Análise de geis binários de polissacarídeos por microscopia de força atômica

Análise de geis binários de polissacarídeos por microscopia de força atômica

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Prof. Dr.Paulo César de Camargo Departamento de Física Universidade Federal do Paraná

CURITIBA OUT/2007

1. INTRODUÇÃO

Vários avanços feitos na caracterização de polissacarídeos nas últimas duas décadas têm sidopossível devidométodos de espectometria de massa, ressonância nuclear magnética( NMR )

, modelagem molecular e métodos de extração. Paralelamente técnicas de imagem, incluindo microscopia ótica e microscopias eletrônicas de transmissão e varredura têm sido utilizadas para visualizar polissacarídeos, porém, com freqüência, as amostras observadas possuem alterações de artefatos ocorridos durante o preparo da amostra. A microscopia de força atômica ( AFM) tem sido um método de imagem usado para estudar a ultraestrutura de macromoléculas com mínimas alterações

Hansma, Hoh, 1994; Kirby, Gunning, Morris, 1996; Allen et al., 1997;

Brant, 1999; Czajkowsky, Iwamoto, Shao, 2000)

. Nesta técnica uma ponta fina presa a um suporte flexível, cantilever, explora a superfície da amostra. A interação entre a ponta e a amostra causa deflexão no cantilever, a qualé monitorada e traduzida numa imagem tridimensionalnuma escala micro a nanométrica ( Hansma, Hoh, 1994)

. 2.PRINCÍPIOS FÍSICOS DO MICROSCÓPIO DE FORÇA ATÔMICA

O AFM, ou microscópio de força atômica, ou ainda, SFM (

Scanning Force

Microscope )

, foi inventado por Binning, Quate e Gerber, após observação que a ponta doSTM exerce forças sobre a superfície da amostra na mesma ordem das forças interatômicas,ou seja, o AFM usa interação entre as forças sonda-amostra para traçar o mapa da superfície( Fukui, 1992)

.O microscópio de força atômica pode ser operado de diversos modos. Entretanto, seuprincípio fundamental é a medida das deflexões de um suporte em cuja extremidade livre estámontada a sonda. Estas deflexões são causadas pelas forças que agem entre a sonda e aamostra. Os modos de fazer as imagens, também chamados modos de varredura ou de operação,referem-se fundamentalmente à distância mantida entre a sonda ( ponteira ) e a amostra, nomomento da varredura, e às formas de movimentar a ponteira sobre a superfície a serestudada.

Estes modos de fazer imagenspodem serde diferentes modos: modo contato, modo não-contato,“tapping mode”,dependendo das forças líquidas entre a ponteira e a amostra. Quando oaparelho é operado na região atrativa, o método chama-se nãocontato. Nesta região, ocantilever de AFM seenverga na direção da amostra. A operação na região repulsiva chama-secontato e o cantilever se dobra, afastando-se da amostra.A figura1 mostra a deflexão do cantilever em ambos modos. No modo de não contatoele é atraído pelas forças de capilaridade da camada de contaminação ou pelas forçasde van der Waals, quando a amostra é limpa. No modo de contato, vê-se como a deflexãodo cantilever é na direção oposta à da amostra.

Fig. 1- Deflexão do cantilever operando em não-contato e em contato.

O AFM opera medindo as forças entre a ponteira e a amostra que dependem de diversos fatores como, por exemplo, dos materiais que compõem a amostra e a ponteira, da distância entre elas, da geometria da ponteira e de qualquer tipo de contaminação que houver sobrea superfície da amostra.

Quando a ponteira se aproxima da amostra, é primeiramente atraída pela superfície, devido a uma ampla gama de forças atrativas existentes na região, como as forças de van der Waals. Esta atração aumenta até que, quando a ponteira aproxima-se muito da amostra, os átomos de ambas estão tão próximos que seus orbitais eletrônicos começam a se repelir. Esta repulsão eletrostática enfraquece a força atrativa à medida que a distância diminui. A força anula-se quando a distância entre os átomos é da ordem de alguns ângstroms ( da ordem da distância característica de uma união química)

. Quando as forças se tornam positivas, podemos dizer que os átomos da ponteira e da amostra estão em contato e as forças repulsivas acabam por dominar ( Fig.2 )

. As propriedades micromecânicas da superfície celular e camadas inferiores podem ser detectadas tanto pelas técnicas de AFM no modo de contato ( force modulation, microscopia de forças laterais e análise de curva de força) ou por imagens

de fase no modo tapping ( modo intermitente ou semi contato)

Fig. 2- Forças entre a ponteira e a amostra em função da distância entre elas, com os respectivos regimes de operação.

Análises da superfície celular por técnicas de AFM podem revelar heterogeneidades de propriedades mecânicas da superfície a nível nano e também das camadas inferiores. A resolução do AFM,ao ar ambiente,na direção vertical é de aproximadamente 0,1-0,5 nm e na direção horizontal de 1-5 nm, dependendo da dureza da amostra. Aresolução horizontal pode ser resolvida em células vivas em meio aquoso numa faixa no nível de dezenas de nanometrosde acordo com a textura da membrana celular. A espessura da membrana celular é conhecida em torno de 5-10 nm, ao analisar a sua heterogeneidade pelas técnicas de AFM é possível criar a figura da estrutura celular em certas regiões numa célula individual. A sensibilidade e resolução do método de AFM dependem tanto das características da ponta quanto do cantilever ( por ex. raio, forma e material) ( Alessandrini, Facci, 2005)

