Baixe Manual de laboratório de microbiologia e outras Manuais, Projetos, Pesquisas em PDF para Biotecnologia, somente na Docsity! Olga Martins Marques (ProfaUNICAP - DQ) Alexandra Amorim Salgueiro (Profa UNICAP -DQ) Maria Alice Gomes de Andrade Lima (ProfaUFPE-DEQ) Maria de Los Angeles Peres Palha (Profa UFPE - DEQ) Sonia Ma Souza Cavalcante de Albuquerque (Profa UFPE -DEQ) Recife - Pernambuco 1998 2 Apresentação A inexistência de um texto de práticas de Microbiologia Geral adaptado às nossas condições do nosso laboratório, e destinado aos cursos superiores de Engenharia Química, Química Industrial e outros, nos motivaram à realização deste manual. Os experimentos foram selecionados de modo a englobar a maioria dos assuntos contidos no programa referentes à primeira unidade do curso e podem ser facilmente efetuados em laboratórios de recursos limitados. Cada experimento, poderá ser efetuado por um grupo de dois ou mais alunos. Muitas vezes o experimento pode ser dividido entre vários grupos da classe, sendo que cada grupo deve fazer o experimento numa determinada condição. Neste caso, o instrutor dever fazer uma discussão a posteiori e global do problema apresentado. 5 1.4. Diversos a.Lápis dermatográfico - utilizado para escrever em superfície de vidro b.Algodão bruto (ou cardado)- serve para proteger o material esterilizado, do contato com o ar ambiente. c.Cabo de Kolle - feito com material isolante, adaptado em três formas (círculo, ele, agulha). Serve de suporte para um fio de platina ou uma liga níquel-cromo, sendo utilizado em inoculação de microrganismos. 2. DESINFECÇÃO a. Desinfecção do ar: - através da vaporização de uma solução de hipoclorito de sódio a 1%; - pelo uso de lâmpadas de luz ultravioleta. - pode ser feita periodicamente com a vaporização de uma solução de formalina (formol a 40%), no entanto, esta solução não se pode usar para a desinfecção de ambientes ocupados; b. Desinfecção da bancada: Antes da realização de um determinado trabalho de microbiologia, a bancada deve ser limpa com uma solução detergente seguida de uma solução alcoólica a 70%. c. Desinfecção da vidraria: - vidraria contaminada - deverá ser inicialmente esterilizada em autoclave para que toda flora presente seja destruída e, em seguida lavada com uma solução detergente ou sabão neutro; - vidraria sem contaminação - idem ao anterior, porém sem necessidade de autoclavação. Observação: não é costume se utilizar solução sulfocrômica na lavagem dos materiais do laboratório de microbiologia, uma vez que esta solução contém cromo que é um metal que pode intoxicar as células vivas e também por ser de difícil remoção no material 6 3. ACONDICIONAMENTO a. Placas de Petri - embrulhadas com papel, geralmente formando conjunto de 3 unidades. A quantidade depende da necessidade do trabalho. b. Pipetas - obtura-se as boquilhas com mecha de algodão (1cm) para filtrar o ar soprado e para proteger o operador durante a manipulação; em seguida são enroladas uma a uma com papel, anotando a capacidade de cada uma. c. Tubos de ensaio, balões de fundo chato, Erlenmeyers, fernbachs - são preparados introduzindo-se um tampão de algodão cardado na boca do recipiente. Esse tampão deve ser feito, enrolando o algodão no sentido da fibra em quantidade suficiente para facilitar o manuseio, isto é, não deve ser nem muito apertado, nem muito frouxo. d. Lâminas - mergulhadas em solução alcoólica, ficam aptas a serem utilizadas a qualquer momento, evitando paralelamente que sejam arranhadas. ATENÇÃO: Toda vidraria utilizada no laboratório de microbiologia antes de ser preparada para esterilização deverá estar limpa e seca. ESTERILIZAÇÃO EM AUTOCLAVE Operação: l igar o aparelho à rede elétrica. Após a colocação do material dentro do autoclave, a tampa é fechada e a torneira de remoção de ar ou vapor é deixada aberta para remover todo o ar. Quando todo o ar for removido, deixe que um fluxo de vapor fluente persista por cerca de 5 minutos, antes de fechar a torneira. A partir de então a pressão internamente irá aumentar e chegar à pressão de esterilização usada, que é de 15 lb/pol2 , ou 1atm, ou 1 kgf/cm2 , correspondendo a uma temperatura de 1210C. O tempo de exposição do material no interior deste equipamento irá depender do volume de líquido a ser esterilizado. Para pequenos volumes, até 3 litros, podem ser esterilizados durante 20 a 30 minutos a uma pressão de 15 lb/pol2 . Com relação a maiores volumes, será necessário, uma exposição mais prolongada. Quando a temperatura requerida para a esterilização é alcançada, deve-se começar a contar o tempo, usando um relógio de laboratório (com alarme). Decorrido o tempo desliga-se o aparelho da corrente elétrica e mantém-se a autoclave e a torneira de ar e vapor fechados, até o manômetro voltar ao ponto zero, pois quando a pressão da autoclave é aliviada rapidamente, os líquidos dentro dos tubos e frascos fervem violentamente, fazendo com que os tampões sejam arremessados para fora dos mesmos. 