relatorio elvis enzima sacarose

relatorio elvis enzima sacarose

INTRODUÇÃO

Os alimentos fermentados estão entre os mais antigos alimentos processados e há milênios têm formado uma parte tradicional da dieta na maioria dos países. Durante a fermentação de alimentos, a ação controlada de microrganismos selecionados é utilizada para alterar a textura dos alimentos, para preservá-los por meio da produção de ácidos ou álcool ou para produzir aromas e sabores sutis que aumentam a qualidade e o valor das matérias-primas.

As principais vantagens da fermentação como método de processamento de alimentos são:

- o uso de condições brandas de pH e temperatura que mantém (e geralmente melhoram) as propriedades nutricionais e as características sensoriais dos alimentos;

- a produção de alimentos que possuem aroma e textura que não podem ser obtidos por outros métodos;

- o baixo consumo de energia devido às condições de operação brandas e tecnologias relativamente simples.

Um dos desenvolvimentos mais recentes é a separação e a purificação de enzimas a partir de células microbianas ou de fontes animais e vegetais para o uso no processamento de alimentos. As enzimas podem ser adicionadas aos alimentos na forma de soluções concentradas ou em pó, ou imobilizadas em matérias que servem de suporte em um “reator”, onde são reutilizadas por longos períodos. Elas são utilizadas para provocar reações específicas sob condições brandas de temperatura e pHe criaram um ampla gama de aplicações na indústria de alimentos.

Pois as enzimas são proteínas especializadas na catálise de reações biológicas sob condições favoráveis de pH, temperatura, concentração do substrato, etc.. Elas estão entre as biomoléculas mais notáveis devido a sua extraordinária especificidade e poder catalítico, que são muito superiores aos dos catalisadores produzidos pelo homem. Praticamente todas as reações que caracterizam o metabolismo celular são catalisadas por enzimas.

Como catalisadores celulares extremamente poderosos, as enzimas aceleram a velocidade de uma reação, sem, no entanto participar dela como reagente ou produto.

As principais vantagens das enzimas técnicas são:

- as mudanças altamente específicas e controladas nos alimentos causadas por elas;

- a perda da qualidade nutricional mínima nas temperaturas moderadas que são empregadas;

- o menor consumo de energia, quando comparado às reações químicas correspondentes e a produção de novos produtos, que não é possível por outros métodos (FELLOWS, 2006).

Alguns microrganismos são capazes de produzir diversas enzimas de interesse industrial. Dentre esses microrganismos a levedura Saccharomycescerevisiae, popularmente conhecida como fermento de panificação, produz a enzima invertase que é capaz de hidrolisar a sacarose para produzir o açúcar invertido (mistura equimolar de glicose e frutose) que é muito utilizado pela indústria de alimentos, pois a frutose é mais doce que a sacarose (cerca de 40%) e não cristaliza tão facilmente melhorando a textura de doces e sorvetes.A invertase está presente em diversas frutas e tubérculos, como porexemplo: mamão, manga, banana, peras, maçãs, batatas entre outras,tendo grande participação nos seus processos de amadurecimento eapodrecimento (www.embrapa.br).

Figura 1 – Ação da enzima invertase na sacarose

A célula de Saccharomycescerevisiae, que utiliza glicose ousacarose como fonte de energia, é um dos biocatalisadores mais versáteise baratos. A facilidade de manuseio, que não requer nenhumcuidado especial, o faz alvo de escolha quando se deseja conduzirreações de oxidação-redução.

As aldoses são facilmente oxidáveis a ácidos aldônicos pela oxidação do grupo carbolxil/carboxilato. Essa reação costuma ser usados para determinar quantidade de açucares. Durante a oxidação do grupo aldeído de uma aldose ao sal do grupo acido carboxílico, o agente oxidante é reduzido, ou seja, o açúcar reduz o agente oxidante. Por isso que as aldoses são chamadas de açucares redutores (FELLOWS, 2006).

OBJETIVO

Determinar os parâmetros Km e Vmáx para a enzima invertase, utilizando como substrato a sacarose, mediante o estudo cinético da reação.

