Extração de RNA (Relatório)

Extração de RNA (Relatório)

Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Rio de Janeiro - Campus Maracanã.

Coordenação de Biotecnologia

Professores: Luiz Dione e Adriana Salgueiro.

Alunos: Alan de Lima, Alexandre Garcez, Arthur Lima, Beatriz Alexandre e Guilherme Cerqueda.

Grupo 01

Turma: BM - 161

Datas de Realização das práticas: 14/10/2010 e 21/10/2010.

Data de Entrega do Relatório: 18/11/2010

Extração de RNA

Critério:

Nota:

Apresentação

Introdução

Objetivos

Materiais

Métodos

Resultados

Discussão

Bibliografia

Total:

SUMÁRIO

INTRODUÇÃO Página 03

OBJETIVOS Página 05

MATERIAIS E MÉTODOS Página 05

RESULTADOS Página 09

DISCUSSÃO Página 09

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Página 11

  1. INTRODUÇÃO

O RNA é um polímero de nucleotídeos, geralmente em cadeia simples, onde cada nucleotídeo consiste de uma base nitrogenada, uma ribose e um grupamento fosfato. Uma molécula de RNA é muito similar a uma molécula de DNA, porém estas se diferem em importantes pontos estruturais:

  • O RNA possui a ribose no lugar da 2’-desoxirribose, o que lhe confere uma desvantagem estrutural pois torna-se menos resistente à hidrólise;

  • Tanto o DNA quanto o RNA são formados pelas purinas guanina e adenina, porém enquanto o DNA é composto pelas pirimidinas citosina e timina, o RNA é composto por citosina e uracila.

  • Diferente do DNA que, por ser dupla fita, apresenta um arranjo padrão (dupla hélice), no RNA pode ocorrer emparelhamento das bases a nível intramolecular, fazendo com que cada molécula de RNA apresente um arranjo distinto. (figura 1)

  • As moléculas de RNA, diferente do DNA, podem funcionar como importantes catalisadoras de reações biológicas, sendo estas moléculas chamadas de ribozimas.

  1. (B)

Figura 1: (A) Já que o RNA se apresenta como cadeia simples, é possível o pareamento por meio de pontes de hidrogênio entre regiões do mesmo RNA, permitindo que cada molécula de RNA adote um arranjo tridimensional distinto. (B) Estrutura tridimensional de uma molécula de RNA.

(SANTOS, Francisco Prosdocimi; CASTRO, Cibele Soares. Síntese e processamento de RNA. Disponível em: <http://www.icb.ufmg.br/prodabi/prodabi3/grupos/grupo1/rna.htm>. Acesso em 25 out. 2010.)

A função do RNA varia de acordo com a classe do RNA. Geralmente, os RNAs atuam no processamento e degradação de RNAs mensageiros e na síntese de proteínas. Os principais tipos de RNA são os RNAs mensageiros (mRNAs), os transportadores (tRNAs) e os ribossomais (rRNA). Os RNAs mensageiros são aqueles que codificam as proteínas e que devem ter seus códons lidos durante o processo de tradução. Os RNAs ribossomais fazem parte da estrutura do ribossomo, junto com diversas outras proteínas e são eles que catalisam a ligação entre dois aminoácidos na síntese de proteínas. Os RNAs transportadores são aqueles que fazem a conexão do códon com o aminoácido pois carregam um aminoácido específico de acordo com seu anticódon.

A origem da molécula de RNA se dá na transcrição da mesma, a qual consiste na síntese de RNA, aonde este processo pode ser dividido em três etapas principais: iniciação, alongamento e término. (figura 2)

