Bioquimica: Metabolismo do nitrogênio.

Bioquimica: Metabolismo do nitrogênio.

(Parte 1 de 4)

1 Metabolismo do Nitrogênio

O nitrogênio é um elemento essencial encontrado em proteínas, em ácidos nucléicos e em outras biomoléculas. Apesar do importante papel que exerce nos organismos vivos, o nitrogênio utilizado biologicamente é escasso. Embora o nitrogênio molecular (N2) seja abundante na biosfera, ele é quase inerte quimicamente. Portanto, a conversão do N2 para a forma utilizável necessita gasto de energia. Certos microorganismos podem reduzir o N2 para formar NH3 (amônia). As plantas e os microorganismos absorvem NH3 e −3NO (íon nitrato), o produto de oxidação da amônia. As duas moléculas são usadas para a síntese de biomoléculas contendo nitrogênio. Os animais não sintetizam moléculas contendo nitrogênio a partir de amônia e nitrato. Em lugar disso, eles obtêm “nitrogênio orgânico”, (principalmente aminoácidos) da dieta. Em uma complexa série de vias, os animais usam o nitrogênio dos aminoácidos para sintetizar vários compostos orgânicos.

O nitrogênio é encontrado em inúmeras biomoléculas, como por exemplo, aminoácidos, bases nitrogenadas, porfirinas e alguns lipídeos. Muitos metabólitos contendo nitrogênio são necessários em pequenas quantidades (ex.: aminas biogênicas e glutationa).

1.1 Fixação de nitrogênio

Várias circunstâncias limitam a utilização do nitrogênio atmosférico nos seres vivos. Devido a estabilidade química do nitrogênio molecular atmosférico, a redução do N2 até íon amônio (+4NH) (denominado fixação do nitrogênio) necessita de grande quantidade de energia. Por exemplo, no mínimo 16 ATP são necessários para reduzir um N2 a duas NH3. Além disso, somente alguns procariotos podem “fixar” nitrogênio. Entre eles estão as bactérias (Azotobacter vinelendii e Clostridium pasteurianum), as cianobactérias (Nostoc muscorum e Anabaena azollae) e as bactérias simbiontes (várias espécies de Rhizobium) localizadas em nódulos de raízes de plantas leguminosas como soja e alfafa.

As espécies fixadoras de nitrogênio possuem um complexo da nitrogenase, cuja estrutura consiste de duas proteínas chamadas dinitrogenase e dinitrogenase−redutase. A dinitrogenase (MoFe−proteína) é um α2β2-heterotetrâmero que contêm dois átomos de molibdênio (Mo) e 30 átomos de ferro. A dinitrogenase−redutase (Fe−proteína) é um dímero de

320 • MOTTA • Bioquímica subunidades idênticas. O complexo da nitrogenase catalisa a produção de amônia a partir do nitrogênio molecular:

São necessários oito elétrons para a reação: seis para a redução do N2 e dois para produzir H2. Os dois componentes do complexo da nitrogenase são inativados irreversivelmente pelo oxigênio e, porisso, muitas bactérias fixadoras de oxigênio ficam confinadas em ambientes anaeróbicos. Em condições fisiológicas, a amônia existe principalmente na forma protonada, +4NH (íon amônio) (pK’ 9,25).

A. Nitrificação e desnitrificação

O nitrogênio biologicamente útil também é obtido a partir do íon nitrato (−3NO) presente na água e no solo. O nitrato é reduzido a íon amônio pelas plantas, fungos e muitas bactérias. Primeiro, a nitrato−redutase catalisa a redução de dois elétrons do íon nitrato a íon nitrito (−2NO):

−3NO + 2H+ + 2 e− → −2NO + H2O A seguir, a nitrito−redutase converte o nitrito a íon amônio:

O nitrato é também produzido por certas bactérias que oxidam o +4NH a

−2NO e a seguir até −3NO, em processo chamado nitrificação. Outros organismos convertem o íon nitrato e o íon nitrito de volta a N2 para a atmosfera, em mecanismo chamado desnitrificação. Todas essas reações constituem o ciclo do nitrogênio. (Figura 1.1).

Figura 1.1

NO3 Nitrato

NO2 Nitrito

Nitrato redutase

Nitrificação

Desnitrificação

Nitrito redutase

NitrogenaseFixação do nitrogênio

Aminoácidos Nucleotídeos Fosfolipídeos

Ciclo do nitrogênio. A fixação do nitrogênio converte N em íon amônio útil biologicamente. O nitrato também pode ser convertido a íon amônio. A amônia é transformada de volta a N por nitrificação seguida por desnitrificação.

