Atualização sobre hemoglobina glicada (a1c) para avaliação do controleglicêmico e para o diagnóstico do diabetes:aspectos clínicos e laboratoriais

Atualização sobre hemoglobina glicada (a1c) para avaliação do controleglicêmico e...

(Parte 4 de 5)

• A dosagem de hemoglobina glicada em pacientes portadores de hemoglobina variante heterozigótica (exemplos: hemoglobina C, S, E, D, Fetal, Graz, Sherwood Forest, Padova) resulta valores falsamente elevados ou diminuídos, conforme a metodologia aplicada [4,5,6,7,8,9,10,1,12,14,15]. Alguns métodos, baseados na cromatografia por troca iônica, podem identificar a presença de alguns tipos de hemoglobinas variantes, permitindo uma análise mais criteriosa do resultado. Os métodos que utilizam o princípio do imunoensaio não são capazes de detectar a presença das diferentes hemoglobinas variantes [4,5,6,7,8,9,10,1,12,13,14,15].

• A quantificação da hemoglobina glicada não é aplicável nas hemoglobinopatias homozigóticas, independente da metodologia utilizada, em função da ausência de hemoglobina A [4,5,6,7,8,9,10,1,12,13,14,15]. Esta condição necessita ser rastreada e confirmada pelos métodos usuais para o estudo

Quadro 2. Interferência das hemoglobinas variantes e da hemoglobina carbamilada na dosagem da hemoglobina glicada, segundo ngsp, nas diferentes metodologias (Atualizada em abril de 2008)

Abbott Architect

Axis-Shield Nycocard

Axis-Shield Afinion

Siemens Advia

Siemens DCA 2000

Beckman Diatrac

Beckman Synchron

Bio-Rad D-10 (short program)

Bior-Rad D-10 (extended program)

Bio-Rad DiaSTAT

Bio-Rad Variant A1c

Bio-Rad Variant GHb

Bio-Rad Variant I A1c

Bio-Rad Variant I Turbo

Dade Dimension

Diazyme Direct Enzymatic HbA1c

Drew Scientific DS5

Helena Glyco-Tek

Interferência (Sim/Não) Método

Traço Hb C

Traço Hb S

Traço Hb E

Traço Hb DHb F elevadaHb Carbamilada sim sim sim sim sim sim sim sim sim sim sim sim sim sim sim não nãon ão não não não nãon ão nãon ão não não sim/não sim/não sim/não sim/não sim/não não não não não não não não não nãonão não não não nãon ão nãonãonãonão nãonãonão nãonãonão nãonãonão não não não

Posicionamento Oficial 2009 - Aspectos Clínicos e Laboratoriais

Interferência (Sim/Não) Método

Traço Hb C

Traço Hb S

Traço Hb E

Traço Hb DHb F elevadaHb Carbamilada

Esta sinalização indica que não há referências na literatura.

Esta sinalização indica que os dados da literatura são conflitantes. A opção indicada em negrito representa a opinião do NGSP, baseada na revisão da literatura.

Menarini HA8140

Menarini HA8160 (Diabetes Mode)

Menarini HA8160(Thalass emia Mode)

Microgenics Bayer A1c Now Olympus

Ortho-Clinical Vitros

Pointe Scientific Hemoglobin A1c

Primus Boronate Affinity HPLC

Bio-Rad Deeside

Randox Haemoglobin A1c

Roche Cobas Integra

Roche Cobas Integra Gen2

Roche Tina-quant I

Roche Unimate

Tosoh A1c 2.2 Plus

Tosoh G7 Tosoh G8 sim sim/não sim sim sim sim sim sim sim sim sim sim simsim sim sim sim sim sim sim sim/não sim/não não nãonãonão não não não não (<30% HbF) não nãonãonãonão não não não não nãonão não não não não não nãonão não não nãonão sim sim nãonão não não não nãonão não não não não simnão nãonão das hemoglobinopatias [9,10,12]. Nestas situações, exames alternativos, tais como frutosamina e albumina glicada, podem ser úteis [8,9,10,12].

• A base de Schiff, que é a fração lábil da hemoglobina glicada, pode representar importante interferente na dosagem, na dependência do método utilizado. O laboratório deve se certificar da potencial interferência deste composto na metodologia adotada. Para as metodologias afetadas pela fração lábil, deve-se seguir, rigorosamente, as instruções do fabricante para remoção deste interferente [3,4,9,10].