MATERIAIS E MÉTODOS

Materiais e Reagentes

Ácido 3,5-dinitro-salicilico

Hidróxido de sódio

Tartarato de sódio e potássio

Glicose

Sacarose

Fermento de panificação

Tubos de ensaio

Pipetas

Pêra

Banho Maria

Espectrofotômetro

Erlenmeyer

Béquer

MÉTODO

Preparo do Reagente DNS

Colocou-se 600 ml de água destilada em um béquer, depois foi diluído 10g de NaOH, diluiu-se também 10 g de acido 3,5-dinitro-salicilico lentamente, depois foi adicionado 192 g de tartarato de sódio potássio, transferiu-se para o balão volumétrico de 1 litro e foi completado com água destilada.

Extração da Enzima

Diluiu-se 4g de fermento de panificação em 20ml de água de solução tampão citrato 50mM, ph 5,0, foi posto em banho Maria à 40ºC por 30 minutos, agitando periodicamente, depois foi filtrado e coletou-se o extrato enzimático, onde foi descartado as células da levedura e guardou-se o extrato enzimático sobre refrigeração.

Preparo da Solução de Substrato

Foi preparada a solução de sacarose 40g/L a parti de 2g de sacarose em 50 ml de tampão citrato.

A partir da sacarose 40g/L foi preparada sacarose a 10g/L onde foi utilizado 2,5ml da sacarose mais 7,5 ml do tampão, 20g/L que utilizou 5ml da sacarose mais 5 ml do tampão e por ultimo preparou a sacarose a 30g/L que foi utilizado 5 ml da sacarose mais 1,66 ml do tampão.

Cinética da Reação

Foram preparados quatro tubos de ensaio com a solução de sacarose 20g/L e neste mesmo tubo foram adicionados 0,5ml de sacarose, 0,5 do extrato e 2 ml do tampão. Logo após foi colocado o tubo sob agitação no banho-maria e coletou-se 0,5ml do meio nos tempos 5, 10 e 15 minutos e adicionou-se 3 ml de DNS, após foi colocado estes tubos em ebulição por 10 minutos. Por fim, foram resfriados e homogeneizados para proceder a leitura em absorbância 540nm.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Abaixo, seguem os dados de absorbância juntamente com as concentrações da glicose para construção da curva de calibração de glicose.

Tabela 1 – Concentração de glicose (g/L) e absorbância (nm)

(g/L)

A (nm)

5

0,248

3,3

0,163

2,5

0,133

2

0,092

Gráfico 1 – Curva de calibração de glicose

A partir dos dados de absorbância dos experimentos foi construída uma curva de calibração de glicose, e posteriormente realizado o cálculo da velocidade (g/l.min). Abaixo encontra-se uma tabela com os resultados:

Tabela 2 – Concentração de substrato (g/L) e velocidade (g/L.min)

[S] (g/L)

V (g/L.min)

10

0,1502

20

0,222

30

0,351

40

0,513

De posse destes dados, foi realizado o cálculo para a inserção no gráfico de Lineweaver-Burk, conforme exemplo abaixo:

  • Concentração substrato: 10g/L

  • Velocidade: 0,1502g/L.min

O exemplo do cálculo acima,foi empregado para todas as concentrações de substrato e velocidade, obtendo a tabela abaixo:

Tabela 3 – Dados para inserção no gráfico de Lineweaver-Burk

1/[S] (g/L)

1/V (g/l.min)

0,1

6,65

0,05

4,50

0,033

2,85

0,025

1,95

Os dados acima foram inseridos no gráfico de Lineweaver-Burk:

Gráfico 2 – Representação da reta de Lineweaver-Burk utilizando os dados obtidos

A partir do gráfico, obteve-se a seguinte equação:

y = 59,85x + 0,874

utlizado para o cálculo de Vmáx

utilizado para o cálculo do Km

Determinação VMAX :

Determinação Km :

CONCLUSÃO

A partir dos cálculos realizados, foi possível determinar os parâmetros Km e Vmáx para a enzima invertase, utilizando como substrato a sacarose, mediante o estudo cinético da reação.

REFERÊNCIAS:

FELLOWS, P. J. Tecnologia do Processamento de Alimentos: princípios e prática. 2.ed. Porto Alegre: Artmed, 2006. 602p.

MOURA, C. L. A.; PINTO, G. A. S.; RODRIGUES, S. Determinação da Atividade de Invertase em Extratos Enzimáticos. Disponível em: http://www.cnpat.embrapa.br/cnpat/cd/jss/acervo/Dc_108.pdf. Acesso em: 10 mai 2013.

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