DATY Meios de Cultura Empregados nos Exames Microbiológicos ANVISA

DATY Meios de Cultura Empregados nos Exames Microbiológicos ANVISA

(Parte 9 de 18)

  • Cepas de alguns microrganismos produzem DNase e endonuclease termoestável. Estas enzimas hidrolisam ácido desoxirribonucléico (DNA) contido no meio de cultura após um período de incubação. Posteriormente este meio é acidificado com HCl 1N para a revelação da prova.

Utilidade

Prova de identificação que separa os principais microrganismos de importância clínica, entre eles:

  • DNase positivos: Staphylococcus aureus , Serratia spp. e Proteus spp., Stenotrophomonas maltophilia, Cryseobacterium meningosepticum, Moraxella catarrhalis.

  • DNase negativos: Staphylococcus coagulase negativa, demais enterobactérias, demais bacilos Gram negativos não fermentadores.

Fórmula / Produto

  • Meio comercial: DNase Ágar.

Procedimentos

Pode-se revelar a prova de duas maneiras:

  • Com uma solução de ácido clorídrico 1 N

  • Adicionando à base do meio de cultura azul de Toluidina O.

  • Para a revelação com ácido clorídrico 1N:

  • Preparar e esterilizar o meio conforme instruções do fabricante;

  • Esfriar o meio à aproximadamente 50ºC;

  • Distribuir em placas de petri de 50 mm de diâmetro.

Preparar uma solução de HCl 1N, seguindo a fórmula abaixo:

N= C1 (número de equivalentes grama de soluto)

V (volume da solução)

C1 = M1 (peso molecular do soluto)

E (volume da solução)

E = M

x  x: para bases: OH desprendido na reação

para ácidos: H+ ionizáveis

para oxidantes / redutores: variação do NOX

para sais normais: valência do cátion ou ânion

  • Para a revelação com azul de Toluidina O:

  • Pesar e hidratar o meio conforme instruções do fabricante;

  • Acrescentar para cada 1000 ml de base 0,1g de azul de Toluidina O;

  • Esterilizar em autoclave;

  • Esfriar o meio à aproximadamente 50ºC;

  • Distribuir em placas de petri de 50 mm de diâmetro.

Controle de qualidade

  • Positivo: Staphylococcus aureus ATCC 25923 ou Serratia marcescens ATCC 13880.

  • Negativo: Staphylococcus epidermidis ATCC 12228ou Escherichia coli ATCC 25922.

Conservação e validade

  • Meio: 4 a 10 ºC por 3 meses.

  • Ácido Clorídrico 1N:

  • Guardar em frasco âmbar, em temperatura ambiente, ao abrigo de luz, calor e umidade.

  • Validade: 6 meses.

Inoculação

Para as duas técnicas de preparação, a inoculação é a mesma:

  • Com auxílio de um fio bacteriológico, tocar nas colônias em estudo e fazer um esfregaço circular e denso na placa de DNase ;

  • Incubar à 35 +/- 1ºC 24 horas.

Interpretação

Revelação com HCl 1 N:

  • Cor original do meio: amarelo claro

  • Colocar sobre o crescimento bacteriano HCl 1 N até banhar totalmente a superfície do meio;

  • Aguardar aproximadamente 3 minutos ou até que o meio fique opaco.

  • Positivo: Presença nítida de halo claro na parte inferior e em volta da colônia.

  • Negativo: Ausência de halo claro em volta da colônia.

revelação com azul de toluidina o:

  • Cor original do meio: azul claro

  • Positivo: Presença de coloração rosa na parte inferior e em volta da colônia.

  • Negativo: Ausência de cor rosa. O meio permanece com a cor original, azul.

Recomendações

  • Usar sempre uma cepa controle positivo para facilitar a leitura da prova;

  • Em uma mesma placa, pode-se fazer até 4 testes (placas de 50 mm de diâmetro);

  • armazenamento incorreto e uso com validade vencida do HCl 1 N pode dar leituras falso negativas;

  • Para a detecção da atividade de DNase não é necessário que haja crescimento, por isso é que a semeadura deve ser de forma circular densa e não de estria;

  • Para o meio preparado com Azul de Toluidina O, algumas cepas requerem um período maior de incubação (até 48 horas) para produzirem DNase;

  • Usar cultura jovem (até 24 horas).

ÁGAR ESCULINA

Princípio

  • Verifica se a bactéria é capaz de hidrolisar a esculina.

  • A esculetina exige sais de ferro formando precipitado marrom escuro ou preto.

Utilidade

  • Diferenciar gêneros e espécies de enterobactérias e não fermentadores;

  • Para identificação de Streptococcus e Enterococcus, usar o meio com bílis, vide prova de Bile-Esculina.

Fórmula /Produto

  • Ágar tríptico de soja (TSA) ou base de ágar sangue 4 g

  • Citrato férrico 0,05 g

  • Esculina 0,1 g

  • Água destilada 100 ml

Procedimentos

  • Pesar o TSA ou a base de ágar sangue, o citrato férrico e a esculina e colocar tudo no mesmo Erlenmeyer;

  • Colocar água destilada;

  • Ajustar o pH para 7,0;

  • Aquecer lentamente até fundir o ágar e dissolver o citrato férrico (lentamente porque o citrato férrico demora a dissolver);

  • Distribuir 3 ml do meio em tubos com tampa de rosca;

  • Esterilizar em autoclave;

  • Retirar os tubos da autoclave e incliná-los ainda quentes para que solidifiquem com a superfície em forma de bico de flauta (ângulo de 45°). Deixar solidificar em temperatura ambiente.

Controle de qualidade

  • Positivo: Klebsiella pneumoniae ATCC 13883.

  • Negativo: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.

Inoculação

  • Inocular colônias de crescimento recente (18 – 24 hs);

  • Picar o meio e semear na superfície do ágar;

  • Incubar a 35 °C por 24 horas.

Interpretação

  • Cor original do meio: palha.

  • Positivo: marrom escuro ou preto.

  • Negativo: inalterado (palha).

Conservação e validade

  • Conservar de 4 a 8°C, de 6 a 8 semanas.

  • Após este período realizar controle negativo e positivo semanalmente.

Recomendações

  • A enzima glicosidase é responsável pela hidrólise da esculina em todas as enterobactérias exceto a Escherichia coli. A Escherichia coli não possue a enzima glicosidase sendo necessário usar a lactose, outro dissacarídeo ou outra fonte de carbono. Fazer um inóculo leve com agulha bacteriológica e interpretar após 18-24 horas.

  • A produção de piocina pela Pseudomonas aeruginosa pode escurecer o meio, isso não é uma reação positiva.

  • Resultado falso positivo pode ocorrer pela produção de H²S em não fermentadores, semelhante ao bacilo da bactéria Shewanella putrefaciens.

ÁGAR FENILALANINA

Princípio

  • Verifica a capacidade da bactéria de produzir ácido fenilpirúvico a partir da fenilalanina por ação enzimática.

Utilidade

  • Diferenciar gêneros e espécies de enterobactérias.

Fórmula / Produto

  • Meio comercial: Ágar Fenilalanina

Solução de cloreto férrico:

Cloreto férrico 10 g

Adicionar 100 ml de água destilada

Colocar em frasco âmbar.

Validade: 6 meses

(Parte 9 de 18)

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