Relatório Final de Estágio - Hipertensão Arterial Resistente (Gene NAT2)

Relatório Final de Estágio - Hipertensão Arterial Resistente (Gene NAT2)

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I. INTRODUÇÃO

O termo biotecnologia, inicialmente utilizado em indústrias de processamento de alimentos e agroindústrias, começou a ser utilizado por estabelecimentos científicos do Ocidente para descrever técnicas laboratoriais inerentes ao desenvolvimento de pesquisas biológicas. A biotecnologia pode então ser definida como “a aplicação de conhecimento nativo ou científico para a manipulação de (partes de) microrganismos, ou células e tecidos de organismos superiores, para que estes forneçam bens e serviços úteis aos seres humanos” (BUNDERS, 1996, p.1).

Segundo o artigo 2 da convenção sobre diversidade biológica (ONU, 1992), a biotecnologia diz respeito a todo tipo de aplicação tecnológica que faça uso de sistemas biológicos e seus derivados para produzir ou então modificar produtos e processos com utilização específica.

Levando em consideração as definições expostas, é possível observar que a biotecnologia se caracteriza como um campo que abrange diferentes áreas de conhecimento, que são interligadas e assim fornecem um trabalho multidisciplinar com amplas aplicações. O esquema abaixo, construído com base na obra Biotecnologia Industrial (BORZANI, 2001), representa a interação de áreas de ciência e tecnologia envolvidas na biotecnologia.

Figura 1.1: Interação entre as áreas de ciência e tecnologia envolvidas na biotecnologia

Dentre as áreas de conhecimento que fazem parte da biotecnologia, é importante destacar a ciência da biologia molecular. As descobertas e avanços tecnológicos nesta área de conhecimento forneceram uma nova visão a respeito da vida e no estudo de doenças.

A hipertensão arterial, um quadro caracterizado pela pressão arterial maior ou igual 140 x 90 mmHg é o fator de risco mais comum das doenças cardiovasculares, acidente vascular cerebral (AVC) e doenças renais (CHOCKALINGAM, 2007). Trata-se de uma doença sistêmica que evolui provocando remodelação cardíaca e vascular, acometendo progressivamente órgãos-alvos, como o cérebro, coração, rins e as artérias de grande diâmetro. Segundo Kearney et al (2005), estima-se que uma em cada seis pessoas no mundo é afetada pelo aumento da pressão arterial, totalizando um bilhão de indivíduos afetados em todo o planeta. Esta estimativa sugere um aumento de 1,5 bilhões de pessoas até o ano de 2025. De acordo com dados da organização mundial da Saúde (OMS, 2007), mais de 50% da população mundial é afetada por doenças cardiovasculares. Os indivíduos afetados são das mais diferentes classes sociais, faixas etárias, gênero e grau de instrução, de área rural ou área urbana. A principal causa das doenças cardiovasculares é a hipertensão arterial. No Brasil, 37% dos óbitos no ano de 2003 foram causados por doenças cardiovasculares, quando excluídos os casos de óbito por causas mal definidas e causas externas.

Inicialmente, a hipertensão arterial é assintomática, sendo diagnosticada somente quando ocorrem complicações que se manifestam clinicamente pela perda da qualidade de vida dos indivíduos.

Existem diferentes fatores de risco envolvidos numa maior propensão do indivíduo à desenvolver um quadro de hipertensão arterial. Fatores ambientais como a ingestão de sal, obesidade, atividade profissional, estilo sedentário de vida e ingestão de álcool estão envolvidos no desenvolvimento da hipertensão. Em paralelo, fatores genéticos são considerados importantes no surgimento da hipertensão arterial. Dados da literatura baseados em estudos com modelos animais e estudos populacionais com humanos confirmam a hipótese de herança multifatorial e devido à uma série de defeitos genéticos (VASAN et al, 2001).

De acordo com as Diretrizes Brasileiras de Hipertensão Arterial (2008), a medição da pressão arterial é o elemento-chave quando se deseja estabelecer o diagnóstico da hipertensão arterial e avaliar a eficácia do tratamento direcionado para o combate da hipertensão arterial. Logo, observa-se a necessidade de precisão nesta medição de pressão arterial para classificar adequadamente os indivíduos que merecem tratamento para hipertensão. No quadro abaixo, encontra-se a classificação dos indivíduos de acordo com a pressão arterial.