Figura 2: A RNA polimerase irá reconhecer regiões com seqüências específicas do DNA chamadas regiões promotoras (TATA Box em eucariotos por exemplo), a RNA polimerase vai então desenovelar a dupla fita de DNA, formando uma bolha de transcrição. Após a formação da primeira ligação fosfodiéster e a dissociação da subunidade s, inicia-se a fase de alongamento, onde a RNA polimerase vai se deslocar no sentido 5’  3’ a fim de polimerizar RNA a partir da fita de DNA. A bolha de transcrição move-se então no sentido da polimerização realizada pela RNA polimerase, sendo o DNA desenrolado na frente e enrolado atrás, à medida que o RNA é transcrito e liberado da região híbrida RNA/DNA. A superelicoidização, provocada pela RNA polimerase durante a transcrição, pode causar problemas topológicos na célula. Esse fato pode ser contornado por topoisomerases, enzimas que catalisam o corte e o fechamento coordenados do dúplex de DNA. O final da transcrição é um processo bem controlado no qual seqüências típicas dos transcritos de RNA (sinais de término) indicam o local para a finalização da síntese dessa molécula (em bactérias por exemplo a síntese gera uma porção final instável que desestabiliza a RNA polimeraze, fazendo com que esta aborte a transcrição), causando a liberação do RNA sintetizado e da RNA polimerase. Diferente da DNA polimerase, a RNA polimerase não tem atividade de nuclease, ou seja, não revisa a cadeia de RNA sintetizado. Conseqüentemente, a fidelidade da síntese de RNA (transcrição) é bem menor que aquela observada para o DNA (replicação). Entretanto isso não caracteriza um grave problema, pois os erros cometidos na transcrição não são passados de geração a geração. Os RNAs sintetizados que, porventura, apresentarem problemas serão degradados e têm pouca probabilidade de serem prejudiciais, uma vez que outros transcritos serão rapidamente produzidos.

(SANTOS, Francisco Prosdocimi; CASTRO, Cibele Soares. Síntese e processamento de RNA. Disponível em: <http://www.icb.ufmg.br/prodabi/prodabi3/grupos/grupo1/rna.htm>. Acesso em 25 out. 2010.)

A transcrição em organismos eucarióticos é bem mais complexa que em procariotos. Nos eucariontes a transcrição ocorre no núcleo, enquanto a tradução ocorre no citoplasma. Outra diferença é que o transcrito primário de mRNA dos organismos eucarióticos, ao contrário dos procariontes, é amplamente processado, sofrendo uma série de alterações: aquisição de revestimento (cap) na sua extremidade 5’, cauda poli-A na extremidade 3’ e remoção exata de introns (splicing) para a formação de mRNAs maduros com mensagens contínuas.

  1. OBJETIVOS

Extrair RNA total da bactéria Escherichia coli e compreender a técnica realizada. Analisar a função dos reagentes utilizados e observar o comportamento do RNA extraído em eletroforese.

  1. MATERIAIS E MÉTODOS

III.I. Materiais

III.I.I. Amostra

  • Cultura bacteriana (Escherichia coli).

III.I.II. Material por grupo

  • Tubos de microcentrífuga do tipo eppendorf;

  • Pipetas automáticas (P20, P200 E P1000);

  • Caixa de tips;

  • Tubo de descarte contendo hipoclorito 1%.

III.I.III. Equipamentos

  • Microcentrífuga;

MARCA: Eppendorf

MODELO: Centrifuge 5415C

  • Centrífuga refrigerada;

MARCA: Beckman

MODELO: AvantiTM 30 centrifuge

  • Vortex;

MARCA: Vertex

MODELO: QL – 901

  • Microondas;

MARCA: Prodóscimo

  • Fonte de eletroforese;

MARCA: Pharmacia LKB

MODELO: GPS 200/400

  • Balança;

MARCA: Marte ®

  • Capela de exaustão;

MARCA: Engelab

  • Banho de gelo;

  • Cuba de eletroforese;

  • Forma de eletroforese;

  • Pente;

  • Tubo Falcon (50 mL);

  • Fita adesiva;

  • Provetas (1000 mL e 50 mL);

  • Erlenmeyer (250 mL);

  • Espátula;

  • Transiluminador.

III.I.IV. Reagentes e soluções

  • TRIZOL;

  • Clorofórmio;

  • NaCl 3M;

  • Isopropanol;

  • Etanol 70%;

  • Tampão TE (10mM Tris, 1mM EDTA);

  • Agarose;

  • Tampão TBE (Tris borato EDTA 50x);

  • Brometo de etídeo;

  • Tampão de amostra (azul de bromofenol 0,25%, xileno cianol 0,25%, ficoll 30% e tampão TE pH 8,0).

