DATY Meios de Cultura Empregados nos Exames Microbiológicos ANVISA

DATY Meios de Cultura Empregados nos Exames Microbiológicos ANVISA

(Parte 7 de 18)

  • Meio comercial: Sabouraud Dextrose Ágar.

Procedimentos

  • Pesar e hidratar o meio conforme instruções do fabricante;

  • Esterilizar em autoclave;

  • Resfriar à +/- 50ºC e distribuir em placas de 90 mm de diâmetro ou 4 ml por tubo;

  • Se distribuir em tubos, deixar solidificar com inclinação em forma de bico de flauta (ângulo de 45º).

  • pH: 5,6 +/- 0,1

Controle de qualidade

  • Crescimento bom a excelente: Candida albicans ATCC 10231, Aspergillus niger ATCC 16404.

Conservação e validade

  • Conservar embalado de 4 a 8°C por até 6 meses.

Inoculação

  • Inocular sempre dois tubos ou placas;

  • Se em placa: semear com a técnica de semeadura quantitativa;

  • Se em tubo: semear na superfície inclinada do meio;

  • Incubar um dos meios semeados em temperatura ambiente e o outro à 37ºC;

  • Observar diariamente a presença ou não de crescimento;

  • Incubar 40 dias.

Interpretação

  • Cor original do meio: amarelo claro opalescente.

  • Após o crescimento, deve-se seguir a identificação do microrganismo que cresceu.

Recomendações

  • Recomenda-se o uso de meios em tubos, pois a incubação demorada resseca com facilidade o meio contido em placas.

  • Não usar meios vencidos e/ou ressecados.

  • Para suspeitas de Histoplamasma capsulatum e Paracoccidioides brasiliensis, semear em BHI ágar.

4. Meios comerciais para provas de identificação

Base de nitrogênio para leveduras – Yeast Nitrogen Base

Princípio

Determina a capacidade das leveduras de assimilar carboidratos, utilizando um meio a base de nitrogênio livre de carboidratos e discos de papel impregnados com carboidratos, nos quais observa-se o crescimento ao redor, após um período de incubação.

Utilidade

Identificar as espécies de leveduras através da prova de assimilação de carboidratos.

Fórmula / Produto

  • Meio comercial: Yeast Nitrogen Base ou Base de nitrogênio para leveduras.

  • Discos comerciais de carboidratos.

  • Discos preparados no laboratório, impregnados com soluções de carboidratos a 1%:

- Carboidrato 1 g

- Água destilada 100 ml

Procedimentos

Para os discos de carboidratos:

  • Se for preparar os discos com carboidratos, preparar 2 dias antes de fazer o meio;

  • Usar discos estéreis disponíveis para compra ou esterilizar papel de filtro de 10 mm de diâmetro em autoclave;

  • Pesar o carboidrato (cada carboidrato em frasco separado) e adicionar água, homogeneizar bem até completa dissolução - carboidratos utilizados: glicose, maltose, sacarose, lactose, galactose, melibiose, celobiose, inositol, xilose, rafinose, trealose, dulcitol;

  • Esterilizar por filtração (cada um em frasco separado);

  • Impregnar os discos previamente estéreis (embeber totalmente os discos);

  • Deixar os discos em estufa à 37ºC até secarem totalmente .

Para o meio base de nitrogênio:

  • Pesar e hidratar conforme instruções do fabricante;

  • Fundir completamente;

  • Distribuir 20 ml por tubo;

  • Esterilizar em autoclave.

Controle De Qualidade

CARBOIDRATOS

POSITIVO

NEGATIVO

Glicose

Maltose

Sacarose

Lactose

Galactose

Melibiose

Celobiose

Inositol

Xilose

Rafinose

Trealose

Dulcitol

Candida albicans

Candida albicans

Candida tropicalis

Candida kefyr

Candida albicans

Candida guilliermondii

Candida guilliermondii

Cryptococcus neoformans

Candida albicans

Candida guilliermondii

Candida albicans

Candida guilliermondii

Candida krusei

Candida krusei

Candida krusei

Candida krusei

Candida krusei

Candida krusei

Candida krusei

Candida krusei

Candida krusei

Candida krusei

Candida krusei

Conservação e validade

  • Meio base: 4 a 10ºC por 6 meses.

  • Discos: refrigerado e se possível em dessecador durante 1 ano ou mais.

Inoculação

  • Aquecer o tubo contendo 20 ml de meio base de nitrogênio até fundir totalmente;

  • Resfriar a base à 47 - 48ºC;

  • Fazer uma suspensão das leveduras na escala 4 ou 5 de McFarland em 4 ml de água destilada estéril, , usando um cultivo de leveduras de 24 a 72 horas;

  • Despejar a suspensão de leveduras no tubo contendo a base de nitrogênio;

  • Homogeneizar bem;

  • Despejar o conteúdo homogeneizado (meio base + suspensão de leveduras) em placa de Petri de estéril de 150 mm de diâmetro;

  • Esperar solidificar em temperatura ambiente;

  • Colocar os discos impregnados com carboidratos com auxílio de uma pinça flambada;

  • Incubar à 30ºC durante 18 a 24 horas.