Os laboratórios devem conhecer os efeitos das interferências potenciais na metodologia utilizada, incluindo as hemoglobinas variantes, os derivados quimicamente modificados (hemoglobina carbamilada e acetilada) e outros fatores, como presença de vitamina C e E, anemia por deficiência de ferro, vitamina B12 e folato, hipertrigliceridemia, hiperbilirrubinemia, alcoolismo crônico, ingestão crônica de opiáceos, os quais podem afetar os resultados do teste de A1C.

Ao selecionar o método de ensaio, os laboratórios devem considerar o risco potencial das interferências e a prevalência das moléstias no grupo populacional do paciente avaliado.

Coleta, processamento e conservação das amostras

Preparo do paciente - O paciente não precisa estar em jejum, entretanto resultados mais acurados são obtidos em amostras isentas de turbidez decorrentes da hipertrigliceridemia. Por esta razão, é recomendada a coleta de sangue, pelo menos, duas horas após a ingestão de alimentos [9,10].

Coleta - O sangue pode ser obtido por punção venosa ou por punção capilar. Os tubos devem conter o anticoagulante especificado pelo fabricante (EDTA é o mais usado). Em alguns sistemas, a heparina é aceitável [9,10].

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Estabilidade - Em geral, o sangue total é estável por uma semana sob refrigeração (2 a 8ºC). O sangue total armazenado a -70ºC é estável por pelo menos 18 meses [3,9,10].

O armazenamento a -20ºC, por longos períodos de tempo, ocasiona o aumento da HbA1a+b e, portanto, não é recomendável [3,9,10].

Processamento das amostras - Instruções detalhadas para o processamento da amostra devem ser fornecidas nas instruções de uso, pelo fabricante do conjunto diagnóstico ou sistema analítico. A formação da A1C é precedida pela formação de base de Schiff intermediária chamada “pré-A1C” ou A1C lábil. Essa base é formada rapidamente no evento de hiperglicemia aguda e interfere com alguns ensaios, principalmente aqueles baseados em carga elétrica [3,9,10]. Os laboratórios devem seguir as instruções do fabricante para a remoção dos intermediários lábeis.

Padronização da International Federation for Clinical Chemistry (IFCC) para dosagem da hemoglobina glicada

A International Federation for Clinical Chemistry (IFCC) desenvolveu um método de referência para a dosagem da A1C [16,17]. Na primeira etapa, a hemoglobina é clivada em seus peptídeos pela enzima endoproteinase Glu-C, e, em uma segunda etapa, os hexapeptídeos N- terminais glicados e não-glicados obtidos são separados por HPLC e, a seguir, quantificados ou por espectrometria de massas com ionização por nebulização elétrica (ESI/MS – Electrospray Ionization/Mass Spectrometry) ou por eletroforese capilar com detecção UV. Ambos os princípios originam resultados idênticos. Os calibradores consistem de misturas de HbA0 e HbA1c altamente purificadas. O desempenho analítico do método foi avaliado por uma rede de laboratórios de referência da Europa, dos Estados Unidos e do Japão. Devido à sua alta especificidade, os resultados obtidos por esse método são menores que os obtidos por metodologias comerciais calibradas contra métodos designados ou comparativos, como o usado no DCCT [16].

Uma equação entre as metodologias IFCC e NGSP foi estabelecida, conforme descrita abaixo [16]:

NGSP = (0,915 x IFCC) + 2,15

Os resultados da hemoglobina glicada obtidos pela metodologia IFCC são 1,5 a 2,0% mais baixos quando comparados aos resultados dos métodos certificados pelo NGSP [16,17].

Até o presente momento, o NGSP não adotou o método do IFCC como a referência para fins de rastreabilidade. Assim sendo, o NGSP mantém, como método de referência, aquele rastreável ao estudo do DCCT.

Importante frisar que, mesmo que o NGSP adote a metodologia proposta pelo IFCC como padrão ouro para a medida da hemoglobina glicada, todos os métodos atualmente em uso, certificados pelo NGSP, continuam válidos para uso em rotina. Nesta nova condição, os métodos em uso serão mantidos, porém devidamente harmonizados em relação à nova referência. Concomitantemente, conforme proposta da IFCC, os métodos atuais passariam a ser calibrados por meio de padrões sintéticos constituídos por hemoglobina glicada e não-glicada [18].

