DATY Meios de Cultura Empregados nos Exames Microbiológicos ANVISA

DATY Meios de Cultura Empregados nos Exames Microbiológicos ANVISA

(Parte 8 de 18)

Fórmula: Peptona 5 g

Extrato de carne 3 g

Bílis 40 g

Esculina 1 g

Citrato férrico 0,5 g

Ágar 15 g

Água destilada 1000 ml

pH = 7,0

Procedimentos

  • Pesar e hidratar o meio conforme instruções do fabricante;

  • Fundir o meio;

  • Distribuir 2,5 ml por tubo;

  • Esterilizar em autoclave;

  • Após retirar da autoclave, inclinar os tubos ainda quentes para que solidifiquem com a superfície em forma de "bico de flauta" (ângulo de 45º).

Controle de qualidade

  • Positivo: Enterococcus faecalis ATCC 29212.

  • Negativo: Streptococcus pyogenes ATCC 19615.

Conservação e validade

  • Conservar de 4 a 10°C por 4 meses.

Inoculação

  • Estriar a superfície inclinada do meio;

  • Incubar a 35ºC 24 horas.

Interpretação

Cor original do meio: acinzentado

  • Positivo: Enegrecimento em pelo menos metade ou mais do meio.

  • Negativo: Ausência de enegrecimento ou crescimento de menos da metade do meio após 72 horas de incubação.

Recomendações

  • Provas negativas com 24 horas de incubação, recomenda-se período de incubação maior (48 horas).

  • Alguns Streptococcus do grupo viridans (cerca de 3%) podem hidrolizar a esculina em presença de bílis se incubados em atmosfera de CO2.

Ágar Sangue - camp

Princípio

  • Consiste na interação da beta hemólise secretada pelo Staphylococcus aureus com o microrganismo em estudo, que secreta uma proteína, denominada "fator CAMP", produzindo aumento de hemólise no local da inoculação.

Utilidade

  • Separação do Streptococcus beta hemolíticopresumível do grupo B de Lancefield (S. agalactiae) e da Listeria monocytogenes (CAMP positivos) dos demais Streptococcus beta hemolíticos e espécies de Listeria.

Fórmula/ Produto

Para esta prova utiliza-se:

  • Placa de meio Ágar Sangue.

  • Cepa de Staphylococcus aureus produtora de beta hemolisina ATCC 25923.

Controle de qualidade

  • Positivo: Streptococcus agalactiae ATCC 13813.

  • Negativo: Streptococcus pyogenes ATCC 19615.

Inoculação

  • Com auxílio do fio bacteriológico, semear na superfície de meio Ágar Sangue a cepa de Staphylococcus aureus com uma única linha reta;

  • Novamente com o fio bacteriológico (flambado), tocar nas colônias em estudo;

  • Semear uma única linha reta na superfície do meio Ágar Sangue, perpendicularmente à linha de semeadura do S. aureus, sem tocar no inóculo do S. aureus;

  • Logo em seguida, sem flambar o fio, picar o meio Ágar Sangue duas vezes, uma de cada lado da semeadura da cepa em estudo, sem tocar nas duas linhas de inóculo já feitos (a do S. aureus e da cepa em estudo);

  • Incubar à 35ºC 24 horas.

  1. Inóculo do S. aureus

  2. Inóculo da cepa em estudo

Interpretação

  • Positivo: Aumento da área de hemólise em forma de flecha no local onde estão mais próximas as duas estrias de crescimento.

  • Negativo: Ausência de aumento da hemólise. Observa-se nitidamente a hemólise do S. aureus e da cepa em estudo, inalteradas.

Recomendação

  • Não utilizar cepas velhas de S. aureus, pois podem não produzir beta hemolisina.

  • Não tocar as estrias da semeadura das cepas, para não dar um resultado falso – negativo.

  • Não utilizar placas de Ágar Sangue velhas que dificultem a leitura da prova, já que é baseada na hemólise das cepas.

Caldo Base de Moeller

Princípio

  • As descarboxilases são um grupo de enzimas com substrato específico, capazes de reagir com o grupo carboxila dos aminoácidos para formarem aminas alcalinas. Essa reação, conhecida como descarboxilação, origina dióxido de carbono como produto secundário.