. A técnica básica de AFM para o estudo quantitativo das características mecânicas das células e tecidos é a espectroscopia de força ( análise de curva de força)

Ao calcular a força e a deflexão vertical do cantilever, a pontaaproxima-se da superfície sob estudo num dado ponto e realiza a análise da curva de força. Este valor versus a distância entre a ponta e a superfície pode ser plotada, este gráfico contém informações sobre as interações em níveis muito próximos e medianose representam uma base para a estimativa do módulo de Young. Atualmente há um sério problema em estimar um valor absoluto do módulo de Young celular usando análises de curva de força de AFM devido a questão da escolha do modelo mecânico. O modelo de Hertztem sido escolhido na maioria dos artigos publicados onde o módulo de Young foi avaliado. O modelo de Hertz descreve a deformação elástica de dois materiais perfeitamente homogêneos e moles que estão em contato um com o outro ( Hertz, 1881; Johnson,

.Há duas considerações importantes do modelo de Hertz que precisam ser levadas

em conta: (i) o corpo que adentra deve ter uma ponta parabólica e ( i ) a amostra que é adentrada deve ser suficientemente espessa em relação a profundidade de penetração

. Devido ao fato que a superfície celular é heterogênea a avaliação do módulo de Young, usando o modelo de Hertz, assume um erro.

Um segundo modelo usado para estudar propriedades celulares elásticas através dos dados da espectroscopia de força é um modelo baseado na teoria de conchas elásticas ( A-Hassan et al., 1998; Scheffer et al., 2001)

. Esta teoria considera as células como conchas cheias de líquido, desta forma o módulo de Young pode ser analisado pela relação entre o módulo de Young efetivo, a espessura da concha e o módulo de flexão. A questão neste procedimento é a determinação das condições de flexão para o cálculo das constantes envolvidas na relação principal e na definição do raio de contato da ponta com a amostra.

Entre outros modelos teóricos usados na análise das características mecânicas da célula pode ser mencionado o modelo do elemento finito, o qual é o modelo mais popular para a análise de elasticidade na engenharia ( Ohashi et al., 2002)

Os valores dos parâmetros de elasticidade diferem de acordo com o modelo adotado. A aproximação experimental pelo AFM chamado de mapeamento da força de integração de limites iguais ( FIEL )

, para a obtenção de gráficos quantitativos foi desenvolvida em 1998 ( A-Hassan et al., 1998)

.A teoria FIEL estabelece uma relação simples entre os valores das ações realizadaspelo cantilever do AFM durante o momento que a ponta adentra a amostra e as constantes elásticas em diferentes posições da superfície.

As curvas de força numa certa área permitem a criação de mapas de elasticidade da superfície celular. As características da oscilação do cantilever oferecem informações sobre as propriedades elásticas e de fricção da amostra. A imagem das alterações oscilatórias características representam as propriedades relativas da superfície celular

3.O MICROSCÓPIO DE FORÇA ATÔMICA

No AFM, a ponta de prova é varrida sobre a superfície de uma amostra,esta ponta está acoplada a um suporte chamado cantilever, que é flexível, forças entre a ponteira e a amostra causam deflexõesmuito pequenas deste suporte, que são detectados e apresentados como imagens.

O AFMusa muito dos elementos originalmente desenvolvidos para o STM.

Essesequipamentos comuns são: os sistemas de varredura, de aproximação pontaamostra, decontrole e de aquisição e processamento de dados, por esse motivo, as vezes, é consideradocomo um modo de operação, e em alguns casos uma simples troca de cabeças ( detunelamento ou força atômica) irá caracterizar um ou outro equipamento

O cantilever pode ter forma de V ou dehaste, em geral retangular. A força que a amostra exerce sobre a ponteira é determinada peladeflexão do cantilever, dada pela lei de Hook.

F =-k x ,Eq.1 sendo x o deslocamento do cantilevere k a sua constante de mola própria, determinada pelas características de construção. Ocantilever possui duas propriedades importantes: a constante de mola e sua freqüência deressonância. A primeira determina a força entre a ponteira e a amostra quando estão próximase é determinada pela geometria e pelo material utilizado na construção do cantilever.

O componente mais importante do AFM é, sem dúvida, o cantilever. São necessáriasgrandes deflexões para atingir alta sensibilidade. Portanto, a mola deve ser tão macia quantopossível. Por outro lado, é preciso uma alta freqüência de ressonância para minimizar asensibilidade a vibrações mecânicas, especialmente quando se está fazendo a varredura. Comoa freqüência de ressonância do sistema da mola é dada por:

1/2Eq. 2 onde: m é a massa efetiva que carrega a mola, é claro que um grande valor deω0 para umamola relativamente mole ( k pequeno) pode ser conseguido mantendo pequena a massa m e,portanto, a dimensão do sensor deve ser tão pequena quanto possível.

4.APLICAÇÃO DA MICROSCOPIA DE FORÇA ATÔMICA NA OBSERVAÇÃO DE POLISSACARÍDEOS

AFMtem sido usado para obter imagens de moléculas de polissacarídeos, incluindo pectinas ( Round et al., 1997; Czajkowsky,Iwamoto, Shao,2000)

, acetan, gelana, xantana e carragenana (

Kirby, Gunning, Morris, 1996; McIntire, Brant, 1997,

1999) .Foram feitas imagens da superfície de grânulos de amido de batata e trigo, rompidos mecanicamente ( Baldwin, Davies, Melia, 1997; Ohtani et al., 2000)

, assim como, a estrutura interna de amido de milho(

Baker, Miles, Helbert, 2001; Liu et al.,

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