Quadro 1.1: Classificação dos indivíduos de acordo com a pressão arterial (Adaptado de V Diretrizes de Hipertensão Arterial, 2007)

Classificação

Pressão sistólica (mmHg)

Pressão diastólica (mmHg)

Ótima

< 120

< 80

Normal

< 130

< 85

Limítrofe

130-139

85-89

Hipertensão estágio 1

140-159

90-99

Hipertensão estágio 2

160-179

100-109

Hipertensão estágio 3

≥ 180

≥ 110

Hipertensão sistólica isolada

≥ 140

< 90

É possível ainda estratificar o risco individual de cada paciente de hipertenso conforme os fatores de risco por ele apresentados e pelo seu estágio de hipertensão classificado segundo a medida da pressão arterial.

Quadro 1.2: Estratificação de risco individual dos pacientes hipertensos (Adaptado de V Diretrizes de Hipertensão Arterial, 2007)

Fatores de risco

Pressão Arterial

 

Normal

Limítrofe

Hipertensão estágio1

Hipertensão estágio 2

Hipertensão estágio 3

Sem fator de risco

Sem risco adicional

Risco baixo

Risco médio

Risco alto

1 a 2 fatores de risco

Risco baixo

Risco baixo

Risco médio

Risco médio

Risco muito alto

3 ou mais fatores de risco ou lesão de órgãos-alvo ou diabetes melito

Risco médio

Risco alto

Risco alto

Risco alto

Risco muito alto

Doença cardiovascular

Risco alto

Risco muito alto

Risco muito alto

Risco muito alto

Risco muito alto

O tratamento contra a hipertensão arterial tem como objetivo básico a redução da morbidade e da mortalidade por doenças cardiovasculares (KANEL 1995, PADWAL et al 2001). As diretrizes brasileiras de Hipertensão Arterial segmentam o tratamento em 2 formas principais: um tratamento não-medicamentoso e um tratamento medicamentoso. Quanto ao tratamento não-medicamentoso, estão incluídas medidas como o controle de peso através de restrição de ingestão calórica e aumento da atividade física, uma reeducação alimentar visando a diminuição da ingestão de gordura, a redução do consumo de sal, moderação do consumo de bebidas alcoólicas e abandono do tabagismo. Quanto ao tratamento medicamentoso, existem diferentes classes de anti-hipertensivos empregados para combate da hipertensão arterial. De acordo com o estágio de hipertensão do indivíduo e seu grau de risco, um esquema terapêutico em monoterapia ou com associação de medicamentos é inicialmente indicado. Pacientes no estágio 1 de hipertensão arterial são submetidos a esquema de monoterapia quando as ações não-medicamentosas são ineficientes, enquanto pacientes em estágio 2 e 3 de hipertensão arterial podem ser submetidos ao uso inicial de associações de medicamentos. Qualquer classe de anti-hipertensivo pode ser utilizada para tratamento dos pacientes hipertensivos.

Os medicamentos utilizados como anti-hipertensivos são divididos em diferentes classes, de acordo com seu princípio de ação e seus alvos. As principais classes de anti-hipertensivos são: diuréticos, beta-bloqueadores, inibidores da enzima conversora de angiotensina (ECA), bloqueadores dos canais de cálcio, bloqueadores do receptor AT1 e vasodilatores diretos.

O quadro abaixo resume os esquemas terapêuticos empregados para o tratamento da hipertensão.

Quadro 1.3: Esquemas terapêuticos para o tratamento medicamentoso da hipertensão arterial

Dentre as classes de anti-hipertensivos, destacam-se os vasodilatadores diretos. O mecanismo de ação destes medicamentos consiste numa atuação direta sobre a musculatura da parede vascular, promovendo o relaxamento desta musculatura lisa, o que por sua vez provoca vasodilatação arterial e redução da resistência vascular periférica. Devido à vasodilatação arterial direta, ocorre retenção hídrica e taquicardia reflexa. Por este motivo, os medicamentos desta classe de anti-hipertensivos não são diretamente utilizados em esquema monoterapêutico, sendo então sempre utilizados em associação a diuréticos e beta-bloqueadores. A hidralazina é o principal representante desta classe de vasodilatadores diretos.

