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Métodos de transformação genética

Módulo de Transformação Genética e Melhoramento Março 2009, Departamento de Botânica, Universidade de Coimbra

Objectivos da aula -Métodos de transformação genética

Transferência genética mediada pelo Agrobacterium

O Agrabacteriumtumefaciens e a doença do galho do colo O processo de transferência e integração do T-DNA

Aplicações práticas da transformação por Agrobacterium

Transformação inplanta por “floral dip”

Vantagens e problemas da transformação genética mediada pelo A. tumefaciens

Transformação genética directa

Bombardeamento de partículas (ou biolística)

Mecanismo de funcionamento Parâmetros a optimizar em cada espécie

Transformação inplanta por pistola genética

Transformação de cloroplastos

Transferência directa de DNA para protoplastos

Electroporação

Metodologias de detecção da incorporação do transgene

Factores não controláveis no processo de transformação

O produto final

Métodos de transformação genética

A transformação genética depende da introdução estável do transgene no genoma da planta.

Existem dois tipos de métodos para atingir este objectivo:

Transformação genética mediada por Agrobacterium

Transformação genética directa

Bombardeamento de partículas (ou biolística)

Electroporação

Transferência directa de DNA para protoplastos

Transferência genética mediada pelo Agrobacterium – O Agrobacterium tumefaciens

Bactéria da rizoesferaGram (-) com forma de bastonete que provoca a doença do galho do colo.

A doença do galho do colo é economicamente importante em muitas plantas (particularmente videiras, roseiras e macieiras) e caracteriza-se pelo crescimento de um tecido tumoral.

A capacidade de despoletar o galho do colo depende da capacidade do Agrobacteriumde transferir genes bacterianos para o genoma vegetal.

Os paralelismos aparentes entre o galho do colo e os tumores animais atraíram a atenção dos cientistas nas décadas de 60 e 70 para esta doença –desconheciam ainda as aplicações extraordinárias que iria ter na biotecnologia vegetal!

A doença do galho do colo

O A. tumefacienssobrevive normalmente de nutrientes libertados pelas raízes das plantas.

Todavia, se a planta tiver uma lesão, o A. tumefaciens pode infectá-la nesse local e provocar a doença.

O A. tumefaciens é atraído para o local da lesão por quimiotaxia, em resposta a açúcares e compostos fenólicos libertados pela células danificadas da planta.

O DNA do plasmídeo é transferido do A. tumefaciens para a o DNA das células vegetais, provocando a doença do galho do colo.

A doença do galho do colo

O sucesso da transferência do DNA depende de um plasmídeo –plasmídeo Ti (indutor de tumores).

Parte do plasmídeo –o T-DNA(DNA de transferência) é transferido da bactéria para o a célula vegetal onde se integra no genoma.

O T-DNA apresenta genes que codificam proteínas envolvidas na síntese de hormonas(auxinas e citoquininas) e de metabolitos novos para a planta (opinas e agropinas).

As hormonas induzem a proliferação celular formando o galho, enquanto que as opinas (derivado de aminoácidos) e agropinas (derivados de açúcar) são a fonte de carbono e energia para o Agrobacterium.

Estirpes diferentes de A. tumefaciens apresentam plasmídeos Ti que codificam a produção de opinas de diferentes tipos (e.g., octopina, nopalina).

A bactéria “usurpa” a maquinaria de síntese da planta para produzir nutrientes que só ela é capaz de utilizar.

A doença do galho do colo 3/24/2009João Loureiro7

O plasmídeo Ti

Plasmídeo de grandes dimensões (≈200 kb).

Características em comum dos plasmídeos das diversas estirpes de A. tumefaciens:

Região T-DNA (uma ou mais)

Região vir

Região de replicação

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