Incidência fúngica e contaminações por micotoxinas em grãos de híbridos comerciais de milho em função da umidade de colheita

Incidência fúngica e contaminações por micotoxinas em grãos de híbridos comerciais...

(Parte 1 de 3)

híbridos comerciais de milho em função da umidade de colheitahíbridos comerciais de milho em função da umidade de colheitahíbridos comerciais de milho em função da umidade de colheitahíbridos comerciais de milho em função da umidade de colheita

Incidência fúngica e contaminações por micotoxinas em grãos de Incidência fúngica e contaminações por micotoxinas em grãos de Incidência fúngica e contaminações por micotoxinas em grãos de Incidência fúngica e contaminações por micotoxinas em grãos de

Odair José Marques1*, Pedro Soares Vidigal Filho2, Valdecir Antoninho Dalpasquale2, Carlos Alberto Scapim2, Luiz Fernando Pricinotto2 e Miguel Machinski Júnior3

1 Programa de Pós-graduação em Agronomia, Universidade Estadual de Maringá, Av. Colombo, 5790, 87020-900, Maringá,

Paraná, Brasil. 2 Departamento de Agronomia, Centro de Ciências Agrárias, Universidade Estadual de Maringá, Maringá,

Paraná, Brasil. 3 Laboratório de Toxicologia, Departamento de Análise Clínicas, Centro de Ciências Biológicas, Universidade

Estadual de Maringá, Maringá, Paraná, Brasil. *Autor para correspondência. E-mail: ojmarques@gmail.com

RESUMO. O objetivo deste trabalho foi avaliar a incidência de fungos dos gêneros Aspergillus, Fusarium e Penicillium e as contaminações com micotoxinas em grãos de cinco híbridos comerciais de milho em função da umidade de colheita. O trabalho foi conduzido em Astorga, Estado do Paraná, durante o período da ‘safrinha’ de 2007 e da safra de ‘verão’ de 2007/2008. As amostras de grãos, colhidas em cinco épocas distintas e em cinco repetições, foram submetidas à determinação de umidade pelo método da estufa a 103 ± 1ºC por 72h. O teste de sanidade Blotter test e a quantificação micotoxinas (método da cromatografia em camada delgada) foram efetuados, utilizando-se um delineamento inteiramente casualizado. Os resultados obtidos foram submetidos à análise de variância e de regressão. O gênero Fusarium apresentou crescimento linear da incidência, em função do aumento da umidade, enquanto os gêneros Aspergillus e Penicillium tiveram suas incidências reduzidas. Observou-se que é possível a produção de aflatoxinas, associadas aos grãos de milho, ainda no campo, e que a antecipação da colheita, seguida de secagem imediata, assegura a qualidade sanitária dos grãos de milho.

Palavras-chave: Zea mays L., pós-colheita, qualidade, aflatoxinas, zearalenona.

ABSTRACT. Fungal incidence and mycotoxins in grains of commercial corn hybrids as a function of crop moisture content. The objective of this work was to evaluate the incidence of Aspergillus, Fusarium and Penicillium fungi, and the contaminations with mycotoxins in grains of five corn commercial hybrids due to harvest humidity. The work was conducted in Astorga, Paraná State, during the autumn/fall harvest of 2007 and the summer harvest of 2007/2008. The corn grain samples were collected in five distinguished periods and also in five replications, subjected to humidity content determination at an oven heated to 103 ± 1ºC for 72h. The blotter test and the mycotoxins presence were evaluated by thin layer chromatography, using a completely randomized design. The data were submitted to analyses of variance and regression. The genera Fusarium presented linear increasing incidence due to humidity increasing, whereas Aspergillus spp. and Penicillium spp. had their incidences decreased. It was observed that the possible production of aflatoxins, associated to corn grains, still in the field, and, that the anticipation of the crop harvesting, followed by immediate drying assures the sanitary quality of the corn grains.

Key words: Zea mays L., post-harvest, quality, aflatoxins, zearalenone.

