Revista - Regeneração de Plantas in vitro

Revista - Regeneração de Plantas in vitro

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44Biotecnologia CiŒncia & Desenvolvimento - n” 25- março/abril 2002

Bases Fisiológicas e GenØticas da

Pesquisa Um conhecimento œtil para o desenvolvimento de protocolos biotecnológicos

LÆzaro E. P. Peres

Prof. Dr. Fisiologia Vegetal Esalq/USP Depto. de Ciencias Biológicas - LCB lazaropp@esalq.usp.br http://www.ciagri.usp.br/~lazaropp

Introduçªo

Apesar da extensa utilizaçªo da regeneraçªo de plantas in vitro em processos biotecnológicos, pouco se conhece, atØ o momento, sobre os mecanismos envolvidos na aquisiçªo de competŒncia para regeneraçªo. Pode-se dizer que, virtualmente, todos os processos tecnológicos sªo derivaçıes de conhecimentos bÆsicos adqui- ridos nos mais variados campos da ciŒncia. A Biotecnologia Vegetal tem seu corpo de conhecimentos amplamente apoiado em estudos de Fisiologia e GenØtica Vegetal, e, mais especificamente, em uma de suas importantes subÆreas o Desenvolvimento.

O termo desenvolvimento referese ao crescimento integrado das vÆrias partes de um ser pluricelular envolvendo basicamente, os processos de divisªo, expansªo e diferenciaçªo celular e a conseqüente formaçªo de tecidos, órgªos e sistemas. Plantas e animais possuem notÆveis diferenças quanto ao tipo de desenvolvimento. Enquanto praticamente todo o desenvolvimento dos animais se processa durante uma etapa denominada embriogŒnese, nas plantas essa etapa se limita à formaçªo de um eixo contendo os meristemas caulinar e radicular em pólos opostos. Por meio das atividades desses meristemas, as plantas realizam um desenvolvimento pós-embrionÆ- rio, ou seja, continuam formando órgªos (caules, raízes, folhas, flores e frutos) ao longo de todo o seu ciclo de vida. Esse tipo de desenvolvimento constitui uma estratØgia para que os vegetais possam se adaptar às variaçıes no ambiente, jÆ que sªo organismos sØsseis e, portanto, nªo podem utilizar a locomoçªo para buscar ambientes favorÆveis. Assim, quando um vegetal encontra uma condiçªo desfavorÆvel (p. ex: falta de luz) ele pode lançar mªo de seu desenvolvimento flexível para formar novos órgªos (p. ex: ramos e folhas) na direçªo em que sua sobrevivŒncia e reproduçªo fiquem garantidas.

Uma das principais características do desenvolvimento pós-embrionÆrio dos vegetais Ø justamente a separaçªo temporal entre os processos de embriogŒnese e organogŒnese. Como se

Figura 1. Adaptaçªo do modelo de Tran Thanh Van (1973) para o entendimento da determinaçªo celular. Explantes retirados de regiıes reprodutivas estªo induzidos e determinados para originar botıes florais, e explantes retirados de regiıes vegetativas originam gemas caulinares quando cultivados in vitro

Fotos e ilustraçıes cedidas pelo autor

Biotecnologia CiŒncia & Desenvolvimento - n” 25- março/abril 200245 verÆ adiante, a separaçªo temporal entre embriogŒnese e organogŒnese torna-se relevante quando se procura regenerar plantas in vitro, pois o que se faz nada mais Ø do que tentar reproduzir essas duas etapas em condiçıes artificiais. Sendo assim, como o meristema caulinar pode dar origem a um novo ramo e, nesse, novas raízes podem ser induzidas, Ø relativamente fÆcil obter uma multiplicaçªo clonal em plantas. JÆ nos animais, a propagaçªo clonal Ø muito rara e em condiçıes artificiais só Ø possível atravØs de um controle estrito da embriogŒnese. Como conseqüŒncia, enquanto as plantas sªo clonadas, desde tempos imemoriais, por processos muitos simples como a estaquia e a enxertia, a clonagem de animais Ø extremamente difícil e, no caso de mamíferos, só foi obtida recentemente por ocasiªo do nascimento da ovelha Dolly (Wilnut et al., 1997).