B. Incorporação de íons amônio em aminoácidos

Existem duas vias principais para a incorporação de íons amônio para formar aminoácidos e, a seguir, outras biomoléculas: (1) aminação redutiva de α−cetoácidos e (2) formação de amidas de ácido aspártico e de ácido glutâmico com a subsequente transferência do nitrogênio amida para formar outros aminoácidos.

A glutamato−desidrogenase, uma enzima encontrada na mitocôndria e citoplasma de células eucarióticas e em algumas bactérias, catalisa a incorporação de íons amônio ao α−cetoglutarato:

Em eucariotos, a desidrogenase também libera íons amônio para a excreção de nitrogênio a partir do glutamato proveniente, sobretudo, das reações de transaminação. Como a reação é reversível, o excesso de amônia promove a síntese de glutamato. A glutamato−desidrogenase é uma enzima alostérica ativada pelo ADP e o GDP, e inibida pelo ATP e o GTP. Os íons amônio são também incorporados ao glutamato para formar glutamina em presença da glutamina−sintetase, enzima encontrada em todos os organismos. Nos microrganismos, é um ponto crítico de entrada para a fixação de nitrogênio. Em animais, é a principal via de conversão de íons amônio – compostos altamente tóxicos – em glutamina para ser transportada no sangue. Na primeira etapa da reação, o ATP doa um grupo fosforil para o glutamato. A seguir, os íons amônio reagem com o intermediário (γ−glutamil−fosfato), deslocando o Pi para produzir glutamina.

O nome sintetase indica que o ATP é consumido na reação.

O cérebro, uma fonte rica em glutamina−sintetase, é especialmente sensível aos efeitos tóxicos de íons amônio. As células do cérebro convertem íons amônio em glutamina, uma molécula neutra e não−tóxica.

CH+ NH

CH 2

COO 2

CO

-Cetoglutaratoα

CH+ H O

Glutamato-desidrogenase COO

H NC H3

COO Glutamato

Glutamato

ATP ADP NH4 Pi COO

H NC H2

2CH

H NC H2

2CH

-Glutamil-fosfato

H NC H2

2CH

ON H2 Glutamina

322 • MOTTA • Bioquímica

A glutamina é, então, transportada ao fígado, onde ocorre a produção de compostos nitrogenados para a excreção.

Em muitos organismos, a glutamina e o glutamato estão presentes em concentrações mais elevadas que outros aminoácidos, o que é consistente com seu papel de carreador de aminoácidos. Sendo assim, a atividade da glutamina−sintetase é fortemente regulada para manter o suprimento adequado de aminoácidos. Por exemplo, a glutamina−sintetase dodecamérica da E. Coli é regulada alostericamente e por modificação covalente.

Em bactérias e vegetais, a enzima glutamato−sintase catalisa a aminação redutiva do α−cetoglutarato empregando a glutamina como doadora de nitrogênio e o NADH2 como doador de elétrons (exemplo, em raízes e sementes) e, em algumas plantas, a ferrodoxina reduzida (exemplo, em folhas):

(as reações catalisadas pelas sintases não requerem ATP). O resultado das reações da glutamina−sintetase e glutamato−sintase é α−Cetoglutarato + +4NH + NADPH + ATP → glutamato + NADP+ + ADP + Pi

Em resumo, a ação combinada das duas reações incorpora o nitrogênio

(íon amônio) em um composto orgânico (α−cetoglutarato, um intermediário do ciclo do ácido cítrico) para produzir aminoácidos (glutamato). Os mamíferos não possuem a glutamato−sintase, mesmo assim, as concentrações de glutamato nesses organismos são relativamente altas porque o aminoácido é produzido por outras reações.

1.2 Transaminação

As transaminases (também chamadas amino−transferases) catalisam a transferência reversivel de grupos α−amino de um aminoácido para um α

−cetoácido para produzir um α−cetoácido do aminoácido original e um novo aminoácido. Por exemplo:

CH+2
OC

-Cetoglutaratoα

CH CH2

H NC H3

ON H2 Glutamina

Glutamato sintase COO CH

CH+2
H NC H3

CH CH 2

H NC H3

COO Glutamato

As transaminases requerem piridoxal−5−fosfato (PLP) como coenzima. Este composto é a forma fosforilada da piridoxina (vitamina B6):

A PLP está covalentemente ligada ao sítio ativo da enzima via base de

Schiff (R’−CH=N−R, uma aldimina) ligada ao grupo ε-amino do resíduo de lisina:

Forças estabilizadoras adicionais incluem interações iônicas entre as cadeias laterais de aminoácidos e o anel piridinium e o grupo fosfato.