A hidralazina é um importante anti-hipertensivo com atividade anti-oxidante e com capacidade de gerar, in vitro, espécies reativas de oxigênio, espécies reativas de nitrogênio e prostaglandina. É obtido sob a forma de um pó branco, cristalino e solúvel em água (SAIMA et al, 2010).

Figura 1.2: Estrutura da molécula de hidralazina

A hipertensão arterial resistente ou refratária (HAR) é a doença crônica mais comum nas sociedades desenvolvidas, afetando mais de 25% dos adultos (WOLF-MAIER, 2003). Ela é definida como resistente ou refratária ao tratamento quando o esquema terapêutico envolve o uso de no mínimo três fármacos anti-hipertensivos, sendo um deles um diurético, em doses plenas sem que haja redução da pressão sistólica e diastólica para o alvo do esquema terapêutico (SARAFIDIS, 2008). A prevalência de hipertensão arterial resistente é alta, sendo composta por 10 a 30% dos pacientes hipertensos em geral. Uma vez que a hipertensão arterial resistente é um quadro grave e está associada a altos riscos de ocorrência de lesões de órgãos-alvos e doenças cardiovasculares, existe a necessidade de tratamento dos pacientes portadores deste quadro em centros especializados (DREAM TRIAL INVESTIGATORS, 2006).

Dentre as diversas possíveis causas de hipertensão arterial resistente, uma das principais causas é a baixa aderência às drogas utilizadas no tratamento. A não aderência às ações de mudança de estilo de vida, idade avançada, presença de diabetes, insuficiência renal e uso abusivo de álcool são também fatores associados a resistência ao tratamento anti-hipertensivo. A grande variedade de efeitos do tratamento anti-hipertensivo observadas na população pode ser atribuída a fatores como idade, sexo, função hepática e gravidade da doença. Além destes fatores, a variabilidade genética parece exercer também um importante papel na ocorrência de diferentes respostas aos medicamentos entre os pacientes. Portanto, uma análise mais minuciosa e detalhada a respeito do mecanismo de biotransformação dos fármacos e dos agentes biológicos envolvidos nestes processos é fundamental para obter possíveis respostas inovadoras quanto à relação entre alterações genéticas e diferentes perfis de resposta aos medicamentos.

A ciência de estudo das drogas e da forma como os tecidos e organismos vivos são modificados pelo efeito delas é conhecida como farmacologia (AL-GHOUL, 2008). Existem dois fundamentos básicos da farmacologia que promovem e explicam a existência de resposta individualiza de um paciente a um medicamento: a farmacocinética e a farmacodinâmica (LINDER, 2006).

A farmacocinética é o fundamento da farmacologia que descreve quantitativamente o efeito do organismo sobre a droga, o que inclui a taxa de absorção, distribuição, o metabolismo e a excreção do medicamento (LINDER, 2006). Este fundamento é utilizado para determinar a dose de um medicamento necessária para produzir um efeito terapêutico de interesse. Portanto, a farmacocinética é o elemento-chave para determinar a prescrição da dosagem individualizada de um medicamento.

A farmacodinâmica, por sua vez, diz respeito ao efeito de uma droga no organismo. Ela é definida pela natureza da interação droga-receptor. Sendo assim, o efeito do medicamento sobre o organismo é definido pelo número de receptores e pela afinidade de ligação destes receptores ao medicamento (LINDER, 2006).

Observando tais definições, define-se que a farmacocinética e a farmacodinâmica detém os princípios que indicam quando a resposta do organismo a um medicamento será terapêutica, sub-terapêutica ou tóxica.

A variabilidade individual decorrente de variantes gênicas de proteínas diversas envolvidas nos processos de absorção, distribuição, eliminação e alvos de um medicamento exercem também influência sobre a resposta às drogas, produzindo diferenças entre os indivíduos quanto a uma mesma dose de medicamento.