7 Concluída a esterilização, abre-se a torneira de vapor; em seguida a tampa do autoclave é levantada. PRÁTICA N° 2 OBJETIVOS: • Trabalhar assepticamente • Cultivar microrganimos • Diferenciar macroscopicamente fungos, leveduras, bactérias INTRODUÇÃO O homem no seu meio ambiente convive com inúmeras formas de vida. Os microrganismos ocupam lugar de destaque tanto pelos benefícios como pelos malefícios que proporcionam ao homem, sendo encontrados na natureza em abundância e variedade de formas. Para que os mesmos sejam cultivados artificialmente é necessário conhecer suas exigências nutricionais e suas condições físicas de crescimento, trabalhar com material esterilizado e obdecer às normas de prática asséptica. Dependendo da finalidade da operação, os microrganimos podem ser cultivados em: lâminas, placas, tubos, balões, fernbach ou recipientes de maior capacidade. O cultivo em lâmina é utilizado quando se deseja acompanhar microscopicamente o crescimento e reprodução de um microrganismo. Emprega-se o cultivo em placas quando se quer isolar espécies microbianas distintas, devido à extensa área de superfície que apresenta. Porém, devido à pequena quantidade de meio em exposição ao ar, com frequência ocorre ressecamento e/ou aparecimento de contaminações. Cultivando os microrganismos em tubos, há facilidade de manipulação das culturas, além da vantagem de economizar meio e espaço físico. Para se obter grandes volumes de cultura, o microrganismo é cultivado inicialmente em balões, fernbach, para depois ser transferido para recipiente maior, cuja capacidade é função da necessidade do trabalho. NORMAS DE PRÁTICA ASSÉPTICA 1. Não trabalhar em corrente de ar, nem ambiente agitado pelo acúmulo de pessoas; 2. Não falar nem respirar em frente ao recipiente aberto contendo material de estudo; 10 c. sedimento: depósito de células no fundo do tubo. Observação:. . As colônias de fungos são geralmente grandes e filamentosas, algumas vezes ocupam toda a placa onde estão cultivadas. . As colônias de leveduras são pequenas e leitosas, enquanto as de bactérias são menores e brilhantes sendo algumas tão pequenas que se denominam puntiformes. PRÁTICA N° 3 OBJETIVOS: • Distinguir os diversos componentes de um microscópio ótico composto • Focalizar “in vivo”: células de leveduras em suspensão, microrganismos (algas, protozoários e bactérias móveis em água) COMPONENTES DE UM MICROSCÓPIO ÓTICO COMPOSTO I - PARTE MECÂNICA: 1. Base ou pé - dispositivo de tamanho e peso suficiente para assegurar o equilíbrio estável do instrumento, evitando trepidações; 2.Corpo, braço ou coluna - haste destinada a sustentar o tubo microscópico e conter os mecanismos de movimento; alguns apresentam articulação, facilitando a observação do pesquisador; 3.Tubo ou canhão microscópico - cilindro oco que serve de suporte para os dois sistemas de lentes (oculares e objetivas); 4. Revólver - peça giratória onde ficam fixadas as lentes objetivas, permitindo que cada lente possa ser colocada em foco ( uma de cada vez), isto é, em coincidência com o eixo ótico; 5. Platina - plataforma horizontal com uma abertura circular no centro por onde passam os raios luminosos. Existem platinas móveis; 6. Pinça ou presilhas - alças flexíveis e ajustáveis, situadas na platina. São utilizadas para fixar a lâmina; 11 7. “Charriot”- dispositivo facultativo que permite a movimentação da lâmina em dois sentidos: horizontal e vertical, pela manipulação de dois parafusos; 8. Sistema de cremalheira - peça munida de dentes, controlada pelos parafusos macrométrico e micrométrico; a) Macrométrico - ocasiona diferentes aproximações entre a objetiva e a preparação, variando a distância vertical de vários centímetros. Serve para trazer o objeto ao foco aproximado; b) Micrométrico - permite mínimos deslocamentos verticais da ordem de centésimos de milímetros, sendo utilizado na focalização final; Observação: Nos microscópios mais modernos existe um único parafuso que oferece o controle destes dois movimentos. II - PARTE ÓTICA 1. Fonte luminosa: 1.1. Natural - luz solar 1.2. Artificial - lâmpada 1.2.1. Direta - quando a lâmpada está fixada no eixo ótico 1.2.2. Indireta - quando se utiliza fonte luminosa anexa ao microscópio. 2. Espelho - girando em torno de um eixo, é utilizado para refletir os raios luminosos; pode ser côncavo ou plano, aumentando ou diminuindo a intensidade da luz, respectivamente; 3. Diafrágma - controla a extensão angular do feixe luminoso, reduzindo o ângulo do cone de luz, de modo que não exceda o diâmetro da objetiva após atravessar o objeto; 4. Condensador - conjunto de lentes convergentes que projeta sobre a preparação o feixe de luz em forma de um amplo cone; por deslocamentos verticais diminui ou concentra a luz no objeto; 5. Lentes objetivas - são as lentes que ficam próximas ao objeto, formando na parte superior do tubo microscópico uma imagem invertida e ampliada do objeto. Podem ser: a) a seco - quando o meio entre o objeto e a lente é o ar, podendo ser de pequeno, médio ou grande aumento; b) de imersão - quando a lente fica mergulhada numa camada de líquido; 6. Sistema de lentes oculares - apresenta um conjunto de lentes: lente de campo (corretora) que corrige a esfericidade da imagem e a lente 12 ampliadora que atua em conjunto com o observador como uma simples lente de aumento, aumentando a imagem formada pela objetiva. MANIPULAÇÃO DO MICROSCÓPIO 1. Instalação do aparelho Retirar o microscópio da caixa ou armário pelo braço e colocá-lo na mesa apropriada (chumbada e nivelada); a seguir ligar a fonte luminosa e dispor a objetiva no revólver e regular a altura do banco, de maneira a permitir um trabalho confortável. 2. Iluminação de campo Se a luz utilizada é uma luz natural, usar a face plana do espelho, caso contrário, a face côncava. Em qualquer caso, a luz deve cobrir completamente a superfície do espelho e este deve estar centrado de maneira que o cone luminoso refletido atravesse completamente o condensador (que deve estar completamente levantado, com o diafragma aberto) bem como a abertura da platina, de tal sorte que o campo do microscópio (isto é, o espaço da platina visualizado com a ocular) fique totalmente iluminado. 