Teste de Esterilidade

Teste de Esterilidade

Teste de Esterilidade

Introdução

O primeiro método oficializado do teste de esterilidade foi na Inglaterra em 1932, mediante utilização do caldo peptonado e incubação a 37ºC durante 5 dias, com vistas à detecção de bactérias aeróbicas.

A melhoria do teste visa verificar com mais segurança a qualidade do processo esterilizante, empregado durante a fabricação de medicamentos estéreis, bem como manipulação asséptica, levando-se em consideração respectivamente o aspecto probabilístico de esterilização e o risca da recontaminação.

Condição de trabalho

A área para execução do teste muitas vezes é do tipo convencional, com antecâmara, consiste de compartimento pequeno, de fácil limpeza e desinfecção. É provida de sistema de alimentação de ar filtrado no teto, com pressão positiva, podendo ter lâmpadas germicidas.

Estas salas devem ser periodicamente limpas e desinfetadas por métodos comprovadamente eficazes, de modo a obter condições ideais para a execução do teste.

Regra geral efetua-se a exposição de placas de Petri contendo nutrientes em ambiente asséptico, embora o resultado apresente pouca informação sobre a verdadeira contaminação viável. Outra possibilidade será a filtração direta do ar.

Na sala para execução de trabalhos assépticos, a contaminação microbiana não deve ser superior a 15 partículas viáveis por metro cúbico de ar.

Para avaliação do nível de contaminação de superfícies recorre-se, normalmente, a esfregaços com cotonetes ou swabs, que posteriormente são lavados com solução fisiológica e este líquido é submetido a contagem.

O chão da sala contendo este módulo deve ser limpo semanalmente e as paredes, mensalmente.

O operador é outro fator a ser considerado como fonte de contaminação, o treinamento é de importância fundamental. O estado de saúde e higiene influenciam a qualidade dos locais de trabalho e consequentemente a segurança do ensaio propriamente dito.

Amostragem

A retirada de amostras a serem submetidas ao teste deve estar relacionada com a fase de processamento, visto que este ensaio complementa as informações sobre a perfeita execução de cada processo operacional esterilizante e/ou manipulação asséptica do produto.

A segurança do teste será tanto maior quanto maior for a quantidade de amostras ensaiadas, comprovados como eficazes. Em se tratando de matéria-prima, cada embalagem deve ser submetida à amostragem.

A Farmacopéia Européia conceitua lote como sendo coleção homogênea de frascos ou unidades preparadas de tal maneira que o risco de contaminação é o mesmo para cada um destes itens.

O que ocorre na prática consiste em retirar 20 a 40 unidades para cada lote, dependendo do volume total de cada frasco ou ampola. É pequena a vantagem em testar amostras maiores que 20 unidades.

Preparo da amostra

A execução em produtos farmacêuticos deve ser precedida de preparação das amostras, de maneira a evitar resultados falsos.

Consiste em efetuar um tratamento, visando a desinfecção da superfície externa da embalagem pelo uso de soluções anti-sépticas voláteis ou não.

As unidades assim preparadas devem permanecer em ambiente apropriado, devendo ser violadas no momento da inoculação aos meios de cultura ou da dissolução ou diluição nos líquidos diluentes.

Esta fase de preparação das amostras requer cuidados de identificação.

Método de Inoculação

Qualquer que seja a forma de inoculação da amostra, entretando, é fundamental que se avalie e comprove a sua não interferência ocasionando falso-negativo.

Inoculação direta

Consiste na inoculação de quantidades ou volumes pré-estabelecidos da amostra em volumes estipulados de diversos meios de cultura, na forma líquida ou mediante semeadura da amostra em nutriente sólido. Todas as farmacopeias indicam alíquotas a serem transferidas para o meio de cultura, a partir de cada unidade integrante da amostra representativa do lote.

Amostras sólidas ou líquidas, constituídas por substâncias antimicrobianas devem ser testadas mediantes critérios corretos, procurando-se impedir a interferência desta atividade intrínseca no crescimento dos contaminantes eventualmente presentes.

Diversos pesquisadores relatam as concentrações ideais de conservantes bem como seus inibidores específicos. Deve ser conhecida a sua atividade, a fim de que a neutralização seja completa. Amostras de produtos sob pressão, como spray, para serem testados deve ser previamente propelidos para fraco estéril.

Inoculação indireta

Baseia-se no tratamento prévio da amostra com solubilização ou lavagem em líquidos fisiológicos, seguida de filtração esterilizante e inoculação da membrana filtrante ao meio de cultura. Com isto, o produto a ser testado não entra em contato com o meio de cultura.

O método de inoculação indireta é mais susceptível à contaminação, em função de múltiplas manipulações da amostra, as condições de ambiente de teste devem ser muito bem controladas.

A prova de esterilidade, como qualquer outro processo analítico, impõe a necessidade de controle do próprio teste, sendo nesse caso através de controles negativo e positivo, além do acompanhamento das condições do ambiente durante sua execução.

Meio de cultura

A finalidade do teste consiste em detectar micro-organismos contaminantes em produtos que já sofreram algum tratamento esterilizante, durante o ciclo de fabricação. A partir desse estágio devem ser manipulados assepticamente, a fim de não violar a sua esterilidade.