III.II.MÉTODOS

III.II.I. Extração de RNA

Transferiu-se aproximadamente 1,5 mL de cultura de Escherichia coli (crescida durante a noite em meio LB) para um tubo de microcentrífuga do tipo eppendorf, o qual foi centrifugado durante 1 minuto, a 10000 rpm. Esse procedimento foi repetido, a fim de se obter um “pellet” de aproximadamente 3,0 mL de cultura bacteriana.

O “pellet” obtido foi ressuspendido em 1,0 mL de TRIZOL e então o tubo foi incubado a temperatura ambiente (na bancada) por 5 minutos. Adicionou-se 200 μL de clorofórmio e agitou-se o tubo durante 1 minuto com auxílio do vortex, para posterior incubação a temperatura ambiente durante 2,5 minutos.

O tubo foi centrifugado durante 10 minutos a 4°C, sob ação de 12000g (equivalentes a 11583 rpm com o rotor utilizado – F2402H) e a fase aquosa (800 μL) foi transferida para um novo tubo de microcentrífuga do tipo eppendorf. Foram adicionados sequencialmente 80 μL de NaCl e 800 μL de isopropanol. Visto que o volume total não seria comportado em apenas 1 tubo, este foi dividido entre dois tubos.

Os tubos foram incubados durante 15 minutos, a uma temperatura de -20°C e então centrifugados durante 15 minutos, a 4°C, sob ação de 12000g. Os sobrenadantes foram descartados, e os "pellet's" lavados com 200µL de etanol 70%, em centrifugação durante 5 minutos a 4°C sob ação de 12000g.

Os sobrenadantes foram descartados completamente e o "pellet" ressuspendido em 30µL de TE. Nessa etapa o conteúdo dos dois tubos foi novamente unido.

III.II.II. Eletroforese

A forma do gel foi vedada com fitas adesivas, e nela foi inserido o pente que dará origem aos “slots” após a gelificação do gel na mesma, tendo-se cuidado para não permitir que este se encoste ao fundo da forma.

Para a preparação do gel precisar-se-ia de tampão TBE 1x então por conta disso, diluiu-se, numa proveta, 20mL do tampão TBE 50x com água até o volume final de 1000mL, ao qual desses foi retirado apenas 100mL servindo para a diluição de 1g de agarose que havia sido pesado.

A solução resultante desta diluição foi então transferida para um Erlenmeyer e em seguida para um forno microondas onde foi aquecida durante o tempo de 1 minuto e 20 segundos. Este aquecimento foi controlado para que a solução não entrasse em estado de fervura. Da solução homogênea obtida do aquecimento retirou-se 20mL, transferindo-os para um tubo falcon, e a ela foi adicionado, com posterior homogeneização, 2 μL de brometo de etídeo.

Este volume foi então despejado, cuidadosamente, na forma preparada ao início da prática, esperando até que alcançasse aproximadamente 5mm de espessura nesta. Foi possível observar o processo de gelificação do gel de agarose 1%, onde seu aspecto foi tornando-se turvo. Quando pronto pôde-se retirar as fitas adesivas, para então mergulhar esta forma em uma cuba de eletroforese contendo tampão TBE 1x, cuidadosamente de forma à não danificar os “slots” formados pela retirada do pente nesta etapa da prática.

Com uma micropipeta P20 pôde-se então pipetar volumes de 9 μL, por vez, da amostra de RNA e transferi-los para o gel com a ponta do tip mergulhada em um dos “slots”, de forma a ter firmeza na transferência e assim não danificar os “slots” foi preciso a utilização das duas mãos enquanto despejava-se a amostra de forma lenta.

Para o início da corrida, fechou-se o aparato de eletroforese e conectou-o com eletrodos na fonte de energia, programada para uma voltagem de __V e corrente de __mA.

Quando o corante de azul de bromofenol estava para alcançar o fim do gel desligou-se a fonte de energia, retirou-se a cuba do aparato de eletroforese para que então fossem realizados procedimentos com o gel para por fim observá-lo sob luz UV de um transiluminador.