O controle hormonal do desenvolvimento de caules e raízes

Assim como nos animais, o desenvolvimento das plantas Ø fundamentalmente controlado por substâncias reguladoras de crescimento ou hormônios. Desse modo, apesar de as descobertas feitas atØ a dØcada de 30, principalmente no campo da nutriçªo mineral, terem possibilitado o crescimento de órgªos isolados in vitro (White, 1934), a induçªo deles em condiçıes artificiais só foi possível a partir de um conhecimento mais aprofundado acer- ca da natureza dos hormônios vegetais.

Durante a dØcada de 50, a equipe do Dr. Folk Skoog fez descobertas que foram fundamentais para a induçªo e manutençªo da organogŒnese in vitro. Naquela Øpoca jÆ se conhecia o Æcido indolil-3-acØtico (AIA), uma auxina isolada em 1934. O AIA era utilizado em meios nutritivos juntamente com constituintes complexos, como extrato de levedura e Ægua de coco, os quais pareciam conter algo tambØm essencial à organogŒnese. Essa substância essencial para a divisªo celular foi finalmente isolada por Carlos Miller em 1955 e denominada citocinina. A chamada citocinina, assim denominada por promover, juntamente com a auxina, a citocinese, propiciou, finalmente, as bases da organogŒnese in vitro. Desse modo, em 1957, Carlos Miller e Skoog demonstraram que a formaçªo de dois órgªos in vitro, caules e raízes, era controlada pelas concentraçıes relativas entre auxina e citocinina. Meios de cultura contendo um balanço auxina/ citocinina favorÆ- vel à auxina promoveram a formaçªo de raízes em calo (um aglomerado de cØlulas) de tabaco (Nicotiana tabacum). De modo inverso, balanços hormonais favorÆveis à citocinina fizeram com que fossem formadas gemas caulinares. Finalmente, balanços hormonais intermediÆrios nªo levaram a uma diferenciaçªo das cØlulas e sim a uma maior multiplicaçªo delas e conseqüente crescimento do calo (Skoog & Miller, 1957). Apesar desses resultados terem sido obtidos ainda na dØcada de 50, eles sªo plenamente corroborados em trabalhos mais recentes, onde se altera o conteœdo endógeno de auxina e citocininas em plantas transgŒnicas expressando genes bacterianos para produçªo desses hormônios. A exemplo disso, plantas de tabaco expressando o gene ipt de Agrobacterium tumefaciens possuem elevado nível endógeno de citocininas e a conseqüente intensa formaçªo de gemas caulinares ex vitro e in vitro. De modo inverso, a expressªo dos genes bacterianos iaaH e iaaM, envolvidos na biossíntese de auxina, provoca ampla formaçªo de raízes em plantas transgŒnicas. Surpreendentemente, quando se cruzam os dois tipos de transgŒnicos, o híbrido F1 tende a apresentar fenótipo igual ao tipo nªo transgŒnico. Esses estudos confirmam os resultados de Skoog e Miller (1957), os quais postularam que as concentraçıes absolutas de auxina e citocininas sªo menos importantes que suas concentraçıes relativas na induçªo de organogŒnese.

Diferenças entre organogŒnese e embriogŒnese in vitro e tipos de organogŒnese

Como dito anteriormente, o desenvolvimento das plantas Ø dividido entre organogŒnese e embriogŒnese, sendo que essa característica se reflete no processo de regeneraçªo in vitro.