IntroduçãoIntroduçãoIntroduçãoIntrodução

O milho constitui parte essencial da base alimentar dos seres humanos, seja pelo seu consumo direto, na forma de milho verde, milho em conserva, milho pipoca, fubá, farinha, amido e outros produtos, ou indireto, tanto como produtos de origem animal quanto como produtos industrializados (BROOKER et al., 1992; TRENTO et al., 2002; SILVA et al., 2007).

O Brasil se destaca no cenário obal, ocupando o terceiro lugar na produção mundial de milho. Entretanto, o sistema de produção brasileiro apresenta elevados índices de perdas de qualidade de grãos. Estas perdas são causadas, em sua maioria, por danos físicos ocorridos durante as operações de colheita, transporte, secagem, beneficiamento e armazenamento, por fatores climáticos, por agentes biológicos e pela própria respiração dos grãos (BROOKER et al., 1992; BRASIL,

Neste contexto, seria conveniente que a colheita ocorresse logo após a maturidade fisiológica, quando os grãos de milho apresentam máxima qualidade, máximo acúmulo de massa seca e baixa incidência de fungos toxigênicos (EGLI; TEKRONY, 1997;

668 Marques et al.

SAINI; WESTGATE, 1999). Entretanto, nesta fase, os grãos ainda apresentam elevado teor de umidade, o que torna inviável a colheita mecanizada, em função da dificuldade de debulha, decorrente do excesso de partes verdes e úmidas das plantas, fato que causa severas injúrias mecânicas por amassamento dos grãos (ALVES et al., 2001).

Por outro lado, o milho colhido com umidades inferiores a 18% tende a perder massa seca no campo por respiração (BROOKER et al., 1992). Além disto, os grãos podem sofrer maiores injúrias dos mecanismos de debulha, gerando trincas no endosperma e escarificações no pericarpo do grão ou mesmo a ruptura do endosperma, expondo seu conteúdo à ação de fungos e de insetos, com reflexos negativos na potencialidade de armazenamento como, por exemplo, a redução da massa específica e a formação de micotoxinas (FARIAS et al., 2000; RADÜNZ et al., 2006).

A qualidade dos grãos de milho é alterada direta ou indiretamente quando estes são infectados por fungos, pela produção de micotoxinas, que ocasionam danos à saúde tanto humana quanto animal em razão da atividade tóxica que podem exercer sobre o organismo (FARIAS et al., 2000; KUMAR et al., 2008). Em geral, a deterioração dos grãos começa ainda no campo, onde, por conveniência econômica, o produto é mantido na planta até a secagem, prática esta que é largamente utilizada pelos agricultores, uma vez que requer o mínimo de investimento. Todavia, esta prática pode resultar no início de elevadas infestações de fungos e de pragas de grãos armazenados (MILLER, 1995; RESNIK et al., 1996; REID et al., 1999; NESCI et al., 2003).

A presença de fungos dos gêneros Aspergillus e

Penicillium é um indicativo da deterioração das sementes ou grãos de cereais e oleaginosas, e estes patógenos promovem danos ao embrião, descoloração, alterações nutricionais e perda da massa seca (SINHA; SINHA, 1991; MILLER, 1995).

O milho é um substrato perfeito para contaminação fúngica, uma vez que o amido é o componente principal do grão (BANKOLE; ADEBANJO, 2003). Segundo Farias et al. (2000), a contaminação por fungos com potencial toxigênicos, tais como Aspergillus spp., Fusarium spp. e Penicillium spp., pode ocorrer em grãos de milho aparentemente sadios.