As reações de transaminação exercem papeis centrais tanto na síntese como degradação dos aminoácidos. Além disso, essas reações envolvem a interconversão de aminoácidos a piruvato ou ácidos dicarboxílicos, e atuam como ponte entre o metabolismo dos aminoácidos e os carboidratos.

Enzima-PLP (base de Schiff)

3O CHN

CH2 CH2

CH2

CH2 Enzima

CH2

O PO H C3

5 ´ 4 ´

Pirodoxal-5- fosfato (PLP)´

HOH C3

Pirodoxina (vitamina B )6

Glutamato (Aminoácido)

CH+ O C
H NC H2

CH2 COO

CH3

CH+

Transaminase

OC

CH2

Piruvato

( -Cetoácido)

-Cetoglutarato ( -Cetoácido)

H NC H3

Alanina (Aminoácido)

324 • MOTTA • Bioquímica

Figura 1.2 Papel do piridoxal -5’-fosfato na transaminação.

OP O
CN Enzima

CH3

+RC C C O
HH O
HNH3

-Aminoácido

H O2H O2

RC C C O
HH O

Base de Schiff

OP O
RC C C O
OP O
RC C C O

Cabânion Intermediário quinonóide H

OP O
RC C C O
OP O
RC C C O
+OP O

-Cetoácido O

NH2

Piridoxamina-fosfato

Piridoxal-fosfato

1.3 Aminoácidos essencias e não−essencias

Os aminoácidos diferem de outras classes de biomoléculas pois cada membro é sintetizado por via única. Apesar da diversidade das vias sintéticas, o esqueleto carbonado de cada aminoácido é derivado dos mesmos intermediários metabólicos: o piruvato, o oxalacetato, o α−cetoglutarato e o 3−fosfoglicerato. A tirosina, sintetizada a partir da fenilalanina, é uma exceção.

Os aminoácidos sintetizados em quantidades suficientes por mamíferos a partir da amônia e de esqueletos carbonados, são denominados não−essenciais; ou seja, eles eståo disponíveis para as células mesmo quando não incluídos na dieta. Por outro lado, os aminoácidos essenciais são aqueles não sintetizados ou sintetizados em velocidade inadequada às necessidades metabólicas do organismo e, portanto, devem ser ingeridos na dieta. Os aminoácidos essenciais e não−essenciais estão listados na Tabela 1.1.

Tabela 1.1 – Aminoácidos essenciais e não−essenciais no homem

Essenciais Não−essenciais

Arginina Alanina Histidina* Asparagina Isoleucina Aspartato Leucina Cisteína Lisina Glutamato Metionina Glutamina Fenilalanina Glicina Treonina Hidroxiprolina Triptofano Prolina Valina Serina Tirosina

* A histidina é essencial no mínimo até os 12 anos de idade

As fontes exógenas de proteínas diferem consideravelmente em suas proporções de aminoácidos essenciais. Em geral, os aminoácidos essências são encontrados em maior quantidade em proteínas de origem animal (exemplo, carne, leite e ovos). As proteínas vegetais muitas vezes são carentes de um ou mais desses aminoácidos. Por exemplo, a gliadina (proteína do trigo) tem quantidade insuficiente de lisina enquanto a zeína (proteína do milho) tem baixo conteúdo de lisina e triptofano. Como as proteínas vegetais diferem em sua composição de aminoácidos, é possível obter aminoácidos essenciais em quantidades apropriadas a partir da combinação de diversos vegetais. Por exemplo, o feijão (metionina baixa) associado com cereais (lisina baixa).

As rotas biossintéticas para a produção de aminoácidos não−essenciais são descritas a seguir. Ao considerar estes processos, deve-se compreender que se algum destes aminoácidos for excluido da dieta, pode ocorrer uma elevada demanda de aminoácidos essenciais, pois parte destes últimos são utilizados na síntese de não−essenciais. Por exemplo, a tirosina é classificada como não−essencial pois é formada a partir da fenilalanina. Entretanto, na ausência de tirosina exógena, a quantidade de fenilalanina necessária aumenta significativamente.

326 • MOTTA • Bioquímica

A. Biossíntese de aminoácidos não−essenciais

Em mamíferos, os aminoácidos não−essenciais são sintetizados a partir de várias fontes, tais como, os aminoácidos essenciais (tirosina por hidroxilação da fenilalanina) ou de intermediários metabólicos comuns: o piruvato, o oxalacetato, o α−cetoglutarato e o 3−fosfoglicerato.

