DATY Meios de Cultura Empregados nos Exames Microbiológicos ANVISA

DATY Meios de Cultura Empregados nos Exames Microbiológicos ANVISA

(Parte 6 de 18)

  • Pesar o verde de malaquita e adicionar a água;

  • Homogeneizar bem até dissolver o corante;

  • Esterilizar em vapor fluente durante 30 minutos;

  • Reservar a solução.

Meio comercial:

  • Pesar e hidratar o meio conforme instruções do fabricante;

  • Adicionar o glicerol e aquecer o meio, agitando constantemente até ferver;

  • Esterilizar em autoclave;

  • Resfriar a base à 45 - 50ºC;

  • Quebrar os ovos, um a um, cuidadosamente em copo de béquer estéril e transferir, um a um, para uma proveta estéril de 500 ml;

  • Completar a proveta com ovos até completar 500 ml;

  • Transferir os ovos para um copo de liqüidificador estéril - se não tiver liqüidificador próprio para laboratório, transferir os ovos para um balão de 1000 ml contendo pérolas de vidro de tamanho médio, ambos estéreis;

  • Homogeneizar os ovos;

  • Passar os ovos para o balão que contém a base fria, filtrando em funil e gaze estéril;

  • Adicionar o verde de malaquita;

  • Homogeneizar bem;

  • Deixar repousar durante 30 minutos para as bolhas da superfície estourarem;

  • Distribuir 10 a 12 ml por tubo de rosca estéril;

  • Colocar os tubos no coagulador inclinados com a superfície em forma de bico de flauta (ângulo de 45º) durante 50 minutos a 85ºC - se não tiver coagulador, pode-se coagular os ovos em banho de areia à 85ºC colocado em estufa de esterilização, também por 50 minutos, tendo o cuidado de verificar a temperatura constantemente.

Meio não comercial:

  • Diluir a L-asparagina em pouca água e dissolver aquecendo lentamente no bico de Bunsen;

  • Acrescentar os demais componentes, exceto os ovos e o verde de malaquita;

  • Esterilizar em autoclave;

  • Seguir os passos 4 ao 14 listados acima.

Controle de qualidade

  • Esterilização: colocar todos os tubos em estufa;

  • Crescimento bom a excelente:

Mycobacterium tuberculosis ATCC 25618

Mycobacterium avium ATCC 25291

Conservação e validade

  • Conservar entre 4 a 8ºC por 3 meses.

Inoculação

  • Para materiais biológicos de sítios contaminados, fazer descontaminação prévia pelas técnicas desejadas (Petroff, NALC, Lauril sulfato de sódio, Corper & Stoner modificado);

  • Semear 5 gotas ou mais, cobrindo bem a superfície do meio;

  • Manter os tubos inclinados com a tampa semi aberta até secar bem o inóculo;

  • Depois de seco o inóculo, rosquear os tubos e incubar 60 dias à 35ºC;

  • Semanalmente, abrir as tampas próximo ao bico de Bunsen para ventilar os cultivos e observar a presença ou não de crescimento.

Interpretação

  • Cor original do meio: verde claro

  • Positivo: Crescimento de colônias amarelas

  • Negativo: ausência de crescimento.

Recomendações

  • Como é um meio rico em proteínas, bactérias proteolíticas contaminam o meio, liqüefazendo-o, para isto, deve-se fazer uma leitura com 24 horas de incubação para tirar as culturas que possam ter contaminado;

  • Não usar ovos velhos;

  • Não quebrar mais que um ovo por vez, pois pode ter algum estragado e contaminar os demais;

  • Manter sempre mais que um béquer estéril para o caso de haver algum ovo estragado;

  • Não liberar culturas negativas com tempo inferior a 60 dias de incubação, pois as micobactérias desenvolvem-se lentamente;

  • Fazer um esfregaço do crescimento e corar pela técnica de Ziehl para confirmar ser um Bacilo Álcool Ácido Resistente, pois alguns contaminantes podem crescer com pigmento amarelo.

MEIO BIFÁSICO: Löwenstein e Middlebrook

Princípio

  • O meio é constituído de duas fases, uma sólida que é o meio de Löwenstein Jensen e uma líquida, que é o meio 7H-9, juntos fornecem os nutrientes necessários para o desenvolvimento das micobactérias isoladas de materiais nobres.

Utilidade

  • Sistema desenvolvido para o isolamento de micobactérias do sangue e de materiais paucibacilares, como líquor, líquido pleural, biópsias, entre outros.

Fórmula / Produto

  • Meio comercial: Meio TB para Bacilos de Koch Seg. Löwenstein Jensen ou Löwenstein Medium Base

  • Meio comercial: Middlebrook 7H-9 broth

  • Meio comercial: Middlebrook Enrichment (suplemento para enriquecimento).

