DATY Meios de Cultura Empregados nos Exames Microbiológicos ANVISA

DATY Meios de Cultura Empregados nos Exames Microbiológicos ANVISA

(Parte 11 de 18)

Inoculação

Meio Caldo Triptona

  • Fazer um inóculo leve com colônia pura de cultura de 18-24 horas (para enterobactérias, bacilos Gram negativos não fermentadores ou anaeróbios);

  • Fazer um inóculo denso com colônia pura de cultura de 18-24 horas (para Haemophilus);

  • Incubar a 35°C por 24 horas (enterobactérias) ou até 48 horas (bacilos Gram negativos não fermentadores ou anaeróbios) em aerobiose ou anaerobiose, respectivamente.

Meio SIM

  • Com o auxílio da agulha, inocular uma colônia no meio na posição vertical, lentamente até a base;

  • Afastar a agulha seguindo a linha inicial do inóculo;

  • Incubar a 35°C por 18-24 horas.

Interpretação

  • Cor original do meio:

  • Após incubação, revelar com reagente de Ehrlich ou Kovacs.

  • A escolha entre os reagentes de Ehrlich ou Kovacs depende da preferência dos Gram negativos não fermentadores ou anaeróbios, que podem produzir mínima quantidade de indol.

Revelação com reativo de Ehrlich ou Kovacs no meio de Caldo Triptona

  • Colocar 1mL de xilol no tubo com crescimento bacteriano, homogeneizar vigorosamente e aguardar 1 minuto;

  • Adicionar pela parede do tubo 0,5 ml do reativo de Erlich e realizar a leitura.

Indol positivo: aparecerá um anel vermelho logo abaixo da camada de xilol.

Indol negativo: permanecerá um anel amarelo logo abaixo da camada de xilol.

Revelação com reativo de Kovacs no meio SIM

  • Realizar a leitura da motilidade e do H²S.

  • Em seguida adicionar 5 gotas do reativo de Kovacs pela parede do tubo no meio contendo o crescimento bacteriano.

  • Agitar o tubo suavemente e proceder a leitura do indol.

  • Motilidade positiva: microrganismos móveis migram pela linha do inóculo e difundem-se no meio causando turbidez.

  • Motilidade negativa: bactéria tem um crescimento acentuado ao longo da linha do inóculo, em volta continua límpido.

  • H²S positivo: ao longo da linha de inoculação aparecerá a cor negra.

  • H²S negativo: linha ao longo da inoculação inalterada.

  • Indol positivo aparecerá um anel vermelho.

  • Indol for negativo aparecerá um anel amarelo.

Conservação e validade

  • Caldo Triptona: 6 meses se conservado de 2 a 8°C.

  • Meio SIM: 6 meses se conservado de 2 a 8°C em tubos com tampas de rosca, tubos com tampão de algodão o meio pode ressecar antes deste prazo.

Recomendações

  • Um ótimo pH para triptofanase é levemente alcalino (pH 7,4-7,8), um pH ácido pode baixar a produção do indol indicando um resultado falso negativo ou positivo fraco.

  • Cultura para ser testada produção de indol deve ser incubada em aerobiose, a baixa tensão de oxigênio baixa a produção de indol.

  • Indol positivo se perde após 96 horas de incubação.

  • Alguns microrganismos formam indol, mas se quebram ou baixam rapidamente a produção, podendo ocorrer um resultado falso negativo. Ocorre principalmente entre algumas espécies de Clostridium spp.

  • Pequenas modificações podem ser necessárias para testar a produção de indol em não fermentadores (fracos produtores de indol), como a utilização de um meio enriquecido, como o meio BHI enriquecido com 2% de soro de coelho ou isovitalex, extração com xilol e revelação com reagente de Ehrlich.

  • Na extração de indol com o reagente xilol, colocar pequena quantidade de xilol para evitar a diluição do indol tornando-o fraco positivo ou negativo.

  • Algumas cepas de Cardiobacterium hominis, Kingella spp., Sutonella indologenes, Eikenella corrodens, necessitam de inóculo denso no caldo de triptona, incubação de 48 horas, extração com xilol e revelação com reagente de Ehrlich.