3. Adaptação da preparação Colocar a lâmina contendo a preparação sobre a platina e prendê- la, depois, com o auxílio do Charriot, deslocar o conjunto de tal forma que a preparação contida na lâmina, fique sobre a abertura da platina, perfeitamente iluminada pelo cone luminoso. 4. Escolha da objetiva a) preparações a fresco (“In vivo”): trabalhar apenas com objetivas a seco, começando pela de menor aumento; b) preparações coradas (“In vitro”): - focalizar inicialmente com a objetiva a seco de menor aumento; - girar o revólver de maneira que nenhuma das objetivas fiquem em uso; - colocar sobre a preparação uma pequena gota de óleo de imersão; - colocar no eixo ótico a objetiva de maior aumento (imersão) 5. Iluminação da preparação 15 A objetiva de imersão é limpa com papel de filtro ou algodão umedecido com uma mistura de xilol e éter na proporção de 1:1, que deve ser imediatamente removido com papel ou algodão limpo. A permanencia de xilol sobre a lente causa desvitrificação da mesma. Nunca deixe ficar óleo na lente pois ali resinifica e depois para limpar, exige excesso de dissolvente, podendo este penetrar no sistema, dissolvendo o bálsamo que liga as diversas partes. As objetivas a seco são limpas com um linho macio e ocasionalmente, com papel umedecido com água destilada. A parte interior das objetivas não deve ser limpa usualmente e quando é feito deverá ser praticada por pessoa habilitada. Deve-se remover a objetiva e passar suavemente um pincel macio ou uma bucha de pano macio na extremidade de uma haste. Não se deve assoprar para evitar a umidade. Esta operação deverá ser feita com muito cuidado para não descentralizar as objetivas. As lentes do aparelho de iluminação são limpas como as demais, com frequência pois delas depende a boa iluminação fornecida. A parte mecânica é limpa e polida com uma flanela e a cremalheira com óleo detergente fino. Para uma boa conservação do microscópio o operador deverá seguir uma rotina diária que vai desde uma simples remoção do pó até uma lubrificação mensal de todas as partes móveis com um óleo fluido. A cada trimestre o aparelho deve ser enviado a um técnico especializado para uma inspeção rigorosa, limpeza e lubrificação geral. PRÁTICA N° 4 OBJETIVOS: • Realizar coloração simples • Observar microrganismos diferentes sob objetiva de imersão • Diferenciar leveduras de bactérias considerando o tamanho celular 16 OBSERVAÇÕES “IN VITRO” Os microrganismos são usualmente transparentes, tornando difícil o estudo de detalhes morfológicos quando são examinados em seu estado natural, assim torna-se necessário a utilização de técnicas de coloração. As observações microscópicas “in vitro” são realizadas com o microrganismo previamente fixado ã lâmina. Nestas condições as células microbianas são observadas mortas. Após a fixação, submete-se a preparação à etapa de coloração pela adição de soluções adequadas em função da técnica de coloração desejada. As técnicas de coloração não só facilitam a visibilidade das células microbianas, como também, propiciam a visualização de determinadas estruturas celulares em função de afinidades específicas com determinados corantes, e facilitam identificação de micorganismos devido a comportamento diferentes frente à ação de soluções diferenciadoras. A menos que algum aspecto morfológico específico, dependente de idade da cultura, deva ser demonstrado, o microbiologista deve usar sempre cultura nova nas observações microscópicas. As células com o tempo de cultivo, modificam o metabolismo, alterando a afinidade com muitos corantes. Excluindo os organismos que têm um tempo de geração especialmente grande, uma cultura com 24 horas de cultivo dará sempre bons resultados. SUBSTÂNCIAS CORANTES Segundo Langeron, corantes são substâncias coradas que gozam da propriedade de transmitir cor a outros corpos. Muitas são as substâncias corantes empregadas na rotina diária dos laboratórios, a maioria derivados da anilina, podendo ser classificados em naturais e artificiais. Entre os naturais destacam-se: o carmim, a hematoxilina. Os artificiais são agrupados em função dos grupos químicos presentes e da afinidade com estruturas celulares, podendo ser: a) Básicos ou nucleares: violeta de genciana, cristal violeta, verde de malaquita, azul de metileno, fucsina básica, azul de toluidina, verde de metila etc. b) Ácidos ou citoplasmáticos: eosina, fluoresceína, fucsina ácida, orange G, vermelho congo, ácido picrico etc c) Neutros: eosinato de azul de metileno e de azul AZUR, giensa etc. PREPARAÇÃO E FIXAÇÃO DE ESFREGAÇO 17 Em processos de coloração de rotina, uma boa observação microscópica depende tanto da preparação do esfregaço como de sua fixação à lâmina. TÉCNICA . Flambar a alça de platina (“em círculo”) ao rubro, deixar esfriar, conservando-a próxima à chama; . Depositar com o auxílio da alça, gotas da suspensão microbiana na lâmina, se for o caso, suspender a amostra da cultura na própria lâmina; . Espalhar bem o material na lâmina, empregando movimentos rotacionais na alça de platina ( do centro para a periferia), a fim de se obter um esfregaço de forma oval, bem fino e uniforme; . Secar a fina película do material (esfregaço) ao ar ou pela passagem na chama do bico de Bunsen; . Fixar o esfregaço, passando o dorso da lâmina três vezes ou mais na chama, a fim de que o material fique bem aderido à lâmina; . Deixar a preparação esfriar ao ar e corar. A fixação do esfregaço com água pode formar aerossóis (partículas projetadas durante a fervura de líquidos); evita-se introduzindo a lâmina no cone azul da chama (parte redutora, a mais quente), permanecendo alguns instantes a fim de secar o material. A preparação e fixação do esfregaço requer cuidados evitando-se tratamentos bruscos, para que as células da amostra a serem observadas não fiquem aglomeradas dificultando a observação, como também não tenham seus arranjos característicos destruídos. COLORAÇÃO SIMPLES Denomina-se de coloração simples à coloração em que se adiciona qualquer solução corante ao esfregaço fixado durante um determinado tempo (30s a 3 min) em função do corante utilizado. Depois lava-se a lâmina em água corrente, seca-se e observa-se usando a objetiva de imersão. Essa coloração tem a finalidade de nos dá uma visão da forma, do tamanho e dos arranjos das células, bem como de outros detalhes estruturais. 