Um importante aspecto da farmacocinética diz respeito ao processo de biotransformação das drogas. A biotransformação das drogas envolve a ação de grupos específicos de enzimas que convertem as drogas, geralmente hidrofóbicas, em compostos de maior polaridade, que possuem maior interação com a água (hidrofílicos) e são mais facilmente eliminados (CRETTOL, 2010). As reações de biotransformação dos fármacos são divididas em dois tipos, que ocorrem sequencialmente.

As reações de funcionalização (Fase I) consistem em reações oxidativas, as quais estão incluídas a hidroxilação de átomos de carbono e nitrogênio, desaminação oxidativa e N- e O- desalquilação. Estas reações conduzem a formação de metabólitos farmacologicamente inativos, menos ativos ou ainda com maior atividade que a molécula administrada ao indivíduo. Neste último caso, quando o metabólito é a forma ativa do medicamento, o composto original é chamado de pró-fármaco (KATZUNG, 2006).

As reações de conjugação (Fase II) envolvem a conversão dos produtos metabólitos das reações de Fase I em compostos com maior polaridade, através da conjugação com moléculas endógenas hidrofílicas. Os conjugados hidrofílicos são as principais formas excretadas das drogas pela urina e fezes (CRETTOL, 2010). Dentre as enzimas de Fase II participantes destes processos de polarização e conjugação dos metabólitos para excreção, destacam-se as N- acetiltransferases.

Figura 1.4: Esquema representativo dos processos biológicos ocorridos no interior do organismo pela administração de um medicamento e das principais reações de biotransformação de drogas (Moura, 2002)

As N-acetiltransferases são uma família de enzimas que catalisam a N-acetilação de arilaminas, arilhidroxilaminas e arilhidrazinas pela transferência de um grupamento acetil proveniente da molécula de acetil-coA (SIM, 2008).

Figura 1.5: reações catalisadas pelas N-acetiltransferases (Sim et al, 2008)

Em humanos, existem dois genes da família das N-acetiltransferases (NAT1 e NAT2) e um pseudogene (NATP), localizados no cromossomo 8p22. Dentre eles, destaca-se o gene que codifica para a enzima N-acetiltransferase 2 (NAT2). O gene apresenta a característica de possuir em sua região codificante um único éxon, com ausência de íntrons. A enzima codificada por este gene é localizada no citosol da célula, sendo expressa principalmente nos hepatócitos e células intestinais. A enzima NAT2 é responsável especificamente pela acetilação de compostos de sulfametazina e arilhidrazina (SIM, 2008). Um dos principais alvos da ação de NAT2 é a hidralazina, um anti-hipertensivo que atua como vasodilatador direto e é prescrito em esquema terapêutico de associação com outros medicamentos para tratamento da hipertensão arterial e hipertensão arterial resistente.

O gene NAT2 é um importante alvo de modificações nucleotídicas. Estas modificações podem conduzir a formação de diferentes fenótipos de acetilação nos pacientes, uma vez que a função da enzima NAT2 pode ser alterada por conta destas modificações. De acordo com dados atualizados em Março de 2010, já estão descritos na literatura 62 haplótipos de NAT2, provenientes de combinações de mutações nucleotídicas pontuais (SNPs), que por sua vez levam a formação de diferentes haplótipos. Estes dados detalhados podem ser acessados através do endereço eletrônico da faculdade de medicina de Louisville.

Os fenótipos produzidos por conta de modificações genéticas no gene NAT2 são: acetiladores lentos, acetiladores intermediários e acetiladores rápidos. É importante lembrar que os genes em indivíduos humanos estão presentes em duas cópias, denominadas alelos, sendo um alelo herdado do pai e um alelo herdado da mãe. Os indivíduos caracterizados como acetiladores lentos possuem os dois alelos do gene NAT2 com baixa atividade, por conta das modificações nucleotídicas (SNPs). Os indivíduos classificados como acetiladores intermediários apresentam um alelo funcional e um alelo com baixa atividade. Já os indivíduos caracterizados como acetiladores rápidos possuem os dois alelos de NAT2 funcionais.