Almeida et al. (2000) avaliaram a microbiota fúngica em amostras de três híbridos de milho recém-colhidos, provenientes de três regiões distintas do Estado de São Paulo. Os autores encontraram, em média, 71,1; 46,7 e 2,7% de incidência de Fusarium spp., Penicillium spp. e Aspergillus spp., respectivamente, indicando a predominância destes três gêneros sobre outras espécies fúngicas, e concluíram que fatores abióticos, tais como o teor de umidade nos grãos de milho, a atividade de água, a precipitação pluvial e a temperatura do ar influenciam diretamente no nível de contaminação fúngica, bem como na potencialidade toxigênica das cepas de Aspergillus flavus e de Fusarium moniliforme quanto à produção de micotoxinas.

Dilkin et al. (2000) encontraram contaminações de 23,6; 57,1 e 14,3% de Aspergillus sp., Fusarium sp. e Penicillium sp., respectivamente, em grãos de cinco híbridos de milho recém-colhidos, com 18% de umidade, em Santa Maria, Estado do Rio Grande do Sul. Os autores constataram, ainda, que o consumo médio de massa seca dos grãos de milho foi de 1,2 e 2,69%, nos períodos de 5 e 10 dias, respectivamente, de incubação do fungo Aspergillus parasiticus.

Kikuti et al. (2003), trabalhando com sementes de duas variedades de milho de polinização livre, encontraram infestações de 31,0 e 98,7% de Fusarium graminearum e de Penicillium sp., respectivamente, na variedade BRS106, enquanto que, na variedade AL 25, as infestações foram na ordem de 4,8; 100; 0,67 e 0,3% com os fungos F. graminearum, Penicillium sp., Aspergillus niger e A. flavus, respectivamente.

Santin et al. (2004), avaliando o efeito do retardamento da colheita de milho na incidência de grãos ardidos e de fungos patogênicos, constataram que a permanência prolongada das espigas de milho na planta, após a maturidade fisiológica, influenciou na redução da incidência de Fusarium moniliforme, seguindo a redução da umidade presente nos grãos. Por outro lado, os autores observaram que houve aumento da incidência de F. graminearum e de espécies dos gêneros Aspergillus e Penicillium, quando os grãos foram colhidos com umidades menores.

Marin et al. (1998) afirmam que o gênero Fusarium se correlaciona negativamente com os gêneros Aspergillus e Penicillium, ou seja, as espécies de Fusarium infectam e colonizam, preferencialmente, substratos com teores de umidade maiores, ao contrário do que ocorre com os gêneros Aspergillus e Penicillium que se desenvolvem melhor em umidades menores.

Diante do exposto, o presente trabalho teve por objetivo avaliar a incidência de fungos dos gêneros Aspergillus, Fusarium e Penicillium e a ocorrência de contaminações por micotoxinas em grãos de cinco híbridos comerciais de milho, em função da umidade de colheita.

Contaminação fúngica em híbridos de milho 669

Material e métodosMaterial e métodosMaterial e métodosMaterial e métodos

As amostras de grãos de milho foram coletadas na Fazenda Renascer, no município de Astorga, Estado do Paraná, durante os períodos de outono/inverno de 2007 (‘safrinha’) e de verão de 2007/2008 (safra de ‘verão’), em uma área de lavoura comercial de milho homogênea, situada em área plana e distante de matas, no mínimo 50 m.

Por se tratar de lavoura comercial de milho, a escolha dos híbridos cultivados foi livre e exclusiva do produtor, não havendo qualquer interferência deste trabalho nos critérios da mesma, bem como, na condução da lavoura, limitando-se apenas à demarcação e colheita das plantas na área de coleta.

Na ‘safrinha’, os híbridos avaliados foram o 2B587, o 2B688 e o 2B710, pertencentes à empresa Dow AgroSciences, o primeiro apresentando grãos de textura semidentada e coloração amarela alaranjada, e os dois últimos, textura de grãos semidura e coloração alaranjada e amarela alaranjada, respectivamente.

Na safra de ‘verão’, os híbridos avaliados foram o 2B707, o 2B710 (ambos da Dow AgroSciences) e o Impacto de propriedade da Syngenta, e os três apresentam grãos com textura semidura. Os grãos dos híbridos 2B707 e Impacto possuem coloração alaranjada.