A princípio, a formaçªo de embriıes a partir de tecidos somÆticos in vitro imita a embriogŒnese zigótica, que ocorre nos órgªos reprodutivos das plantas. Desse modo, tanto a embriogŒnese somÆtica quanto a zigótica culminam na formaçªo de uma planta inteira a partir de uma œnica cØlula. Contudo, em certos explantes, os embriıes somÆticos formam-se a partir da diferenciaçªo conjunta de grupos de cØlulas embriogŒnicas (Williams & Maheswaran, 1986). Como a organogŒnese normalmente envolve a regeneraçªo de gemas a partir de grupos de cØlulas meristemÆticas, hÆ casos em que Ø difícil determinar se o processo de regeneraçªo envolve organogŒnese ou embriogŒnese. Alguns critØrios para a determinaçªo do tipo de regeneraçªo sªo apresentados a seguir:

I.os embriıes somÆticos possuem sistema vascular fechado sem conexªo com o

Figura 2. Exemplo de mutaçªo homeótica em vegetais. A rosa da direita Ø o resultado de uma mutaçªo homeótica (transformaçªo de um órgªo em outro), onde os estames se converteram em pØtalas. As diferenças na coloraçªo representam mutaçıes em genes relacionados com a síntese de pigmentos

46Biotecnologia CiŒncia & Desenvolvimento - n” 25- março/abril 2002 sistema vascular do explante inicial, como ocorre na organogŒnese;

I.a estrutura formada na embriogŒnese Ø bipolar (eixo com os meristemas caulinares e radiculares). Na organogŒnese sªo formadas gemas caulinares que, mais tarde, darªo origem a raízes adventícias.

Nos dois processos de regeneraçªo, hÆ necessidade do estabelecimento de cØlulas competentes no explante inicial. Tanto as cØlulas meristemÆticas, que darªo origem às gemas caulinares, quanto as cØlulas embriogŒnicas podem se formar posteriormente ou podem estar preexistentes no explante. No caso do explante jÆ possuir cØlulas meristemÆticas ou embriogŒnicas, ocorrerÆ organogŒnese direta e embriogŒnese direta, respectivamente. Quando hÆ necessidade de desdiferenciaçªo do explante, com a conseqüente formaçªo de calo prØvia ao estabelecimento das cØlulas competentes, ocorrerÆ organogŒnese ou embriogŒnese indireta. Por simplificaçªo, a seguir iremos considerar somente o processo de organogŒnese in vitro (Consultar a Revista Biotecnologia Ed. 7 para mais informaçıes sobre embriogŒnese somÆtica).

O processo de induçªo e manutençªo da organogŒnese in vitro

A obtençªo de organogŒnese in vitro Ø atualmente um processo empírico onde sªo testados para cada espØ- cie, ou mesmo para cada variedade dentro de uma espØcie, as seguintes condiçıes: I) fonte de explante; I) composiçªo mineral do meio de cultura (e tambØm suas vitaminas e fontes de carbono); I) balanço hormonal e IV) condiçıes ambientais.

Embora seja um processo empírico, o desenvolvimento de um protocolo para organogŒnese in vitro serÆ facilitado, e, inclusive, o nœmero de variÆveis a serem testadas diminuirÆ, se forem seguidos alguns princípios e conhecimentos fisiológicos. Desse modo, quanto à fonte de explante, normalmente haverÆ maior sucesso se forem utilizados tecidos jovens, os quais possuem maior competŒncia organogenØtica. Explantes que contØm tecidos meristemÆticos sªo preferidos e eles sªo encontrados em gemas caulinares apicais e axilares. Uma ampla fonte de tecidos meristemÆticos, normalmente negligenciada, sªo as raízes, as quais possuem tecidos meristemÆticos nos Æpices, alØm de o próprio periciclo ser um tecido meristemÆtico. O fato de as raízes estarem em contato com o solo torna impraticÆvel sua desinfestaçªo, sendo elas utilizadas somente a partir de plantas preestabelecidas in vitro. Outro fator limitante Ø que algumas espØcies parece ter raízes com extrema determinaçªo para continuarem se desenvolvendo como raízes, sendo difícil nelas a formaçªo de gemas caulinares.

