DATY Meios de Cultura Empregados nos Exames Microbiológicos ANVISA

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(Parte 1 de 18)

Módulo IV

Descrição dos Meios de Cultura Empregados nos Exames Microbiológicos

ÍNDICE

ÍNDICE 2

1. INTRODUÇÃO 1

PROCEDIMENTOS GERAIS 1

2. MEIOs DE cultura para TRANSPORTE e conservação 2

CARY BLAIR 2

SALINA TAMPONADA 3

MEIO STUART 3

ÁGAR NUTRIENTE 4

3. Meios para crescimento e isolamento 6

ÁGAR CHOCOLATE 6

Ágar THAYER-MARTIN CHOCOLATE 7

ÁGAR Salmonella-Shigella (SS) 7

CALDO SELENITO 8

CALDO TETRATIONATO 9

CALDO TIOGLICOLATO COM INDICADOR 11

CALDO TIOGLICOLATO SEM INDICADOR 12

ÁGAR MAC CONKEY 12

ÁGAR SANGUE 13

ÁGAR CLED – Cystine Lactose Electrolyte Deficient 14

CALDO BHI – BRAIN HEART INFUSION 16

LÖWENSTEIN JENSEN 17

MEIO BIFÁSICO: Löwenstein e Middlebrook 19

ÁGAR MYCOSEL 20

ÁGAR SABOURAUD 21

4. Meios comerciais para provas de identificação 23

Base de nitrogênio para leveduras – Yeast Nitrogen Base 23

ÁGAR CITRATO SIMMONS 24

Ágar Bílis-Esculina 25

Ágar Sangue - camp 27

Caldo Base de Moeller 27

Ágar DNase 29

ÁGAR ESCULINA 31

ÁGAR FENILALANINA 32

CTA – CYSTINE TRYTICASE Agar 33

Caldo triptona e SIM 34

Meio Caldo Triptona 35

CALDO MALONATO 37

CALDO NITRATO 38

MEIO BASE PARA OXIDAÇÃO E FERMENTAÇÃO - OF 39

ÁGAR TSI – Triplo açúcar ferro 41

ÁGAR BASE URÉIA (Christensen) 42

5. Fórmulas e produtos para provas de identificação 45

para prova de catalase 45

para pROVA DE COAGULASE 45

para prova de GELATINASE 47

para prova de lecitinase 48

para PROVA de OXIDASE 49

para FERMENTAÇÃO DE CARBOIDRATOS 50

para a prova de hidrólise 51

para CRESCIMENTO A 42 E 44°C 53

para teste DE MOTILIDADE 53

para PROVA DE TOLERÂNCIA AO NaCl 6,5% 57

6. Discos para identificação 59

BACITRACINA 59

NOVOBIOCINA 59

OPTOQUINA 60

7. Meios para teste de sensibilidade aos antimicrobianos 62

HTM – Haemophilus Test Médium 62

ÁGAR MUELLER HINTON 62

ÁGAR MUELLER HINTON SANGUE 64

8. referências BIBLIOGRáFIcas 66

1. INTRODUÇÃO

PROCEDIMENTOS GERAIS

Preparação e distribuição de meios de cultura

  • Os meios comerciais devem ser hidratados em pequena quantidade de água até que todo o meio fique úmido e só depois deve-se acrescentar o restante da água.

  • Os meios preparados não comerciais, devem ser pesados separadamente em papel manteiga ou papel alumínio e adicionados em um único frasco (normalmente em béquer), hidratar em pequena quantidade de água até que todo o meio fique úmido e só depois deve-se acrescentar o restante da água.

  • Sempre que for necessário levar o meio para fundir, usar vidro Pyrex, aquecer sobre a tela de amianto ou similar e tripé, no bico de Bunsen.

  • Usar sempre luvas térmicas apropriadas para laboratório para manipular vidrarias quentes;

  • Sempre que for usado o termo "esterilizar em autoclave", o tempo de esterilização é de 15 minutos e a temperatura de 121ºC.

  • Sempre que for usado o termo "esterilizar por filtração", usar o filtro com porosidade de 0,22 micra, recomendado para partículas bacterianas.

  • Quando distribuir o meio antes de autoclavar, os tubos não precisam estar esterilizados;

  • Quando distribuir o meio após a autoclavação, os tubos, frascos, placas, pipetas e vidrarias ou materiais auxiliares obrigatoriamente devem ser estéreis.

  • Os meios devem ser autoclavados com as tampas semi-abertas, para que a esterilização seja por igual em todo o conteúdo dos tubos - tampas fechadas não permitem a entrada do vapor.

Controle de qualidade de esterilidade e crescimento

  • Para todos os meios confeccionados, colocar no mínimo 10% do lote preparado na estufa 35 ± 1°C por 24 horas para o controle de esterilizade.

  • Não deve haver mudança de cor nem crescimento de qualquer colônia.

  • Para o controle de crescimento, sempre que possível usar cepas ATCC, que são cepas de referências de origem e padrão definido de provas para a sua caracterização.

  • Se não for possível o uso de cepas ATCC, usar cepas 100% positivas para os controles de qualidade de crescimento realizados.