20 (B. subtilis ), B. antracis (do carbúnculo) e Clostridium (bacilo do tétano Cl . tetani; Cl. botulinum (do botulismo). TÉCNICA DA COLORAÇÃO DE GRAM 1. Preparar um esfregaço; 2. Depois de frio cobrir o esfregaço com solução de cristal de violeta (1 minuto); 3. Cobrir com solução de lugol (mordente) - 1 minuto; 4. Lavar em água corrente; 5. Descorar pelo álcool absoluto (evitar o descoramento deficiente ou em excesso; 6. Lavar em água corrente; 7. Contrastar, rapidamente com safranina (30 segundos); 8. Lavar em água corrente; 9. Secar com papel fino; 10.Examinar com objetiva de imersão. AMOSTRAS: • Bacillus subtilis • Escherichia coli • Aerobacter aerogenes • Staphylococcus aureus • Sarcina lutea • Micrococcus PRÁTICA N° 6 OBJETIVOS: • Realizar coloração Especial de esporos • Observar ao microscópio sob imersão as preparações coradas COLORAÇÃO DE ESPOROS Os esporos são células de resistência, não sendo característica predominante de todos os microrganismos. Algumas bactérias são capazes de formar esporos, como por exemplo: bactérias do gênero Bacillus e Clostridium. TÉCNICA 1. Preparar o esfregaço e fixar; 2. Cobrir o esfregaço com papel de filtro; 21 3. Adicionar o corante verde malaquita; 4. Aquecer até emissão de vapores; 5. Repetir as operações 3 e 4 por 3 minutos; 6. Lavar em água corrente; 7. Adicionar safranina (0,5 a 1 minuto); 8. Lavar em água corrente; 9. Secar e observar em imersão RESULTADO: Os esporos coram-se em verde e o resto da célula em vermelho. PRÁTICA N° 7 OBJETIVOS: • Preparar meios de cultura de usos em práticas microbiológicas • Distribuir convenientemente, esterilizar em autoclave PREPARAÇÃO DE MEIOS DE CULTURA Meios de cultura são associações de substâncias que permitem o cultivo dos microrganismos fora do seu meio natural. Nas preparações dos meios de cultura todos os nutrientes devem ser dissolvidos em água para que possam ser absorvidos pelas células microbianas. Nos laboratórios geralmente utiliza-se água destilada no preparo destes meios, no entanto nas unidades industriais costuma-se utilizar água de rios ou poços. A água deve ter boa origem e composição química constante; quando necessário, deve ser devidamente tratada. Como constituintes básicos dos meios de cultura, além da água, pode-se especificar: as fontes de carbono, as fontes de nitrogênio, os sais. Em meios de cultura solidificados, além destes componentes deve- se introduzir agar, gelatina ou sílica gel com a função específica de solificar esses meios. NORMAS DE PREPARAÇÃO • Pesagem dos componentes: os diversos componentes dos meios de cultura podem ser pesados separadamente, ou consecutivamente num único recipiente (Béquer). Para quantidades inferiores a 1g utiliza-se uma balança analítica (semi-analítica). O agar-agar geralmente é pesado separadamente, sendo o valor da pesagem em função da quantidade do meio a ser distribuído nos recipientes. Utiliza-se de 10 a 20g deste agente solidificante em pó para cada litro de solução nutriente. • Solubilização dos componentes: adicionar os nutrientes previamente pesados a um Béquer contendo água destilada em quantidade suficiente 22 para dissolvê-los. Os extratos de carne e de leveduras podem ser aquecidos ligeiramente para facilitar a solubilização. Deve-se evitar o uso de fogo direto e prolongado para não haver queima do material e consequente escurecimento do meio. O agar não é solúvel a frio, devendo se necessário ser solubilizado em um banho-maria ou em autoclave a vapor fluente. • Ajuste do pH nos meios: deve-se deixar resfriar ao máximo os meio líquidos, antes de acertar o pH. No caso dos meios solidificados ajustar na menor temperatura em que não haja solidificação. São empregadas para ajuste do pH soluções de hidróxido de sódio ou ácido clorídrico a 0,1 N, conforme o caso. Na maioria dos casos pode-se verificar o pH através do uso de um papel de tornassol. Em meios solidificados, o pH ácido só deverá ser ajustado depois da esterilização para evitar a hidrólize do agar quando em temperatura elevada. Neste caso o pH ácido é ajustado com uma solução estéril de ácido lático. • Clarificação: em alguns casos há necessidade de clarificação dos meios que durante o preparo tornam-se turvos. A clarifição pode ser feita simplesmente pelo calor ou pelo uso de clara ou albumina de ovo, aquecendo em seguida até ebulição e filtrando-se em gase ou algodão hidrófilo. • Distribuição, esterilização e conservação: os meios de cultura depois de preparados são distribuídos em recipientes adequados (tubos, balões, Erlenmeyeres), especificando o respectivo nome ou sigla e a data do preparo dos mesmos. Terminada a distribuição, os tubos, balões ou Erlenmeyers são arrolhados com algodão ou tampas metálicas especiais, acondicionados em cestas e levados à esterilização em autoclave. A temperatura e o tempo de exposição neste equipamento depende da composição e da quantidade de meio de cultura recipiente (vide esterilização). Após a esterilização, os meios são resfriados espera-se 72 horas antes de usá-los ou estocá-los em geladeira, a fim de que se possa detectar algum tipo de contaminação, ou falha de esterilização. COMPOSIÇÃO DE MEIOS DE CULTURA AGAR NUTRITIVO Extrato de carne... