Eletroforese

Eletroforese

Eletroforese Eletroforese

Eletroforese –para separar e às vezes purificar macromoléculas – proteínas e ácidos nucléicos –diferentes tamanhos, carga ou conformação

Quando moléculas são colocadas em um campo elétrico, migram para o pólo positivo ou negativo.Proteínas (carga líquida negativa ou positiva) e DNA sempre negativa (fosfato)

Eletroforese ocorre dentro de uma matriz ou gel O gel ésubmerso em um tampão que possui íons para a corrente passar E também para manter o pH mais ou menos constante.

Gel: composto de agarose ou poliacrilamida

Agaroseéum polissacarídeo extraído de alga marinha. Usada em concentrações de 0,5 to 2%. Fácil de preparar. Não-tóxico.

Géis de Agarose possuem ampla capacidade de separação mas baixa resolução Dependendo da concentração podem separar fragmentos de DNA de 200 a 50.0 bp, via eletroforese.

Poliacrilamidaéum polímero de ligação cruzada de acrilamida. Comprimento das cadeias do polímero dependem da concentração usada (3,5 a 20%). São mais difíceis de preparar. Como oxigênio inibe a polimerização precisam ser montados entre placas de vidro.

Acrilamida: potente neurotóxico e deve ser manipulado com cuidado!!! Luvas e máscaras devem ser usadas para pesar o pó. A poliacrilamida é considerada não tóxica mas luvas devem ser usadas pela possível presença de acrilamida livre

Géis de poliacrilamida possuem baixa capacidade de separação mas alta capacidade de resolução. Para DNA a poliacrilamida éusada para separar fragmentos de menos de 500 bp. Às vezes podem ser separados fragmentos com tamanho de apenas uma base de diferença. Também usados para separação de proteínas.

Equipamento e reagentes para gel de agarose:

•Uma cuba de eletroforese e um fonte de força •Bandejas de Gel, em diferentes tamanhos de plástico transparente àUV. As extremidades são abertas para montar o gel e depois removidasna eletroforese

•Pentespara fazer poços aonde as amostras serão aplicadas

•Tampão de eletroforese (corrida), Tris-acetato-EDTA (TAE) ou Tris-borato-EDTA (TBE).

•Tampão de amostramaterial denso (glicerol por ex.) e com cor para ver a amostra Migração: Azul de bromofenol (300bp) e xileno cianol (4000bp)

•Brometo de Etídeo, corante fluorescente usado para corar ácidos nucléicos. Atenção: Luvas sempre pois o brometo de etídeo éum agente mutagênico

•Transiluminador(caixa de luz UV), usado para visualizar o DNA corado com EtBr Atenção: sempre usar proteção nos olhos (UV) http://www.stolaf.edu/people/muth/7-16-04%20007.jpg http://www.stolaf.edu/people/muth/7-16-04%20007.jpg

Tampão de amostra Tampão de amostra

O corante mais comum para géis de agarose éo brometo de etídio

(EtBr). Ele fluoresce sob luz UV quando intercalado nas bases deDNA (ou RNA)

Correndo o DNA em um gel tratado com EtBr e olhando sob UV podemos ver as bandas de DNA.

http://en.wi kipedi a.org/wiki/A garose_gel_el ectrophoresi s

SYBR Green > Molecular Probes 1995

> Revolucionou a detecção de DNA em géis

A intensidade da fluorescência do SYBR Green éaumentada em 100X quando se liga ao DNA. Consegue-se ver picogramas de DNA.

Junto a sua sensibilidade superior o SYBR Green tem outras vantagens sobre o EtBr: -Émuito menos mutagênico,

-Pode ser adicionado diretamente à amostra antes da eletroforese.

Eletroforese Vertical Eletroforese Vertical

Coomassie Blue

Coomassie Brilliant Blue R250, se liga inespecificamente a praticamente todas as proteínas. Émenos sensível que corar com a prata mas efetivo também, além de ser fácil de corar.

Método da Prata

A maior vantagem éa sensibilidade sobre os outros métodos. Tipicamente 50X maior que com Coomassie* Brilliant Blue R-250.

Sensibilidade maior oferece vantagens como menos amostra no gel e análise de amostra diluída.

A prata pode detectar também ácidos nucléicos, glicoproteínas e lipoproteínas.

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