Diferenças significativas na capacidade organogenØtica in vitro sªo encontradas ao se variar a composiçªo mineral, as vitaminas e as fontes de açœcares dos meios de cultura. Contudo, os componentes mais críticos adicionados ao meio de cultura sªo os hormônios vegetais. Como foi visto anteriormente, os principais hormônios utilizados na organogŒnese sªo as auxinas e as citocininas. Outras classes de hormônios vegetais, como as giberelinas, o etileno e o Æcido abscísico ou mesmo substâncias que nªo sejam propriamente hormônios, como poliaminas, Æcido salicílico e jasmonatos tambØm sªo, muitas vezes, utilizados em processos de regeneraçªo por organogŒnese. Existe considerÆvel nœmero de evidŒncias de que o efeito dessas substâncias Ø indireto, atravØs da alteraçªo do balanço auxina/citocinina endógeno. O próprio efeito das auxinas e das citocininas aplicadas ao meio de cultura parece ser, na verdade, o reflexo dessas substâncias alterando os balanços endógenos de auxina/citocininas nas cØlulas vegetais (Peres et al., 1999). Esse efeito indireto Ø, inclusive, muito comum quando se utilizam auxinas sintØticas, como o 2,4 D (Æcido 2,4 diclorofenoxiacØtico), o ANA (Æcido naftaleno acØtico), ou citocininas sintØ- ticas como a benzilaminopurina (BAP), a cinetina e, sobretudo o thidiazuron. Essa œltima citocinina nªo possui a estrutura comum das citocininas, sendo um difenilurØia ao invØs de possuir um anel purínico característico do BAP, da cinetina, da isopentenil adenina (iP) e da zeatina (Z). Trabalhos realizados por Van Staden e tambØm por David Letham fornecem evidŒncias de que o thidiazuron pode atuar inibindo a enzima citocinina oxidase, a principal enzima envolvida na degradaçªo de citocininas endógenas como Z, iP e seus derivados.

Finalmente, as condiçıes ambientais influenciam notavelmente a organogŒnese in vitro. Normalmente as salas de cultivo sªo mantidas em temperatura ambiente (25° C), sendo a luz o fator ambiental que parece mais afetar a organogŒnese. Muitos protocolos de regeneraçªo sªo conduzidos no escuro, sobretudo para evitar a oxidaçªo do explante na fase de estabelecimento. Esse procedimento se baseia no fato de a enzima chave da

Figura 3. Diferenças genØticas quanto à capacidade de regeneraçªo em espØcies de Lycopersicon. A raiz gemífera de L. hirsutum. A capacidade de formar gemas caulinares em raízes ex vitro se reflete na competŒncia para regeneraçªo in vitro a partir desse tipo de explante (Peres et al., 2001). B Elevada capacidade de regeneraçªo de L. pimpinellifolium WV700 a partir de explantes caulinares, a qual Ø controlada por dois genes principais (Faria & Illg, 1996)

Biotecnologia CiŒncia & Desenvolvimento - n” 25- março/abril 200247 produçªo de compostos fenólicos, a fenilalaninamonioliase, ser dependente da luz. A luz afeta a morfogŒnese de modo mediado por fotoreceptores como o fitocromo. Um experimento que evidencia a relevância da fotomorfogŒnese na organogŒnese in vitro Ø a constataçªo de que o mutante aurea de tomateiro, o qual Ø defectivo para o gene que codifica uma enzima na formaçªo do cromóforo do fitocromo, praticamente nªo forma gemas in vitro (Lercari et al., 1999).

Apesar de serem seguidos princípios bÆsicos e de se testarem empiricamente diversos parâmetros, muitas vezes nªo se consegue a organogŒnese in vitro. Os fatores associados a esse insucesso serªo discutidos a seguir.