Figura 1.6: Esquema representativo da organização estrutural dos genes da família das N-acetiltransferases e dos haplótipos da N-acetiltransferase 2

A variação entre indivíduos na biotransformação de fármacos é um ponto chave na resposta às terapias medicamentosas indicadas e também é o fator fundamental que não permite o estabelecimento de terapias padronizadas para todos os pacientes. Um conhecimento a respeito da variabilidade de genética dos genes que codificam para enzimas participantes das vias de biotransformação dos fármacos, dentre ela a enzima N-acetiltransferase 2, fornece a base para o entendimento dos diferentes desfechos terapêuticos apresentados pelos pacientes. Analisando os diversos trabalhos descritos na literatura envolvendo o estudo de caracterização estrutural e funcional de enzimas frente a modificações genéticas e a influência sobre a atividade enzimática no organismo, é possível dizer que as enzimas envolvidas na biotransformação de fármacos são codificadas por genes que, por sua vez, são importantes alvos de modificações genéticas. As variações genéticas na sequência de DNA destes genes se devem a polimorfismos de base única (SNPs) que, dependendo da localização ao longo da seqüência de DNA, podem resultar num aumento, diminuição, perda ou até mesmo ausência de atividade enzimática. Portanto, as diferenças individuais de resposta a um fármaco dependem da variante alélica presente no indivíduo. Assumindo uma relação direta entre fenótipo e genótipo, pode-se inferir um desfecho terapêutico desfavorável para o tratamento padronizado.

Os polimorfismos de base única (SNPs) são as variações genéticas mais comuns em humanos, representadas por a substituição de um único nucleotídeo, produzindo sequências alternativas conhecidas como variantes alélicas. O critério de determinação de uma modificação nucleotídicas com um SNP baseia-se na necessidade desta modificação apresentar uma frequência de, no mínimo, 1 % em indivíduos normais de uma determinada população (COLLINS, 1997). Os SNPs podem estar localizados em qualquer região de uma sequência de um determinado gene. Contudo, os SNPs encontrados em regiões regulatórias e/ou codificante são mais comuns. Cerca de metade dos SNPs localizados na região codificante apresentam mutações que levam a troca do aminoácido correspondente (mutação não sinônima), enquanto a outra metade provoca mutações silenciosas. Em relação aos genes que codificam para enzimas envolvidas na biotransformação de fármacos, tanto os SNPs não sinônimos como os SNPs sinônimos podem resultar em diferenças nas características individuais da resposta terapêutica originadas por alterações na farmacocinética e/ou na faracodinâmica do fármaco (WANG & MOULT, 2001).

A farmacogenética é um campo da farmacologia que fornece uma estrutura conceitual básica para a experimentação que analisa os efeitos das variações genéticas na resposta dos humanos aos fármacos. É um campo que tem despertado grande interesse na prática da medicina devido ao seu potencial e às possibilidades abertas para a elaboração de terapias medicamentosas novas e mais seguras (WEBER, 2001). Segundo Pirmhamed (2001), a farmacogenética é definida como o estudo da variabilidade na resposta a drogas com base na variabilidade dos genes que determinam o metabolismo das mesmas, ou seja, as diferenças alélicas associadas com a variabilidade individual na resposta a uma droga. Os principais alvos da farmacogenética têm sido os genes que codificam para proteínas (geralmente enzimas) envolvidas no metabolismo das drogas.

De acordo com as mutações ou polimorfismos presentes nestes genes, os indivíduos podem ser classificados como metabolizadores lentos, metabolizadores rápidos e metabolizadores intermediários. Os metabolizadores lentos são aqueles que metabolizam o fármaco de maneira insuficiente e muito lentamente. Os metabolizadores rápidos apresentam uma metabolização tão rápida do fármaco de forma que há produção de muitos metabólitos tóxicos e não se atinge a janela terapêutica na qual o medicamento exerce o efeito desejado sobre o organismo. Os metabolizadores intermediários apresentam perfil de metabolização adequada do medicamento.

