se que foi possível realizar os processos básicos de inoculação de imunógenos. Todas as técnicas de segurança necessárias para a realização de tais processos foram obedecidas. No entanto não é possível avaliar se o soro sanguíneo do camundongo estava efetivamente imunizado e também não é possível comparar os soros sanguíneos obtidos depois de diferentes processos de imunização já que essas amostras foram obtidas, mas não foram analisadas.

  1. Referências Bibliográficas

Literatura:

  1. TORTORA, G. J.; GRABOWSKI, S. R. Corpo humano: fundamentos de anatomia e fisiologia – 6.ed.- Porto Alegre : Artmed, 2006PELCZAR JR., J. M.; et al. Microbiologia: conceitos e aplicações – 2.ed.- São Paulo : Pearson Education do Brasil, 1997

  2. ABBAS, A. K.; et. al. Imunologia celular e molecular – 6.ed.- Rio de Janeiro: Elsevier, 2007

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