Por esta razão a escolha do meio de cultura é de vital importância no sentido de oferecer condições ideais para multiplicação de micro-organismos, os mais diversos, com exigências diferentes para seu crescimento. O mínimo exigido é que se empreguem pelo menos 2 tipos de cultura, apesar de algumas farmacopeias adotarem 3 ou 4 diferentes meios nutrientes líquidos.

Outra preocupação inerente aos meios de cultura reside na comprovação de sua eficácia ou capacidade promotora de crescimento, o que deve ser verificado, pelo menos para cada lote do mesmo.

Tempo e Temperatura de Incubação

Em 1927 já se dava ênfase para necessidade de 7 dias para incubação a 37ºC. No decorrer das revisões farmacopeias houve mudanças, passando a se adotar período de 7, 10 e 14 dias de incubação.

Opção alternativa seria delegar ao fabricante o estabelecimento do período de incubação.

Interpretação

O resultado do teste, desde a época de sua oficialização, foi fundamentado em observação macroscópica do crescimento microbiano, manifestado sob a forma de turvação do meio líquido ou aparecimento de colônia no meio sólido.

A interpretação do teste em 1932 permanece quase que inalterada. A decisão da FDA é que se um tubo apresentar contaminação deve-se proceder o reteste, usando 40 unidades. Se acusar algum crescimento deve-se efetuar o segundo reteste, sendo que para aprovação do lote não deve haver crescimento nos tubos de reteste. Tanto no primeiro como no segundo retestes, se não houver crescimento, o lote será aprovado como estéril.

Controle de eficiência de esterilização

O emprego de indicadores físicos, químicos e biológicos são citados como recurso do controle do processo esterilizante. Indicadores físicos baseiam-se em temperatura de fusão dos mesmos, com alteração de cor, quando a autoclave ou forno atinge uma determinada temperatura.

Os indicadores mais aconselhados são os biológicos. Estes são esporos de cepas de micro-organismos devidamente selecionados quanto à resistência ao processo esterilizante. Devem ser espécies menos susceptíveis a um determinado processo, seja físico ou químico.

A ausência de crescimento é indicação de que o processo foi eficiente sobre os os micro-organimos. Permite-se, então, afirmar que houve eficiência esterilizante. A eficiência pode ser medida de três maneiras: pelo histórico do processo, pelos estudos de inativação de uma séries de micro-organismos e pelo uso de indicadores biológicos.

A utilização de indicadores biológicos deve ser criteriosa, inoculando-se o próprio produto com os mesmo, de modo a assemelhar-se ao máximo à condição em que se encontra o contaminante natural frente ao processo. A utilização de monitores biológicos permite excluir dúvidas sobre o teste falso-positivo, pois, a negatividade do controle inoculado, sem manifestação de crescimento, elimina totalmente a questão.

A estabilidade dos indicadores pode ser muito variável, razão pela qual se aconselha a preparação das suspensões dos esporos no próprio laboratório.

Validação do teste de esterilidade

Deve ser estabelecida e documentada, demonstrando as características de exatidão, sensibilidade, especificidade e reprodutibilidade.

Qualificação da instalação

A qualificação da instalação conduz a necessidade de certificação da área onde se executam os testes, incluindo os filtros, capelas de fluxo laminar e utilidades disponíveis e empregadas durante o procedimento.

Qualificação operacional

Inclui a qualificação do operador, do equipamento e dispositivo de teste. A qualificação do operador impõe que o mesmo seja experiente e receba o tratamento para o trabalho específico.

Esterilidade dos meios de cultura, fluídos e dispositivos auxiliares

Devem ter sua esterilidade comprovada, de forma a conferir segurança quanto à ausência de falso-positivo.

Para os meios de cultura deve-se ter o controle da procedência e lote de fabricação, e obediência aos parâmetros do processo esterilizante.

Equipamentos e dispositivos auxiliares deverão ser avaliados e empregando meios de cultura comprovadamente estéreis.

Capacidade promotora de crescimento dos meios de cultura

Farmacopeias atuais orientam que seja avaliada a capacidade promotora de crescimento. Micro-organismos adicionais podem ser também adotados, quando detectados de forma típica nos produtos ou no ambiente produtivo.

Bateriostase e Fungistase

Certos produtos contém agentes bacteriostáticos ou fungistáticos que, se não forem neutralizados, irão inibir o crescimento dos micro-organimos viáveis presentes no produto, conduzindo a resultados falso-negativos.

A neutralização dos agentes antimicrobianos desses produtos pode ser obtida via diluição, reação química, filtração ou uma combinação destes métodos. Deve ser obtida a neutralização das propriedades antimicrobianas sem sacrificar a recuperação de micro-organismos viáveis.

Considerações finais

Das últimas décadas houve evolução na metodologia, entretanto, existem ainda pontos fundamentais que constituem a limitação do método. É por isso que se deve controlar as condições de produção, bem como efetuar testes nos diluentes, a fim de obter informações seguras sobre o procedimento de fabricação dos mesmos.

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