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3,0g Peptona... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5,0g 25 Água destilada... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1000ml pH = 6,8 - 7,0 SORO DE LARANJA Triptona... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10,0g Extrato de leveduras... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3,0g Glicose... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4,0g Fosfato dipotássico... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15,0g Soro de laranja... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .200,0ml Água destilada... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .800,0ml Preparar o soro de laranja aquecendo 1 litro do suco recém- extraído, a aproximadamente 93°C. Adicionar 30g de diatomácea e misturar. Filtrar com sucção através de um funil de Buchner usando papel de filtro grosseiro recoberto com o auxílio de filtração. Refiltrar os primeiros mililitros. Ajustar o pH a 5,5 , distribuir em recipientes adequados. PRÁTICA N° 8 OBJETIVOS: • Isolar bactérias, fungos filamentosos e leveduras de ambientes diversos • Identificar morfologicamente as espécies isoladas Os microrganismos em seus ambientes naturais (água, solo, ar etc) existem como uma população mista. Para que possamos estudar uma determinada espécie de microrganismo nas suas características morfológicas e bioquímicas individuais é necessário separá-la das diversas espécies contidas nessa população , obtendo uma cultura pura e é formada por microrganismso derivados de uma única célula original. O isolamento de microrganismos requer técnicas adequadas de inoculação destes microrganismos em meios de cultura adequados que possibilitem o seu rápido crescimento, livre de contaminações. Para o cultivo, em condições laboratoriais, de microrganismos é necessário o conhecimento de suas exigências nutritivas e das condições físicas requeridas. Extensas pesquisas determinaram exigências nutritivas de muitas espécies de microrganismos e esta informação resultou no desenvolvimento de numerosos meios de cultura. Por causa da grande variedade das necessidades nutritivas dos microrganismos há, também, grandes diferenças na composição dos meios utilizados. Do mesmo modo, existem amplas variações no que se refere ao ambiente físico que favorece seu crescimento. Alguns microrganismos, por 26 exemplo crescem abaixo de 0°C; outros exigem temperatura acima de 45°C e podem desenvolver-se até mesmo a 70°C. certas bactérias necessitam do oxigênio atmosférico; outras são indiferentes ou inibidas pelo oxigênio. MÉTODO DE ISOLAMENTO DE CULTURAS PURAS • Técnica de sementeira em superfície e de esgotamento do inóculo: - Com o uso de uma alça de platina, coloca-se uma porção de espécime na superfície de um meio de cultura com ágar. - Espalhar a amostra de lado a lado, na superfície da placa , tracando linhas de acordo com as figuras 1 e 2 , de modo que as bactérias individuais se separem umas das outras. - Incubar as placas na temperatura adequada - Examinar as placas que apresentarem colônias isoladas - Selecionar uma colônia característica da espécie estudada e anotar seus aspectos macroscópicos, tais como: tamanho, forma, consistência, cor da colônia e de seu reverso, se há pigmento solúvel etc. - Transferir com a ajuda de uma alça de platina, material da colônia escolhida para um tubo contendo meio inclinado e incubar à temperatura e tempo adequados. - Examinar as características do microganismo através de observações microscópicas “in vivo” e “in vitro” com colorações específicas utilizando para isso um microscópio ótico luminoso. • Técnica da placa derramada (pour-plate): O princípio da técnica é o da diluição do material em tubos de agar liquefeito. - Transfere-se uma alça de platina da suspensão original para o tubo A (agar fundido). O tubo é rolado entre as mãos, permitindo a 27 mistura completa do inóculo com o meio. Transferências similares são efetuadas do tubo A para o B e, deste, para o C. - Os conteúdos de cada tubo são derramados em placas separada - Incubar as placas na temperatura e período de tempo adequados - Examinar as placas que apresentarem colônias isoladas - Selecionar uma colônia característica da espécie estudada e anotar seus aspectos macroscópicos, tais como: tamanho, forma, consistência, cor da colônia e de seu reverso, se há pigmento solúvel etc. - Transferir com a ajuda de uma alça de platina, material da colônia escolhida para um tubo contendo meio inclinado e incubar à temperatura e tempo adequados. - Examinar as características do microganismo através de observações microscópicas “in vivo” e “in vitro” com colorações específicas utilizando para isso um microscópio ótico luminoso. • Técnica das diluições sucessivas: se o microrganismo suspeito, numa população mista, está presente em número maior do que outros germes, pode ser obtido em cultura pura por meio de uma série de diluições em meios apropriados. - Transfere-se 1ml ou 1g do material a ser examinado para um Erlenmeyer A contendo 99ml de água estéril. Homogeniza-se permitindo a mistura completa do inóculo com a água. A partir daí, transfere-se 1ml para um tubo B com 9ml de água estéril, agita-se e repete a operação para os tubos restantes (C, D, E). Obtém-se assim uma série de diluições decimais. - De cada tubo transferir para duas placas estéreis, amostra de 1ml, depois adicionar a cada placa cerca de 15 ml de meio fundido e resfriado a 45oC; - Incubar as placas na temperatura e período de tempo adequados; - Examinar as placas que apresentarem colônias isoladas. Maiores detalhes sobre esta técnica estão no esquema apresentado na figura 2. 