CALDO MALONATO

Princípio

  • Determina a habilidade do microrganismo de utilizar malonato de sódio como única fonte de carbono, resultando em alcalinização do meio.

Utilidade

  • Diferenciar gêneros e espécies de enterobactérias e não fermentadores.

Fórmula / Produto

  • Meio comercial: Caldo Malonato.

Procedimentos

  • Pesar e hidratar o meio conforme instruções do fabricante;

  • Ajustar o pH 6,7 ± 0,2;

  • Distribuir 1,5 ml em tubos com tampa de rosca;

  • Esterilizar em autoclave;

  • Retirar os tubos da autoclave e deixar esfriar em temperatura ambiente.

Controle de qualidade

  • Positivo: Klebsiella pneumoniae ATCC 13883.

  • Negativo: Escherichia coli ATCC 25922.

Inoculação

  • Inocular colônias puras de 18 a 24 horas;

  • Inóculo leve;

  • Incubar a 35°C de 24-48 horas, observando o cultivo diariamente.

Interpretação

  • Cor original do meio: verde.

  • Positivo: azul.

  • Negativo: inalterado (verde).

Conservação e validade

  • Conservar de 4 a 10°C de 6 a 8 semanas.

  • Após este período realizar controle positivo e negativo semanalmente.

Recomendações

  • Alguns resultados negativos produzem cor amarela, isso porque a fermentação da glicose aumenta a acidez.

  • Alguns microrganismos malonato positivo produzem uma fraca alcalinização, dificultando a interpretação. Se o resultado for duvidoso incubar um tubo sem inóculo para comparação, junto com o teste em questão, se não aparecer nenhum traço azul, incubar por mais 24 horas, liberando o resultado negativo após incubação de 48 horas.

  • Cuidado ao interpretar resultados após incubação prolongada. Cor azul fraco (azul esverdeado) pode parecer uma reação fraca positivo podendo ser ignorado.

CALDO NITRATO

Princípio

  • Determina a habilidade do microrganismo de reduzir o nitrato (NO³) a nitrito (NO²) ou gás nitrogênio (N²) (denitrificação).

Utilidade

  • Diferenciar gêneros e espécies de enterobactérias, não fermentadores, anaeróbios, Haemophilus, Neisseria e Mycobacterium.

Fórmula /Produto

  • Meio comercial: Caldo Nitrato.

  • Reagentes para revelação da reação.

Solução A

Ácido sulfanílico 0,8 g

Ácido acético 5N 100 ml

Solução B

N,N-dimetil-l-naftilamina 0,6 g

Ácido acético 5N* 100 ml

* Ácido acético 5N

Ácido acético glacial 40 ml

Água destilada 100 ml

Zinco em pó(pronto para uso)

Procedimentos

Caldo nitrato

  • Pesar e hidratar o meio conforme instruções do fabricante;

  • Acertar o pH 7,0;

  • Distribuir 3 ml do meio em cada tubo, contendo um tubo de Durhan invertido;

  • Esterilizar em autoclave;

  • Deixar o tubo esfriar na posição vertical

Reagentes para revelação da reação.

  • Solução A

  • Dissolver o ácido sulfanílico em uma parte do ácido e depois completar com o restante do ácido acético q.s.p. 100 ml.

  • Solução B

  • Dissolver o N,N-dimetil-l-naftilamina com uma parte do ácido e completar o restante do ácido acético q.s.p. 100 ml.

Controle de qualidade

Resultado Cepa Resultado esperado

Nitrato reduzido a nitrito Enterobactérias Coloração vermelha

Nitrato a gás Pseudomonas aeruginosa Bolhas no tubo de Durhan

Nitrato não reduzido Acinetobacter baumannii Coloração vermelha somente após adição de pó de zinco

Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Acinetobacter baumannii ATCC

Inoculação

  • Fazer um inóculo denso, com colônias recentes (18 – 24 horas) no meio com alça bacteriológica;

  • Não agitar o tubo após inoculação;

  • Incubar 35±1°C por 24 a 48 horas, sendo necessário algumas vezes até 5 dias;

  • Verificar se existe crescimento aparente no meio antes de colocar os reagentes para revelar a reação;

  • Verificar a presença de bolhas dentro do tubo de Durhan.

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