Alguns aminoácidos são formados por reações de transaminação. Por essa via, a alanina é produzida a partir do piruvato, o glutamato a partir do α−cetoglutarato e o aspartato a partir do oxaloacetato. A glutamina−sintetase catalisa a amidação do glutamato para produzir glutamina. A asparagina−sintetase, emprega a glutamina como doador de grupo amino e converte o aspartato em asparagina:

Somente três intermediários metabólicos (piruvato, oxaloacetato e α−cetoglutarato) fornecem cinco dos dez aminoácidos não−essenciais por reações de transaminação e amidação. Vias mais complexas convertem glutamato em prolina e arginina:

A serina tem como precursor a 3−fosfoglicerato, um intermediário da glicólise. A síntese ocorre em três reações:

Glutamato

H NC H2

CH2 COO Arginina

H NC H2

CH2

CH2

H C2CH2

CH

CH2 COO

Prolina

Aspartato

H NC H2

Glutamina + ATP

Glutamato +

AMP + P i

Asparagina-sintetase

Asparagina

H NC H2

A serina, um aminoácido com três carbonos, produz glicina com dois carbonos em reação catalisada pela serina−hidroximetil−transferase (a reação reversa converte glicina em serina). A enzima emprega um mecanismo dependente de piridoxal−5’−fosfato (PLP) para remover o grupo hidroximetil (−CH2OH) ligado ao carbono α da serina; o fragmento de um carbono é então transferido para o co−fator tetrahidrofolato (THF)

(ver Seção 1.1.b).

O esqueleto carbonado da serina é utilizado para a síntese de cisteína. A reação envolve a condensação da serina com a homocisteína para formar cistationina que por clivagem produz cisteína, α−cetobutirato e amônia. Estas reações são catalisadas pela cistationina−β−sintetase e cistationina−β −liase, respectivamente:

A homocisteína é derivada da metionina pela formação do intermediário S−adenosilmetionina. A transferência do grupo metila deste último, libera a S−adenosil−homocisteína, que é clivada à homocisteína. Enquanto os carbonos da cisteína são derivados da serina, o enxôfre é obtido unicamente a partir da metionina (em processo denominado transsulfuração). Restrição de cisteína na dieta deve ser compensada por um aumento na ingestão de metionina.

B. Biossíntese de aminoácidos essencias

Os aminoácidos essenciais são sintetizados por vias que necessitam várias etapas. Em algum ponto da evolução, os animais perderam a capacidade de sintetizar esses aminoácidos, provavelmente porque as vias consumiam muita energia e os compostos já existiam em alimentos. Em

Tetraidrofolato

Serina

H NC H

Metileno-tetraidrofolato

Serina-hidroximetil-transferase Glicina

H NC H

Serina

H NC H + 2
H NC H2

CH2 SH

H O2CH COO

H NC H 2
H NC H2

CH2 NH4+H O2CH

H NC H + 2

CHCOO 2

CH3

OC

Homocisteína Cistationina Cisteína -Cetobutirato

HC OH

CH OPO22 3

COH

CH OPO22 3

Glutamato -Cetoglutarato Pi COO

H NC H

CH 2 3

H NC H

CH OPO22 3

3-Fosfoglicerato 3-Fosfohidroxipiruvato 3-Fosfosserina Serina

328 • MOTTA • Bioquímica resumo, os humanos não sintetizam aminoácidos ramificados ou aromáticos e, também, não incorporam enxôfre em compostos como a metionina.

Foi descrito acima que a síntese da cisteína em mamíferos necessita um átomo de enxôfre derivado, em última instância, da metionina. Em bactérias, a síntese de metionina requer um átomo de enxôfre derivado da cisteína. O enxôfre proveniente do sulfeto inorgânico substitui o grupo acetila da O−acetilserina (obtida por acilação da serina) para produzir cisteína..

A cisteína doa, então, o átomo de enxôfre para a homocisteína, cujo esqueleto de quatro carbonos é derivado do aspartato. A etapa final da síntese da metionina é catalisada pela metionina−sintase, que adiciona à homocisteína um grupo metila transportado pelo tetrahidrofolato;

Em humanos, níveis elevados de homocisteína no sangue estão associados com a doença cardiovascular. A relação foi inicialmente descoberta em indivíduos com homocistinúria, uma desordem em que o excessso de homocisteína é excretada na urina. Esses indivíduos desenvolvem aterosclerose ainda crianças, provavelmente porque a homocisteína danifica diretamente as paredes dos vasos sangüíneos mesmo em ausência de teores elevados de LDL. Aumentos na ingestão de folato, a vitamina precursora do tetraidrofolato, reduz o nível de homocisteína pela sua conversão em metionina.

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