Fatores associados à falha na induçªo de organogŒnese in vitro

Christianson & Warnick dividiram o processo de organogŒnese in vitro nas seguintes etapas: 1) desdiferenciaçªo; 2) aquisiçªo de competŒncia; 3) induçªo; 4) determinaçªo; 5) diferenciaçªo e 6) formaçªo do órgªo (Christianson & Warnick, 1988). Essa divisªo do processo em etapas permitiu a esses autores postularem que, quando um explante falha em desenvolver organogŒnese in vitro, essa falha se dÆ normalmente na etapa de aquisiçªo de competŒncia. Contudo, pouco se conhece, atØ o momento, sobre os mecanismos envolvidos na aquisiçªo de competŒncia para organogŒnese (Kerbauy, 1999).

A aquisiçªo de competŒncia para organogŒnese

No processo de organogŒnese, a competŒncia seria entendida como a capacidade de responder ao estímulo hormonal necessÆrio à induçªo da formaçªo do órgªo. A falha de competŒncia de um tecido poderia refletir, portanto, a falta de receptores para a classe hormonal que irÆ induzir o processo organogenØtico (Carry et al., 2001). Os recentes estudos relacionados com o isolamento de genes correspondentes a receptores, principalmente de citocininas (Inoue et al., 2000), certamente contribuirªo para um melhor entendimento do processo de aquisiçªo de competŒncia organoge- nØtica.

Um outro fator associado à falta de competŒncia organogenØtica seria o próprio metabolismo hormonal do explante, pois Ø ele que determinarÆ, em œltima anÆ- lise, o balanço hormonal endógeno para induçªo da organogŒnese (Peres & Kerbauy, 1999). Desse modo, explantes com alta atividade de citocinina oxidase, enzima que degrada citocininas, podem nªo chegar a um balanço auxina/citocinina endógeno indutor da formaçªo de gemas, mesmo que sejam adicionadas elevadas concentraçıes de citocininas ao meio de cultura. De modo semelhante, explantes com elevada atividade de degradaçªo oxidativa ou de inativaçªo de auxina por conjugaçªo com açœcares e aminoÆcidos podem falhar na induçªo de raízes adventícias. O efeito diferencial dos vÆrios tipos de auxinas e citocininas quando aplicados ao meio de cultura pode ser tambØm correlacionado com o fato de cada um deles interferir de modo particular no metabolismo hormonal endógeno.

Finalmente, explantes comprometidos para vias particulares de desenvolvimento (elevada determinaçªo para formar um órgªo específico) podem falhar na alteraçªo dessa via para assumir uma outra. Um estudo clÆssico sobre determinaçªo celular foi apresentado por Mary Tran Thanh Van ao demonstrar que explantes epidØrmicos de pedœnculo floral de tabaco tendem a formar novas flores in vitro (Tran Thanh Van, 1973; Fig. 1). De modo geral, pode-se dizer que, quanto maior for a determinaçªo de um explante para uma via de desenvolvimento (por exemplo, a formaçªo de raízes) menor serÆ a competŒncia para formar outro tipo de órgªo (por exemplo, gemas caulinares). Um exemplo de tecido com baixa determinaçªo e elevada competŒncia tanto para formaçªo de raízes quanto de gemas caulinares Ø o calo. O calo Ø considerado um tecido indiferenciado, ou pouco diferenciado, podendo ser induzido, tornando-se determinado e, finalmente sofrer diferenciaçªo para formar gemas caulinares ou raízes, conforme o balanço hormonal aplicado (Skoog & Miller, 1957). Tanto a aquisiçªo de competŒncia quanto a determinaçªo sªo reflexos da expressªo diferencial de genes envolvidos nos processos de desenvolvimento. Resta saber, portanto, que tipo de genes seriam esses.