Por ocasião da colheita, tanto as lavouras de soja, quanto as de milho da Fazenda Renascer estavam aptas ao referido processo, na mesma época. Aliado a isto, o cenário econômico favorecia as duas culturas, visto que os preços praticados atingiram o ápice, naquele período. Dessa maneira, a colheita do milho foi preterida em relação à colheita da soja. Este fato gerou defasagem no início da coleta de amostras da safra de ‘verão’, em virtude da disponibilidade da colhedora, sendo evidenciado pelos teores de umidade menores nos grãos, quando comparados aos teores de umidade aferidos na ‘safrinha’.

A fim de se evitar a colheita total da lavoura, as áreas destinadas à coleta de amostras foram delimitadas, sendo uma área para cada híbrido. Por sua vez, de forma a minimizar variações no processo de colheita, utilizou-se sempre a mesma colhedora automotriz, com plataforma de seis linhas e com o mesmo

operador.

As colheitas foram realizadas quando os grãos de milho apresentavam teores de umidade entre 3,2 e 14,8%, variando, aproximadamente, em quatro pontos percentuais entre uma colheita e outra, totalizando cinco momentos distintos de colheita.

As áreas de coletas de amostras foram constituídas de 50 linhas de plantas com espaçamento entre linhas de 0,70 m e com 100 m de comprimento. A amostragem foi realizada nas seis linhas internas de cada faixa, composta por dez linhas de plantas. O processo de colheita era suspenso a cada 20 m percorridos dentro da faixa, para se possibilitar coleta da amostra diretamente no graneleiro da colhedora, de forma aleatória na massa de grãos, totalizando cinco amostras de cada híbrido em cada período de colheita. As amostras foram acondicionadas em sacos plásticos e levadas ao laboratório para determinação imediata da umidade nos grãos.

No período da ‘safrinha’ de 2007, as colheitas foram realizadas nos dias 20/07, 27/07, 03/08, 10/08 e 17/8/2007, mantendo-se um intervalo constante de sete dias (Figura 1).

Na safra de ‘verão’, as colheitas foram realizadas nos dias 15/03, 2/03, 31/03, 07/04 e 2/04/2008. Os intervalos maiores, entre a segunda e a terceira colheita, bem como entre a penúltima e a última colheita se deram pela ocorrência de precipitações pluviais nos referidos períodos (Figura 2).

Figura 1. Dados climáticos diários observados nos períodos de colheita da ‘safrinha’ de 2007. P: Precipitação Pluvial; Tmin: temperatura mínima; Tmax: temperatura máxima; UR: umidade relativa do ar. As setas na parte inferior do eixo X indicam as datas em que as colheitas foram realizadas. Fonte: SIMEPAR.

Figura 2. Dados climáticos diários observados nos períodos de colheita da safra de ‘verão’ de 2007/2008. P: Precipitação Pluvial; Tmin: temperatura mínima; Tmax: temperatura máxima; UR: umidade relativa do ar. As setas na parte inferior do eixo X indicam as datas em que as colheitas foram realizadas. Fonte: SIMEPAR.

670 Marques et al.

Cada amostra proveniente do campo foi dividida em três subamostras no Laboratório de Fisiologia da Produção, do Núcleo de Pesquisa Aplicada à Agricultura – Nupagri / UEM. A umidade nos grãos foi determinada pelo método da estufa, com circulação forçada de ar, sob temperatura de 103 ± 1ºC durante 72h, sendo o valor da umidade obtido por diferença de massas (ASAE, 1987).