30 incubar à temperatura ambiente durante 5 a 7 dias. 2o DIA - Observar as colônias que cresceram e escolher colônias típicas de Streptomyces: pequenas, secas, de cores variadas. Na escolha da colônia devem ser anotados aspectos macroscópicos, tais como: tamanho, cor, forma, bordos, consistência, brilho, presença de pigmento solúvel. Transferir com alça de platina parte da colônia para um tubo com CZ e para uma placa com meio de CZ e para uma placa com AVP, fazendo nesta última uma estria no centro com auxílio de uma alça em L. Incubar. 3o DIA - Observar o crescimento no tubo de cultura. Testar a atividade anti-microbiana da cepa utilizando a placa de AVP que apresenta uma estria central; inocular diferentes germes (bactérias, leveduras) fazendo estrias perpendiculares à estria central, começando a 30 mm da estria central e terminando junto à mesma. Fazer placas testemunhas inoculando apenas as estrias de microrganismos-testes. Incubar as placas a 30o ou 37oC dependendo da temperatura dos microrganismos-testes. 4o DIA - Observar se houver inibição e medir (o halo correspondente) a distância em milímetros do crescimento do microrganismo- teste até a estria de Streptomyces. OBSERVAÇÃO: A prática deverá ser encerrada mediante a entrega do relatório e do tubo de cultura isolada. 31 ISOLAMENTO DE BACILOS ESPORULADOS DO SOLO MATERIAL Amostra de terra seca 1 Erlenmeyer com 99 ml de água estéril 1 tubos de ensaio contendo 10ml de caldo glicosado 4 tubos de ensaio contendo cada um 9 ml de água estéril 1 balão com meio de Agar Nutritivo (AN) Placas de Petri esterilizadas Tubos de ensaio com meio AN TÉCNICA 1o DIA - Pesar um grama de terra e suspender no erlenmeyer que contém água estéril. Agitar para obter uma suspensão dos microrganismos existentes. Transferir com pipeta estéril, 1 ml da suspensão para um tubo de caldo glicosado. Imergir o tubo em água fervente pelo espaço de tempo de 5 minutos. Resfriar e transferir 1 ml do caldo para um tubo com 9ml de água estéril, agitar para homogenizar e repetir a operação para mais 3 tubos. Obtém-se assim uma série de diluições decimais 10 -4 ,10 -5 ,10 -6 . De cada diluição transferir para duas placas estéreis, amostra de 1ml, depois adicionar a cada placa cerca de 15 ml de meio de AN fundido e resfriado a 45oC. Agitar para homogenizar. Esperar o meio solidificar em repouso por mais ou menos 3 minutos, inverter as placas e incubar à temperatura ambiente durante 48 horas. 32 2o DIA - Observar as colônias que cresceram e escolher colônias típicas de bacilos esporulados: grandes, com bordos irregulares, de superfície rugosa. Na encolha da colônia devem ser anotados aspectos macroscópicos, tais como: tamanho, cor, forma, bordos, consistência, brilho, presença de pigmento solúvel. Transferir com alça de platina parte da colônia para um tubo com AN e incubar à temperatura ambiente. 3o DIA - Observar o crescimento no tubo de cultura em AN. Fazer lâmina ïn vivo” para observar se há movimento. Realizar uma coloração de Gram e uma de esporos. OBSERVAÇÃO: A prática deverá ser encerrada mediante a entrega do relatório e do tubo de cultura isolada. 35 ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS COLIFORMES MATERIAL Amostra de água de banheiro, ou pedaço de queijo coalho ou carne de sol; Tubos com meio de verde-brilhante-lactose-bile (VB) Tubos de ensaio contendo caldo lactosado 1 balão com meio de Agar Nutritivo (AN) Placas de Petri com meios diferenciais (EMB ou Endo ouTTC) Tubos de ensaio com meio AN TÉCNICA 1o DIA - Inocular o tubo de Verde-brilhante com o material a ser pesquisado, incubar a 35oC por 48 horas. 2o DIA - Inocular o tubo fermentado em placas de Petri com meio diferencial seguindo um dos esquemas abaixo. Incubar à 35o C durante 48 horas. 36 3o DIA - Observar as colônias que cresceram e escolher colônias típicas de coliformes. Na escolha da colônia devem ser anotados aspectos macroscópicos, tais como: tamanho, cor, forma, bordos, consistência, brilho, presença de pigmento solúvel. Transferir com alça de platina parte da colônia para um tubo com AN e para um tubo com caldo lactosado (CL) incubar à 35oC. 4o DIA - Observar se o tubo de caldo lactosado fermentou e então se o tubo tiver dado resultado positivo (presença de bolha de ar) prosseguir a análise com o tubo de cultura com o meio de agar-nutritivo (AN). Realizar uma coloração de Gram e uma de esporos. Anotar os resultados e comparar com a literatura. OBSERVAÇÃO: A prática deverá ser encerrada mediante a entrega do relatório e do tubo de cultura isolada. 37 ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS DO IOGURTE (Lactobacillus e Streptococcus) MATERIAL Uma amostra de Iogurte natural Placa de Petri com meio de Agar-glicose-levedura (GL) Tubos de ensaio com meio de leite desengordurado Tubos de ensaio com meio de Agar-glicose-levedura (GL) TÉCNICA 1o DIA - Fundir e resfriar o meio de cultura; em seguida distribuir em placas de Petri. Quando o meio solidificar fazer estrias com o material pesquisado na superfície de cada uma das placas. Cada aluno deverá realizar a técnica de esgotamento utilizando apenas uma placa, segundo o desenho abaixo: ou então, com uma alça em L fazer estrias paralelas a partir da gota depositada na primeira placa e continuando em mais duas placas do mesmo meio, segundo o esquema abaixo: 40 escolher colônias típicas de bolores: filamentosas, grandes, de cores variadas. Na escolha da colônia devem ser anotados aspectos macroscópicos, tais como: tamanho, cor, forma, bordos, consistência, brilho, presença de pigmento solúvel. Transferir com alça de platina parte da colônia para um tubo com CZ e para uma placa com meio de CZ. Incubar. 