Genes envolvidos na capacidade de regeneraçªo in vitro

Figura 4. Reinterpretaçªo da hipótese proposta por Christianson & Warnick (1988) para o entendimento da competŒncia organogenØtica. Os possíveis estÆgios onde atuariam diferentes genes que influenciam a regeneraçªo sªo indicados em vermelho. Os genes de sensibilidade seriam aqueles envolvidos na percepçªo (codificaçªo de receptores) e transduçªo do sinal para auxinas (AIA, 2,4D) e citocininas (Cks). Os genes de metabolismo hormonal (que codificam enzimas de biossíntese e/ou degradaçªo de hormônios) sªo os responsÆveis pelo estabelecimento de um balanço hormonal endógeno necessÆrio para a regeneraçªo. Genes homeóticos controlam a formaçªo de órgªos e, portanto, podem estar associados à regeneraçªo de novas gemas caulinares ou raízes. A expressªo desfavorÆvel de qualquer uma dessas classes de genes seria suficiente para impedir a regeneraçªo de um determinado explante

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Como visto acima, a regeneraçªo de um explante depende tanto da sensibilidade quanto do metabolismo para uma determinada classe hormonal. Desse modo, genes associados à capacidade de regeneraçªo poderiam ser os próprios genes que codificam componentes da via de transduçªo de sinal ou as enzimas do metabolismo hormonal. AlØm disso, para que um tecido se diferencie em um determinado órgªo, faz-se necessÆrio que ele possua a capacidade de expressªo dos chamados genes mestres , que coordenam a expressªo dos vÆrios genes que serªo requeridos durante a organogŒnese. Nesse sentido, explantes que falham em formar um determinado órgªo in vitro, por estarem determinados , podem ter perdido a capacidade de expressªo de genes mestres durante um processo intenso de diferenciaçªo sofrido anteriormente. Um exemplo de gene mestre que pode estar relacionado com a capacidade de regeneraçªo Ø KNOTTED1 (Smith et. al., 1995), o qual se expressa em caules, mas nªo em explantes radiculares. O gene KNOTTED1 Ø considerado um gene homeótico, uma classe de genes que, ao sofrerem mutaçªo, podem provocar a formaçªo de órgªos em locais nªo convencionais. O primeiro gene homeótico descoberto foi ANTENNAPEDIA, um gene da mosca Drosophila, cuja mutaçªo provoca formaçªo de pernas na cabeça no lugar das antenas. Em plantas, uma mutaçªo equivalente Ø a transformaçªo de estames em pØtalas, produzindo as conhecidas rosas dobradas (Fig 2).

É interessante notar que em certas espØcies existem diferenças na capacidade de regeneraçªo in vitro que sªo controladas por poucos genes. Um modelo promissor Ø o tomateiro (Lycopersicon esculentum), cuja alta capacidade de regeneraçªo de algumas espØcies selvagens (Fig. 3) parece ser controlada por um ou dois genes dominantes (Koornnef et al., 1993; Faria & Ilgg, 1996; Peres et al., 2001). Infelizmente, ainda nªo temos informaçıes acerca da funçªo de tais genes. Contudo, diante do exposto acima, Ø razoÆvel especular que esses genes de regeneraçªo podem ser

genes mestres ou mesmo estar relacionados com a presença de receptores para hormônios vegetais e/ou podem codificar alguma enzima chave no metabolismo hormonal. Os possíveis locais onde os genes relacionados com a regeneraçªo in vitro poderiam atuar sªo apresentados na Figura 4, adaptando-se o esquema proposto originalmente por Christianson & Warnick (1988). No futuro, o conhecimento aprofundado sobre a sensibilidade, o metabolismo hormonal e seu efeito na induçªo e/ou repressªo de genes mestres que controlam a formaçªo de gemas caulinares e raízes facilitarÆ o entendimento da organogŒnese in vitro e suas aplicaçıes biotecnológicas.

ReferŒncias

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