  • Emprega-se normalmente três aminoácidos para identificação dos microrganismos: lisina, ornitina e arginina. A base de Moeller é a mais utilizada. Os produtos aminados específicos, são:

  • Lisina: Cadaverina;

  • Ornitina: Putrescina;

  • Arginina: Citrulina.

A conversão da arginina em citrulina é uma atividade de diidrolase, e não descarboxilase, na qual o grupo NH2 é retirado da arginina como primeira etapa. Em seguida, a citrulina é convertida em ornitina, que sofre descarboxilação para formar putrescina.

  • A incubação deve ser em anaerobiose e para isso, é adicionado 1 ml de óleo mineral estéril após a inoculação. No início da incubação, a glicose contida no meio é fermentada e ocorre viragem de cor púrpura para o amarelo. Quando o aminoácido é descarboxilado, as aminas alcalinas formadas revertem a cor do meio para púrpura original.

Utilidade

  • Verificar a capacidade de microrganismos usarem enzimas, auxiliando na identificação.

  • Utilizado principalmente para identificações de enterobactérias, bacilos Gram negativos não fermentadores, estafilococos.

Fórmula / Produto

  • Meio base comercial: Caldo Base de Moeller para Descarboxilase.

  • Aminoácidos: L lisina ou DL lisina, L ornitina ou DL ornitina, L arginina ou DL arginina.

Procedimentos

  • Preparar os meios com a Base de Moeller e aminoácidos;

  • Preparar o meio apenas com a Base de Moeller, sem aminoácidos, que será usada como controle;

  • Seguir as recomendações do fabricante para pesar o meio Base de Moeller;

  • Se usar aminoácido L (levógiro),adicionar 1 grama do aminoácido para cada 100 ml de meio base;

  • Se usar aminoácido DL (dextrógiro),adicionar 2 gramas do aminoácido para cada 100 ml de meio base;

  • Homogeneizar bem o meio;

  • Acertar o pH para 6,0 com HCl 1 N ;

  • Distribuir 2 ml por tubo (usar tubos de rosca);

  • Esterilizar em autoclave.

Controle de qualidade

  • Positivo:

  • Lisina: Klebsiella pneumoniae ATCC 13883ou Enterobacter aerogenes ATCC 13047.

  • Ornitina: Enterobacter cloacae ATCC 13047ou Serratia marcescens ATCC 13880.

  • Arginina: Enterobacter cloacae ATCC 13047ou Enterobacter sakazakii.

  • Negativo:

  • Lisina: Enterobacter cloacae ATCC 13047 ou Citrobacter freundii ATCC 8454.

  • Ornitina: Klebsiella pneumoniae ATCC 13883ou Citrobacter freundii ATCC 8454.

  • Arginina: Enterobacter aerogenes ATCC 13047ou Klebsiella pneumoniae ATCC 13883.

Conservação e validade

  • Conservar entre 4 a 10 ºC por 3 meses.

Inoculação

  • A partir de crescimento recente, inocular a colônia em estudo no tubo contendo o aminoácido e no tubo controle;

  • Colocar aproximadamente 1 ml de óleo mineral estéril em cada tubo;

  • Incubar à 35 +/- 1ºC em aerobiose.

Interpretação

  • Cor original do meio: púrpura

  • Positivo:

  • Tubo controle (sem aminoácido) : amarelo e turvo - indica que o microrganismo é viável e o pH do meio abaixou o suficiente para ativar as enzimas descarboxilase.

  • Tubo com aminoácido: púrpura e turvo- indica a formação de aminas a partir da reação de descarboxilação.

  • Negativo:

  • Tubos controle e com aminoácido: púrpura.

Recomendações

  • Verificar se o inóculo foi satisfatório para o crescimento, pois a cor original do meio - púrpura, sem apresentar turvação não significa positividade e sim, ausência de crescimento bacteriano.

  • Como a reação ocorre em anaerobiose, é imprescindível a adição de óleo mineral.

  • Pode-se autoclavar o meio já com o óleo mineral ou adicionar após a inoculação do microrganismo.

  • Para alguns microrganismos, como bacilos Gram negativos não fermentadores, é necessário um período de incubação prolongado (24 a 72 horas).

Ágar DNase

Princípio

(Parte 8 de 18)

Comentários