3o DIA - Observar o crescimento da colônia gigante na placa e a partir da cultura crescida no tubo, preparar um cultivo em câmara úmida. Incubar 4o DIA - Observar a lâmina ao microscópio para determinar tipos de hifas, tipo de esporos assexuados, e se possível a classe e o gênero do fungo em estudo OBSERVAÇÃO: A prática deverá ser encerrada mediante a entrega do relatório e do tubo de cultura isolada. 41 ISOLAMENTO DE BOLORES DO MATERIAL MOFADO MATERIAL Uma amostra de pão, queijo, fruta ou outro material mofado Placa de Petri com meio de Czapeck (CZ) e Batata-glicose-agar (BGA) Tubos de ensaio com meio de CZ e BGA 1o DIA - Fundir e resfriar os meios de BGA e CZ; em seguida acidificar com ácido lático a pH 3,5. Distribuir em placas de Petri. Esperar solidificar. Com o auxílio de uma alça em agulha incubar material mofado no centro de cada um dos meios contidos em placas. Incubar à temperatura ambiente durante 5 dias. 2o DIA - ( 5 a 7 dias depois) Observar as colônias que cresceram e escolher colônias típicas de bolores: filamentosas, grandes, de cores variadas. Na encolha da colônia devem ser anotados aspectos macroscópicos, tais como: tamanho, cor, forma, bordos, consistência, brilho, presença de pigmento solúvel. Transferir com alça de platina parte da colônia para um tubo com CZ e para uma placa com meio de CZ. Incubar. 3o DIA - Observar o crescimento da colônia gigante na placa e a partir da cultura crescida no tubo, preparar um cultivo em câmara úmida. Incubar 4o DIA - Observar a lâmina ao microscópio para determinar tipos de hifas, tipo de esporos assexuados, e se possível a classe e o gênero do fungo em estudo OBSERVAÇÃO: A prática deverá ser encerrada mediante a entrega do relatório e do tubo de cultura isolada. 42 ISOLAMENTO DE FUNGOS DO AÇÚCAR CRISTAL MATERIAL Açúcar cristal Erlenmeyer com 99 ml de água estéril Balão com batata-glicose-agar (BGA) acidificado a pH 3,5 Balão com meio de Czapeck (CZ) Placas de Petri estéreis Tubos de ensaio com BGA e CZ TÉCNICA 1o DIA - Pesar 11g de açúcar e transferir para o Erlenmeyer com água estéril, agitando bem para dissolver. Transferir porções de 1 e 2 ml para placas de Petri. Os meios de cultura CZ e BGA devem ser fundidos, refriados a 45oC e em seguida acidificados com ácido lático a pH 3,5. Adicionar os meios de cultura às placas. Deixar esfriar para solidificar (2 a 3minutos) e incubar à temperatura ambiente durante 5 a 7 dias. 2o DIA - (5 a 7 dias depois) Observar as colônias que cresceram e escolher colônias típicas de bolores: filamentosas, grandes, de cores variadas. Na encolha da colônia devem ser anotados aspectos macroscópicos, tais como: tamanho, cor, forma, bordos, consistência, brilho, presença de pigmento solúvel. Transferir com alça de platina parte da colônia para um tubo com CZ e para uma placa com meio de CZ. Incubar. 3o DIA - Observar o crescimento da colônia gigante na placa e a partir da cultura crescida no tubo, preparar um cultivo em câmara úmida. Incubar 45 Incubar à temperatura ambiente por 48 horas. 3o DIA - Observar as colônias que cresceram e escolher colônias típicas de leveduras. Na encolha da colônia devem ser anotados aspectos macroscópicos, tais como: tamanho, cor, forma, bordos, consistência, brilho, presença de pigmento solúvel. Transferir com alça de platina parte da colônia para um tubo com GA e para um tubo com meio de CG. Incubar. 4o DIA - Analisar o crescimento no tubo com caldo glicosado e observar se a levedura é fermentativa. Realizar uma observação “in vivo” e com coloração simples. Anotar os aspectos microscópicos do microrganismo em estudo, tais como: tipo de reprodução (fissão, gemulação, esporulação), presença de grânulos, de vacúolos. OBSERVAÇÃO: A prática deverá ser encerrada mediante a entrega do relatório e do tubo de cultura isolada. I 46 ISOLAMENTO DE LEVEDURAS DE CALDO-DE-CANA MATERIAL Caldo de cana fermentado (24horas) Meio de glicose-agar (GA) 4 Placas de Petri estéreis Tubos de ensaio estéreis Tubos de ensaio para fermentação com caldo glicosado TÉCNICA 1o DIA - Adicionar o meios de cultura às placas. Deixar esfriar em repouso para solidificar. Com uma alça de platina, depositar uma gota do caldo na superfície do meio contido na placa de Petri e fazer estrias por esgotamento seguindo um dos esquemas abaixo: Incubar à temperatura ambiente por 48 horas. 47 2o DIA - Observar as colônias que cresceram e escolher colônias típicas de leveduras. Na encolha da colônia devem ser anotados aspectos macroscópicos, tais como: tamanho, cor, forma, bordos, consistência, brilho, presença de pigmento solúvel. Transferir com alça de platina parte da colônia para um tubo com GA e para um tubo com meio de CG. Incubar. 3o DIA - Analisar o crescimento no tubo com caldo glicosado e observar se a levedura é fermentativa. Realizar uma observação “in vivo” e com coloração simples. Anotar os aspectos microscópicos do microrganismo em estudo, tais como: tipo de reprodução (fissão, gemulação, esporulação), presença de grânulos, de vacúolos. OBSERVAÇÃO: A prática deverá ser encerrada mediante a entrega do relatório e do tubo de cultura isolada. 