A farmacogenética clínica tem como proposta distinguir os pacientes com base em informações do genoma, de acordo com a resposta ao fármaco e ainda distinguir os pacientes que possuem maior ou menor risco de desenvolver efeitos adversos. Através destas informações, é possível então ajustar uma terapia que aumente as chances de eficácia e minimize os riscos de reações adversas (SPEAR, 2001). Contudo, é fundamental assumir que a relação entre o genótipo e o fenótipo observado seja estatisticamente significante (NEBERT, 1999).

Figura 1.7: Esquema representativo demonstrando os ajustes na dose de medicamento de acordo com a determinação do fenótipo de metabolização do indivíduo (Kirchheiner et al, 2005)

II. OBJETIVOS

2.1) Objetivos Principais

Adquirir experiência no trabalho na área de pesquisa científica e nas técnicas laboratoriais na área de Biologia Molecular.

Aplicar os conhecimentos teóricos e práticos adquiridos ao longo do curso técnico de Biotecnologia no cotidiano da pesquisa em laboratório.

Descrever o perfil de metabolização do gene NAT2 através de genotipagem das variantes alélicas de interesse funcionalmente caracterizadas.

Identificar os polimorfismos de nucleotídeos únicos (SNPs) no gene NAT2 e relacioná-los ao perfil fenotípico de metabolização individual dos pacientes com hipertensão arterial resistente.

2.2) Objetivos específicos

Descrever a frequência de mutações presentes no gene NAT2 em pacientes com hipertensão arterial resistente.

Desenvolver e avaliar metodologias que procurem aumentar a eficácia e a segurança do tratamento de hipertensão arterial resistente através da prática de identificação de grupos de pacientes merecedores de posologia e atenção laboratorial diferenciada.

Avaliar os possíveis polimorfismos genéticos encontrados com as características clínicas e laboratoriais do paciente.

III. ATIVIDADES REALIZADAS

3.1) Seleção das pacientes para o estudo e disposição geral dos locais envolvidos no desenvolvimento do projeto

As amostras de sangue utilizadas no estudo foram colhidas de pacientes participantes do Programa de Hipertensão Arterial Resistente (ProHart), desenvolvido no Hospital Universitário Clementino Fraga Filho, que por sua vez localiza-se na faculdade de Medicina da Universidade Federal do Rio de Janeiro. Estes pacientes, na época de início do estudo, deveriam atender a critérios de elegibilidade, critérios inclusão e não se encaixarem em nenhum dos critérios de exclusão estabelecidos pelos pesquisadores. Ao total, obteve-se o número amostral de 81 pacientes participantes do projeto.

Uma vez colhidas, as amostras de sangue eram devidamente encaminhadas para o laboratório de Biologia Molecular aplicada a Micobactérias, localizado na Fundação Oswaldo Cruz, onde toda a parte experimental (extração de DNA, amplificação dos genes e suas respectivas regiões de interesse, purificação dos fragmentos amplificados, genotipagem e análise dos dados) era executada.

A conclusão da parte experimental foi desenvolvida no Laboratório de Genômica Funcional e Bioinformática, localizado na Fundação Oswaldo Cruz, que estava responsável pela condução do sequenciamento de DNA e fornecimento do suporte de Bioinformática para análise dos dados obtidos.

3.2) Extração do DNA genômico a partir de amostra de sangue – Kit QIAamp (QIAGEN)

3.2.1) Materiais, soluções e reagentes utilizados

  • Pipetadores automáticos – P10, P100, P200 e P100 – Pipetman - Gilson®

  • Tubos de microcentrífuga – 0,6 mL e 1,5 mL - Axygen®

  • Estante para tubos de centrífuga

  • Ponteiras para pipetador automático – 10 µL, 200 µL e 1000 µL - Axygen®

  • Vortex (agitador de soluções) - Phoenix®

  • Placa de aquecimento para tubos de microcentrífuga – Dry Block MA 4004 - MARCONI®

  • Microcentrífuga – Mini spin - Eppendorf®

  • Recipiente de descarte

  • Caixa de armazenamento de tubos de microcentrífuga

  • Congelador - Consul®

  • Etanol 96%

  • Kit de extração de DNA genômico a partir de sangue humano – QIAamp® DNA Mini

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