  • Ovos de galinha frescos

Procedimentos

  • Meio de Löwenstein Jensen: procedimento igual ao já descrito, distribuindo 12 ml do meio em frascos estéreis com capacidade para 100 ml (usar tampão de algodão e depois do meio pronto - parte sólida e líquida, substituir por tampa de borracha e lacre de alumínio) e coagulando os frascos bem inclinados.

  • Meio Middlebrook 7H-9 broth:

  • Pesar e hidratar conforme instruções do fabricante;

  • Adicionar o glicerol, conforme instruções do fabricante;

  • Esterilizar em autoclave;

  • Resfriar a base à - 50ºC;

  • Adicionar o suplemento Middlebrook Enrichment, conforme instruções do fabricante;

  • Homogeneizar bem;

  • Distribuir 15 ml em cada frasco de Löwenstein Jensen inclinado;

  • Fazer o controle de qualidade de esterilidade;

  • Lacrar os frascos com tampa de borracha (previamente submersas em álcool etílico 70% durante 30 minutos) e lacre de alumínio.

  • pH: 6,6 +/- 0,2

Controle de qualidade

  • Crescimento bom a excelente:

Mycobacterium tuberculosis ATCC 27294 e Mycobacterium fortuitum ATCC 6841.

Conservação e validade

  • Conservar os frascos embalados de 4 a 8°C por até 3 meses.

Inoculação

  • Por serem materiais estéreis, não é necessário a descontaminação;

  • Colher assepticamente 5 ml de sangue e inocular no frasco ;

  • Se for outro material, inocular até 5 ml de material;

  • Incubar durante 60 dias à 35º /- 0,2;

  • Banhar o meio sólido semanalmente.

Interpretação

  • Cor original do meio: parte sólida: verde clara, parte líquida: âmbar claro.

  • Positivo: turvação do meio líquido e crescimento de colônias amarelas no meio sólido.

  • Negativo: ausência de turvação e crescimento nos meios líquido e sólido.

Recomendações

  • Não usar frascos com meio líquido turvo;

  • Volumes de inóculos inferires a 2,5 ml podem resultar em culturas falso - negativas;

  • Não liberar culturas negativas com tempo inferior a 60 dias de incubação, pois as micobactérias desenvolvem-se lentamente;

  • Fazer um esfregaço do crescimento e corar pela técnica de Ziehl para confirmar ser um Bacilo Álcool Ácido Resistente, pois alguns contaminantes podem crescer com pigmento amarelo.

ÁGAR MYCOSEL

Princípio

  • A Cicloheximida, um dos componentes do meio, serve para selecionar dermatófitos o cloranfenicol inibe o crescimento de bactérias e alguns fungos filamentosos.

Utilidade

  • Isolamento de fungos patogênicos, principalmente dermatófitos, a partir de material de investigação contaminado.

Fórmula / Produto

  • Meio comercial: Mycosel Ágar, Mycobiotic Ágar ou Ágar seletivo para fungos patogênicos.

Procedimentos

  • Pesar e hidratar o meio conforme instruções do fabricante;

  • Esterilizar em autoclave;

  • Resfriar à +/- 50ºC e distribuir em placas de 90 mm de diâmetro ou 4 ml por tubo;

  • Se distribuir em tubos, deixar solidificar com inclinação em forma de bico de flauta (ângulo de 45º).

  • pH: 6,9 +/- 0,1

Controle de qualidade

  • Crescimento bom a excelente: Trichophyton verrucosum ATCC 36058, Candida albicans ATCC 10231.

  • Crescimento inibido: Aspergillus niger ATCC 16404, Candida tropicalis, Penicillium spp.

Conservação e validade

  • Conservar embalado de 4 a 8°C por até 3 meses.

Inoculação

  • Inocular sempre dois tubos ou placas;

  • Se em placa: semear com a técnica de semeadura quantitativa;

  • Se em tubo: estriar na superfície inclinada do meio;

  • Incubar um dos meios semeados em temperatura ambiente e o outro a 37ºC;

  • Observar diariamente a presença ou não de crescimento;

  • Incubar 40 dias.

Interpretação

  • Cor original do meio: amarelo claro opalescente.

  • Após o crescimento, deve-se seguir a identificação do microrganismo que cresceu.

Recomendações

  • A ausência de crescimento não indica uma cultura negativa para fungos, pois alguns fungos podem ter o crescimento inibido neste meio.

  • Recomenda-se o uso de meios em tubos, pois a incubação demorada resseca com facilidade o meio contido em placas.

ÁGAR SABOURAUD

Princípio

  • Meio com nutrientes que favorece o crescimento de diversos fungos leve duriformes e filamentosos.

Utilidade

  • Cultivo e crescimento de espécies de Candidas efungos filamentosos, particularmente associados a infecções superficiais.

  • Caracterização macroscópica do fungo filamentoso (colônia gigante).

Fórmula / Produto

(Parte 6 de 18)

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