Recomendações gerais

  • Evitar usar meios vencidos (liofilizados e prontos para uso); se usar, certificar-se com o controle de crescimento de que realmente está funcionando.

  • Não usar meios prontos para uso em tubos ou placas que estejam ressecados.

  • Observar com atenção para as instruções de alguns inóculos que são específicos para alguns meios de cultura.

  • Recomenda-se o uso de tubos com tampa de rosca, pois evitam o ressecamento rápido do meio (tamanho dos tubos utilizados geralmente são de 11 por 100 mm).

  • As placas de Petri são de 50, 90 ou 150 mm de diâmetro.

  • Todos os meios confeccionados devem ser devidamente identificados com o nome, data de fabricação, data de validade e tipo de armazenamento.

  • Todos os meios de placa devem ser embalados em filme plástico PVC transparente para evitar o ressecamento.

  • Evitar o uso de sacos plásticos para embalar as placas, pois a água de condensação formada facilita a proliferação de fungos; para meios de cultura em tubos, colocar em sacos plásticos, procurando tirar o excesso de ar.

2. MEIOs DE cultura para TRANSPORTE e conservação

CARY BLAIR

Princípio

  • meio de Cary Blair foi formulado à partir do meio de Stuart, uma vez que microrganismos patogênicos e outros coliformes fecais sobrevivem bem neste meio.

  • A carência de uma fonte de nitrogênio impede consideravelmente a multiplicação de microrganismos e a composição nutritiva garante a sobrevivência deles.

  • O que difere este meio do meio de Stuart, é a adição de uma solução salina balanceada de tampão fosfato inorgânico e omitindo da fórmula o azul de metileno.

Utilidade

  • Transporte de material fecal e conseqüente conservação dos microrganismos.

Fórmula/ Produto

  • Meios comercial: Meio de transporte Cary Blair.

Procedimentos

  • Pesar e hidratar o meio conforme instruções do fabricante;

  • Fundir completamente;

  • Distribuir 7 ml por tubo;

  • Esterilizar em autoclave;

  • Após retirar da autoclave, manter os tubos em posição vertical para solidificar.

  • pH: 7,4 +/- 0,2

Controle de qualidade

  • Crescimento bom (com 0, 24 e 48 horas de crescimento): Shigella flexneri ATCC 12022.

Conservação e validade

  • Conservar de 4 a 10°C de 6 a 8 semanas.

Inoculação

  • Introduzir um "swab" estéril de madeira nas fezes recém coletadas;

  • Após a coleta, introduzir imediatamente o "swab" no meio de cultura e quebrar a ponta da haste, de modo que a parte que contém o algodão fique no meio de cultura;

  • Fechar o tubo;

  • Manter em temperatura ambiente até o momento de semear nos meios seletivos adequados.

Interpretação

  • Cor original do meio: Branco opalescente.

  • Como este é um meio de transporte, não há evidência de crescimento bacteriano.

Recomendações

  • Não deixar o meio com a tampa aberta ou semi aberta após a semeadura.

  • Não semear fezes coletadas com mais de 6 horas.

SALINA TAMPONADA

Princípio

  • Meio líquido tamponado que mantém a bactéria viável.

Utilidade

  • Meio de transporte de fezes.

Fórmula /Produto

  • Fórmula:

  • NaCl 4,2 g

  • Fosfato dipotássico anidro 3,1 g

  • Glicerina bidestilada 300 ml

  • Água destilada 700 ml

Procedimentos

  • Distribuir 10 ml em cada tubo de 16 x 160 mm;

  • Esterilizar em autoclave.

Controle de qualidade

  • Shigella flexneri ATCC 12022

Inoculação

  • Inocular 2 g da amostra de fezes e homogeneizar;

  • Incubar a 35 ±1°C por 12 a 18 horas.

Interpretação

  • O crescimento é indicado pela turbidez do meio.

  • Após incubação semear 3 a 4 alçadas da amostra em uma placa de SS e/ou MacConkey.

Conservação e validade

  • Conservar de 4 a 8°C por até 3 meses.

MEIO STUART

Princípio

  • A carência de uma fonte de nitrogênio impede consideravelmente a multiplicação de microorganismos e a composição nutritiva garante a sobrevivência deles.

Utilidade

  • Transporte de diversos materiais e conseqüente conservação dos microorganismos.

  • Conservação de microorganismos patogênicos como: Haemophilus spp., Pneumococcus, Salmonella spp., Shigella spp. entre outros.

Fórmula / Produto

  • Meios comercial: Meio de transporte STUART

Procedimentos

  • Pesar e hidratar o meio conforme instruções do fabricante;

  • Fundir completamente;

  • Distribuir 7 ml por tubo;

  • Esterilizar em autoclave;

  • Após retirar da autoclave, manter os tubos em posição vertical para que solidifiquem.

  • pH: 7,4 +/- 0,2

Controle de qualidade

  • Crescimento bom (com 0, 24 e 48 horas de crescimento):

Haemophilus influenzae ATCC 10211

Shigella flexneri ATCC 12022

Streptococcus pneumoniae ATCC 6305

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