Interpretação

  • Cor original do meio: amarelo palha.

  • Positivo: halo de crescimento ligeiramente opaco ao redor dos discos, que significa a assimilação do açúcar pela levedura.

  • Negativo: Ausência de halo de crescimento. O meio permanece inalterado.

Recomendações

  • Não usar cultivos de leveduras superiores a 72 horas;

  • Não usar inóculo inferior ao recomendado, pois pode resultar em prova falso - negativa;

  • Não adicionar a suspensão de leveduras à base com temperatura superior a 48ºC, pois pode inativar as células e resultar em prova falso - negativa;

  • Após homogeneizar o meio base e suspensão de leveduras, despejar imediatamente na placa de Petri, pois solidifica rapidamente.

ÁGAR CITRATO SIMMONS

Princípio

  • Verifica a capacidade da bactéria de utilizar o citrato de sódio como única fonte de carbono, juntamente com sais de amônia, alcalinizando o meio.

Utilidade

  • Diferenciar gêneros e espécies de enterobactérias e não fermentadores.

Fórmula / Produto

  • Meio comercial: Citrato Simmons.

Procedimentos

  • Pesar e hidratar o meio segundo instruções do fabricante;

  • Ajustar o pH para 6,9 ±0,2;

  • Aquecer sob agitação até fundir o ágar;

  • Distribuir em tubos com tampas de rosca;

  • Esterilizar em autoclave;

  • Retirar os tubos da autoclave e incliná-los ainda quentes, para que solidifiquem com a superfície em forma de bico de flauta (ângulo de 45°). Deixar solidificar em temperatura ambiente.

Controle de qualidade

  • Positivo: Klebsiella pneumoniae ATCC 13883.

  • Negativo: Escherichia coli ATCC 25922.

Inoculação

  • Com o auxílio de um fio bacteriológico, inocular na superfície a colônia, não furar a base;

  • Realizar o teste com colônias puras de 18 a 24 horas.

Interpretação

  • Cor original do meio: verde

  • Positivo: cor azul ou crescimento no local do inóculo.

  • Negativo: não há crescimento e a cor permanece inalterada.

  • Se houver crescimento visual na área do inóculo sem mudança de cor, o teste pode ser considerado positivo, reincubar por 24 até 72 horas, a incubação poderá mudar a cor do meio para alcalino (azul).

Leitura inicial com 24 horas:

  • Se resultado positivo: encerrar o teste.

  • Se resultado negativo ou houver dúvida: reincubar por mais 24/48 horas.

Leitura com 48 horas:

  • Se houver crescimento visível na área do inóculo sem mudança de cor, o teste pode ser considerado positivo, (encerrar o teste).

  • Se resultado negativo ou houver dúvida, reincubar por 24 até 72 horas, a incubação poderá mudar a cor do meio para alcalino(azul).

Conservação e validade

  • Conservar de 4 a 10°C de 6 a 8 semanas;

  • Após este período realizar controles negativo e positivo semanalmente.

Recomendações

  • Manter a tampa do tubo frouxa, o meio necessita de oxigênio.

  • Não se devem transportar colônias de meios que contenham glicose ou outros nutrientes/substratos, pois podem entrar em contato com o meio de citrato, podendo dar um resultado falso positivo.

  • Se algum resultado estiver duvidoso, inocular um novo tubo e incubar em temperatura ambiente (22 a 25°C) por até 7 dias.

  • Não usar repiques de caldo.

  • Deixar o tubo em temperatura ambiente antes de inocular a bactéria.

  • Para fazer o inóculo flambar o fio bacteriológico.

  • Não fazer inóculo muito denso (pode acidificar o meio deixando-o amarelo).

Ágar Bílis-Esculina

Princípio

  • A prova de Bile-Esculina é baseada na capacidade de algumas bactérias hidrolisarem esculina em presença de bílis. A esculina é um derivado glicosídico da cumarina. As duas moléculas do composto (glicose e 7-hidroxicumarina) estão unidas por uma ligação éster através do oxigênio. Aa esculina é incorporada em um meio contendo 4% de sais biliares.

  • As bactérias Bile-Esculina POSITIVAS, são capazes de crescer em presença de sais biliares. A hidrólise da esculina no meio resulta na formação de glicose e esculetina. A esculetina reage com íons férricos (fornecidos pelo composto inorgânico do meio - o citrato férrico), formando um complexo negro.

Utilidade

  • Separação dos Streptococcus Bile-Esculina positiva dos Bile-Esculina negativa.

  • Identificação dos Enterococcus spp., que são Bile-Esculina positiva.

  • Identificação de bacilos Gram negativos não fermentadores e enterobactérias, usar o meio sem bílis (vide prova de esculina).

Fórmula/ Produto

  • Meio comercial: Ágar Bílis-Esculina

(Parte 7 de 18)

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