  1. RESULTADOS

Na figura 3, observa-se o resultado da eletroforese de extração de RNA. A parte superior da figura indica o pólo negativo e a parte inferior, o pólo positivo. Todos os grupos realizaram a extração com sucesso, embora a quantidade de RNA extraído varie entre eles.

Figura 3: Foto do gel de agarose da eletroforese realizada após a extração de RNA. Estão identificados acima de cada banda do gel os grupos (G) correspondentes.

  1. DISCUSSÃO

No processo de extração de RNA, utiliza-se o TRIZOL, que é um reagente composto de fenol e guanidina isotiocianato. Ele desnatura as proteínas, lisa a parede celular e impede a ação de RNAses, mantendo a integridade do RNA. Também se adiciona clorofórmio, que é um solvente orgânico capaz de diminuir a interação das proteínas com água. Por isso, após centrifugação há formação de duas fases. O RNA se encontra na fase aquosa. A adição de um sal (NaCl) e um álcool (isopropanol) neutraliza as cargas dos grupamentos fosfatos do RNA, tornando-o mais hidrofóbico, e precipita o mesmo. A purificação do RNA se dá através da adição de etanol 70%, que remove os sais aderidos ao “pellet”.

Pode-se considerar que os resultados obtidos na extração de RNA de E. coli por todos os grupos foram satisfatórios, uma vez que o RNA correu como previsto durante o processo de eletroforese, apresentando a formação de uma banda. A eletroforese do RNA apresenta basicamente os mesmos procedimentos realizados no método de eletroforese do DNA. Foi usado o gel de agarose, um polissacarídeo que forma uma rede que segura as moléculas durante a migração. A corrida do RNA ocorre para o pólo positivo e a concentração de agarose influencia nesse processo. Foi possível observar em todos os grupos, porém principalmente nos grupos 1, 2 e 3, o ”efeito sorriso”, o qual pode ocorrer na eletroforese caso o campo elétrico não tenha sido uniformemente distribuído, gerando assim uma deformação nas laterais da banda.

No caso do grupo 4, 5 e 6, o “rastro” formado pela corrida foi maior, e isso dificulta a visualização da formação de bandas pelo RNA presente na amostra. No caso dos grupos 4 e 5, as bandas podem ser dificilmente visualizadas e no caso do grupo 6 não se observa a formação de bandas. Isso pode ter ocorrido devido à presença de moléculas de RNA que não foram desnaturadas. Assim, suas estruturas secundárias irão interferir durante a corrida, promovendo a formação do “rastro” observado.

O RNA, quando não corrido em gel desnaturante, forma um rastro durante a eletroforese, como dito anteriormente. Esse tipo de gel desnatura os RNAs, impedindo que a corrida ocorra por conformação e possibilitando a separação dos fragmentos por tamanho. Na prática, se utilizou um gel normal, de agarose 1%. Havendo a presença de estruturas secundárias, se explica a formação de um borrão.

É provável que não tenha ocorrido uma grande ação de ribonucleases (RNAses), o que poderia ter diminuído drasticamente a concentração de RNA na amostra, podendo assim impossibilitar a visualização de RNA na corrida. As RNAses são motivo de grande preocupação, porque além de possuírem a capacidade de degradação de moléculas de RNA em diferente locais, como por exemplo vidraria e outros materiais utilizados na prática, elas são resistentes à vários tratamentos, inclusive térmicos (fervura, autoclavagem etc.). De forma a diminuir a contaminação com RNAses das soluções, equipamentos, vidrarias e reagentes é importante o uso de DEPC (dietilpirocarbonato) para tratar dos materiais.

  1. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

  • ALBERTS, B.: Molecular Biology of the Cell, 4° edição, 2002 (3ª edição 2006). Garlang Science, New York.

LIEDKE, Ana. Fundamentos de extração de DNA e RNA. Disponível em: <http://www.ebah.com.br/fundamentos-extracao-dna-e-rna-pdf-a55016.html>. Acesso em 01 Nov. 2010.

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