Método utilizado no estudo do DCCT e certificação NGSP

Devido ao impacto positivo que a padronização interlaboratorial dos resultados de hemoglobina glicada representa no cuidado aos pacientes portadores de diabetes, o American Association for Clinical Chemistry Standards Committee criou o GHB Standardization Subcommittee, em abril de 1993. O subcomitê definiu que o método de ensaio usado no estudo do DCCT (HPLC) fosse adotado como método de referência interino até o estabelecimento de um método de referência definitivo. O

Posicionamento Oficial 2009 - Aspectos Clínicos e Laboratoriais subcomitê também propôs a padronização dos conjuntos diagnósticos comerciais disponíveis em relação ao método de referência do estudo DCCT, com o uso de amostras de sangue nativas. O National Glycohemoglobin Standardization Program (NGSP), dos Estados Unidos, realiza os estudos comparativos entre diferentes metodologias comerciais com o método de referência do estudo DCCT (HPLC). Os métodos certificados pelo NGSP apresentam resultados de A1C equivalentes aos obtidos com o método aplicado no estudo DCCT [9,10,19].

Critérios para escolha do método adequado na rotina laboratorial

Existem diversas metodologias disponíveis, comercialmente, para a realização do teste da hemoglobina glicada na rotina laboratorial. Cabe ao laboratório selecionar a metodologia de melhor custo/efetividade, considerando os seguintes aspectos:

• Necessidade do registro do conjunto diagnóstico junto à ANVISA.

• Este Posicionamento Oficial recomenda o uso de métodos certificados pelo NGSP.

• Se a opção recair por um método não certificado pelo NGSP, este deverá, preferencialmente, dosar a fração HbA1c.

• A escolha da metodologia deverá considerar a prevalência, principalmente, das hemoglobinopatias e da insuficiência renal na população atendida pelo laboratório.

Recomenda-se que os laboratórios clínicos utilizem os métodos certificados pelo NGSP e rastreáveis ao estudo do DCCT. O laboratório deve participar ativa e regularmente de um programa de ensaio de proficiência específico para a hemoglobina glicada.

No “site” do NGSP (w.ngsp.org) estão descritas as informações referentes ao processo de certificação e uma lista, mensalmente atualizada, dos conjuntos diagnósticos comerciais certificados. Os certificados têm validade de um ano [20].

Fundamentos metodológicos para dosagem de hemoglobina glicada

Os métodos atualmente disponíveis para dosagem da hemoglobina glicada se baseiam em um dos seguintes fundamentos [3,9,10,1,21]:

Na diferença na carga iônica: • Cromatografia de troca iônica (HPLC).

• Microcromatografia em minicolunas contendo resina de troca iônica; Eletroforese em gel de agarose.

Nas características estruturais:

• Cromatografia de afinidade (HPLC) utilizando derivados do ácido borônico.

• Imunoensaio turbidimétrico.

Na reatividade química:

• Método colorimétrico com formação do 5-hidroximetilfurfural (5HMF).

Conjuntos diagnósticos para a dosagem de hemoglobina glicada

No quadro 3, atualizado até dezembro de 2008, estão listados alguns fabricantes dos conjuntos diagnósticos para a dosagem de hemoglobina glicada e os respectivos métodos, sendo que vários destes estão disponíveis no mercado brasileiro.

Testes rápidos para automonitoração da hemoglobina glicada

Os métodos rápidos, certificados pelo NGSP, podem ser indicados, mas no Brasil ainda são pouco difundidos, particularmente, em razão do custo elevado.

Desempenho analítico Recomenda-se que o laboratório mantenha um programa de contro-

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Quadro 3: alguns conjuntos diagnósticos para a dosagem da

hemoglobina

A1C

A1C A1C A1C

HbA1 total HbA1 total HbA1 total HbA1 total HbA1 total A1C A1C A1C

HbA1 total A1C A1C A1C A1C

A1C

A1C A1C A1C A1C A1C A1C A1C A1C A1C A1C A1C A1C A1C A1C A1C A1C A1C

Método Fabricante ParâmetroC ertificado pelo NGSP

Afinidade (ácido borônico)

Cromatografia de troca iônica

Enzimático Eletroforese

HPLC Troca iônica

HPLC Cromatografia de afinidade (ácido borônico)