As amostras foram dispostas em um delineamento inteiramente casualizado para realização do teste de sanidade, sendo os tratamentos constituídos das umidades de colheita para cada híbrido. O método adotado foi o Blotter Test ou teste do papel de filtro, para o qual foram separados 100 grãos de cada amostra, divididos em cinco repetições de 20 grãos. Os grãos de milho foram distribuídos em gerbox plástico com quatro folhas de papel filtro, umedecidas com água destilada e autoclavada, em câmara de fluxo laminar. A seguir, os recipientes foram colocados sob iluminação, com fotoperíodo de 12h, à temperatura ambiente (20 ± 2°C) por um período de sete dias. A identificação dos fungos, em nível de gênero, presentes nos grãos de milho, foi realizada por meio de lupa estereoscópica e microscópio ótico. Na ocasião, foi efetuada a quantificação percentual da incidência de fungos (BRASIL, 1992). O modelo matemático utilizado foi ijiijtmYε++=, em que: i) =ijY valor observado no tratamento i (umidade de colheita 1, 2, 3, 4 e 5) na repetição j (1, 2, 3, 4 e 5); i) =m média geral do experimento, em restrição matemática; i) =itefeito do tratamento i; e iv) =ijεefeito residual associado ao tratamento i na repetição j.

As médias de incidência de fungos obtidas foram submetidas aos testes de Levene e de Shapiro-Wilks, para se determinar a homocedasticidade das variâncias e a normalidade dos erros, respectivamente, por meio do programa estatístico SAS. Em seguida, uma vez atendidas as pressuposições básicas da estatística (p > 0,01), as médias foram submetidas à análise de regressão (p < 0,05), utilizando-se o programa estatístico SISVAR.

Os erros para a variável incidência do gênero

Fusarium nos grãos do híbrido 2B707 não atenderam as pressuposições básicas de homocedasticidade das variâncias e normalidade na distribuição dos erros, sendo, portanto, transformados em raiz quadrada, sendo submetidos, posteriormente, à análise de regressão. As amostras para análises toxicológicas foram mantidas sob congelamento, numa temperatura de -15ºC, em freezer horizontal comum, até a realização dos procedimentos laboratoriais.

As análises toxicológicas foram realizadas no

Núcleo de Produtos Naturais (Nepron) e no Laboratório de Toxicologia da UEM, utilizando-se, para a detecção e a quantificação de aflatoxinas e de zearalenona, a metodologia da cromatografia em camada delgada (CCD), proposta por Soares e Rodriguez-Amaya (1989), na qual os limites de detecção foram de 2 µg kg-1, para as aflatoxinas, e 5 µg kg-1, para a zearalenona.

As amostras foram moídas até a granulometria de 20 mesh e quarteadas para tomada de amostras analíticas de 50 g cada. A seguir, cada amostra analítica foi homogeneizada em blender com 270 mL de álcool metílico e 30 mL de cloreto de potássio (4%), durante 5 min., e a primeira mistura obtida foi filtrada em papel filtro comum. A seguir, 150 mL do primeiro filtrado foram transferidos para um béquer, no qual foram adicionados 150 mL de sulfato de amônio (30%) e 50 mL de celite, homogeneizados e deixados em repouso por 5 min. Após este período, a segunda mistura foi filtrada em papel filtro comum. Do segundo filtrado foram transferidos 150 mL para um funil de separação, sendo adicionados 150 mL de água destilada. A terceira mistura obtida foi particionada duas vezes com 10 mL de clorofórmio. A seguir, 5 mL da primeira e da segunda partição de clorofórmio foram combinados e evaporados em ‘banho maria’ a 80ºC até a evaporação total do clorofórmio. O resíduo (extrato) obtido foi dissolvido em 200 µL de benzeno:acetonitrila, na proporção de 98:2 (v/v).

Na fase móvel, foram aplicados 10 µL do extrato na cromoplaca (Sil G - silicagel 60 G) a 2 cm da base, com os padrões sendo aplicados separadamente. A placa foi colocada em uma cuba não-saturada, contendo 95 mL da solução tolueno:acetato de etila:clorofórmio:ácido fórmico, na proporção de 35:25:25:10 (v/v/v/v), até se atingir a altura percorrida de 10 cm.

(Parte 1 de 3)

Comentários