50 Resultados Anotar na tabela, os resultados das leituras das densidades óticas e das correspondentes contagens em placas. Após obter o número de células por contagem em placa, das diluições, relacionar num gráfico, os valores da D.O. das diversas diluições na ordenada, contra os números de microrganismos correspondentes que se determinou. Assim, obtemos uma curva de calibração para o referido microrganismo nas condições do experimento. Diluições da cultura (ml) Densidade Ótica (D.O) Concentração celular (células/ml) 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 PRÁTICA N° 10 OBJETIVOS: • Obter a concentração de células de leveduras pelo uso de câmara de contagem (câmara de Neubauer) A contagem direta por microscópio, é a mais rápida, e é levada a efeito com a contagem de organismos num volume conhecido da cultura. Esta enumeração é feita com o auxílio de lâminas espessas, conhecidas como câmaras de contagem. As mais comuns são as de Petroff-Hausser, Neubauer e as de Helber. estas câmaras apresentam uma área reticulada, com pequenos quadrados de superfície conhecida. Fazendo parte do conjunto, existe uma lamínula que recobre os pequenos quadrados, de modo que a altura destes à lamínula é conhecida. No nosso experimento, as leveduras serão contadas numa câmara de Neubauer, que apresenta uma área dividida em quadrados com 1/400mm2 ; a câmara é coberta com uma lamínula, deixando uma altura de 1/10mm, i.é., de cada quadrado à lamínula. Assim sendo o volume que fica acima de cada quadrado é de 1/4000 mm3 . 51 Esta contagem inclui organismos viáveis e mortos, sendo denominada de contagem total de células. Este método de contagem direta, tem a vantagem de fornecer um resultado quase imediato, no entanto tem a desvantagem de não se ter a distinção entre células vivas e mortas. Material - Microrganismo: Cultura de Saccharomyces cervisiae - Reagentes: Solução salina fisiológica (0,85% NaCl) -Equipamentos: Microscópio ótico comum Câmara de contagem de Neubauer Bico de Bunsen - Diversos: Pipeta Pasteur Métodos -Adicionar com uma pipeta Pasteur ou similar, uma gota da suspensão da cultura de levedura sobre a área reticulada da câmara; -colocar a lamínula sobre a gota. Alternativamente, pode-se colocar primeiro a lamínula, e deixar-se que a suspensão do microrganismo, que sai da pipeta, escorra por ação capilar sob a lamínula; - esperar cerca de dez minutos, até que o material sedimente; - usando a objetiva de 40-45X, contar as leveduras em cerca de 10 quadrados dispostos em “X” (ver figura 2). Resultados - Calcular o número de leveduras/mL, contidas em uma suspensão utiliza-se a seguinte fórmula Concentração Celular (leveduras/mL) = n x 25000 x diluição onde n= número de células dos quadrados 52 Exemplo: n = 232 diluição 1:100 Concentração celular = 232 x 25000 x 100 = 5,8 x 108 células/mL PRÁTICA 11 OBJETIVO: Determinar uma curva de calibração para a determinação da concentração da levedura Saccharomyces cerevisiae a partir do fermento prensado. INTRODUÇÃO: A partir do conhecimento do teor de matéria seca em fermento prensado comercial é possível preparar uma suspensão padrão de leveduras, de determinada concentração, com bastante confiabilidade. Através de uma série de diluições convenientes dessa suspensão padrão são obtidas novas suspensões de concentrações conhecidas. Finalmente, a turbidez provocada no meio pelas diferentes suspensões de leveduras é medida através de um instrumento adequado e os valores obtidos são relacionados com as respectivas concentrações por intermédio de uma expressão matemática. As diluições adequadas são obtidas através de tentativas de forma a abranger um intervalo de concentrações que atenda as seguintes condições: 1a .) Deve haver uma correlação linear entre a concentração e o logaritmo da trasmitância e; 2a) Os valores das transmitâncias obtidas devem estar situadas na região de maior sensibilidade na escala do instrumento utilizado. TÉCNICA: 1. Em um copo de Béquer de 50ml pesar, em balança semi-analítica, 2g de fermento prensado, anotando o valor exato. Diluir em um pouco de água e transferir, analiticamente, para um balão de 1000ml. Completar o volume e homogeneizar; 55 Espectrofotômetro Mesa agitadora (rumbeira) Balança semi-analítica - Diversos: Cubetas do espectrofotômetro Tubos de ensaio estéreis 3 Erlenmeyers, 1000ml Pipetas, 10ml MÉTODOS 1. Preparar 1,5 litros de caldo nutritivo, distribuir 500ml em 3 Erlenmeyers de 1000ml de capacidade. Adicionar no primeiro 5g de glicose, no segundo 5g de sacarose e no terceiro 5g de frutose, homogeneizar e esterilizar a 121oC por 15 minutos. Deixar esfriar; 2. Retirar uma amostra de 5-10ml de cada meio para servir como um branco; 3. Colocar os Erlenmeyers na balança semi-analítica e inocular esterilmente cerca de 0,2g a 0,4g do microrganismo Saccharomyces cerevisiae (fermento prensado); 4. Retirar 3ml de amostra com uma pipeta estéril, imediatamente após a inoculação, correspondente, portanto, ao tempo zero. Efetuar a leitura da Absorbância (ou densidade óptica). Anotar o resultado; 5. Colocar os Erlenmeyers na mesa agitadora, tendo o cuidado de fixá- los bem. Ligar a agitação a 9000 rpm. Deixá-los sob agitação durante todo o cultivo; 6. Retirar amostras de 3ml a intervalos de 1 hora, até que se observe um mínimo de três valores idênticos, ou muito próximos, de densidade óptica (DO). Anotar os resultados; 7. Construir um gráfico para cada meio de cultivo, colocando no eixo das ordenadas os valores do tempo (h) e no eixo das abcissas concentração X (g/l); 1. Calcular a velocidade específica máxima de crescimento (µmáx) o tempo de geração (G ) e a produtividade celular (∆X/∆t) em cada meio de cultivo; 1. Comparar os resultados obtidos e tirar conclusões a respeito do meio mais adequado ao crescimento. 56 Modelo de registro tabular Meio de Cultivo: Tempo (h) Densidade Óptica (DO) Concentração X(g/l) 0 1 2 3 4 5 6 7 8