Imunoensaio por Turbidimetria

Sim Sim Sim Sim Não Não Não Não Não* Sim Sim Não Não Sim Sim Sim Sim

Sim

Sim Sim Sim Sim Sim Sim Sim Sim Sim** Sim Sim Sim Sim Sim Sim Sim Sim

Axis-Shield PoC As Bio-Rad Deeside Infopia Co, Ltd Quotient Diagnostics Ltd Doles INLAB In Vitro Katal Labtest Arkray Diazyme Laboratories USA Sebia CELM A.Menarini Diagnostics Arkray Bio-Rad Laboratories Tosoh Corporation

Primus Diagnostics

Abbott (reagentes da Seradyn, Inc) Arkray Axis Shield Bayer Health Care – A1C Now Beckman Coulter DiaSys Diagnostic Systems Home Access Health Corporation Horiba ABX Labtest A1C MEC Dynamics Corporation Olympus A1C Ortho-Clinical Diagnostics Pointe Scientific, Inc. Roche Diagnostics Seradyn, Inc. Siemens Thermo Fisher Scientific Ou

Para atualização dos métodos certificados pelo NGSP consultar o “site”: w.ngsp.org * Conjunto diagnóstico da empresa Labtest denominado Hemoglobina Glicada Ref.17

** O conjunto diagnóstico da empresa Labtest denominado HbA1c Turbiquest – Ref. 301 traz a seguinte informação nas instruções de uso: “O método é certificado pelo National Glycohemoglobin Standardization Program (NGSP) para Pointe Scientific, Inc., com rastreabilidade ao método de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) utilizado no estudo Diabetes Control and Complications Trial (DCCT)” le interno da qualidade da dosagem de A1C e que estabeleça como meta um coeficiente de variação interensaio inferior a 5%, embora o percentual desejável seja inferior a 3%. O laboratório deve utilizar dois níveis de amostras controle. Recomenda-se, ainda, que o laboratório participe ativamente de programas de proficiência, como o PELM - Programa de Proficiência em Ensaios Laboratoriais, da Sociedade Brasileira de Patologia Clínica/Medicina Laboratorial, com a finalidade de monitorar a exatidão e o cálculo do erro total. Informações mais completas sobre o PELM poderão ser obtidas no seguinte “site”: w. pelm.com.br.

Requisitos da qualidade - coeficientes de variação

Os laboratórios devem atingir níveis inferiores a 5% (idealmente inferiores a 3%) para o coeficiente de variação interensaio nos métodos de ensaio para A1C. Recomenda-se que pelo menos duas amostras controle sejam avaliadas como uma medida do desempenho do ensaio. Os laboratórios devem confirmar os resultados de amostras abaixo do limite inferior do intervalo de referência ou acima de 15%. Se a base de Schiff (fração lábil da hemoglobina glicada ou pré-A1C) interferir com o método de ensaio, esta deve ser removida antes do ensaio, conforme orientação do fabricante do conjunto diagnóstico.

Critérios para a repetição do ensaio laboratorial

Os resultados abaixo do limite inferior da referência necessitam de repetição para confirmação. Se o resultado baixo for confirmado, sugere-se que o laboratório faça contato com o médico solicitante para obtenção de dados adicionais do paciente acerca de suspeita de doença hemolítica, hemorragia ou hemoglobina variante.

Os resultados acima de 15% devem ser repetidos e, se confirmados, a hipótese da presença de hemoglobina variante deve ser considerada. Nestas circunstâncias, o laboratório pode analisar esta amostra por uma segunda metodologia, menos sujeita à interferência, ou realizar a pesquisa de hemoglobina variante [4,9,10,1].

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Intervalo de referência

Para as metodologias certificadas pelo NGSP, o intervalo de referência deve situar-se entre 4% a 6%, com variação inferior a 0,5% [9,10,18]. A utilização de metodologia certificada pelo NGSP com rastreabilidade de desempenho analítico em relação aos estudos do DCCT permite adotar o valor inferior a 7% como meta para o efetivo controle do paciente diabético, conforme a American Diabetes Association (ADA) ou 6,5% conforme a Sociedade Brasileira de Diabetes (SBD). Importante ressaltar que este valor não é de referência, mas um valor acima do qual os riscos de desenvolvimento de complicações micro e macrovasculares da doença são significantemente elevados [4,6,7,9,10,1,13,2,23,24,25].

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