tecnologia do DNA recombinante

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O papel do cálcio é explicado pela hipótese de que a 0oC a fluidez da membrana celular é cristalizada, estabilizando a distribuição dos fosfatos carregados. Os íons Ca+2 formam um complexo com este grupamento, cobrindo as cargas negativas e assim facilitando a atração eletrostática com as moléculas do DNA na zona de adesão. O choque térmico, complementa este processo de captação, provavelmente criando um desbalanço térmico entre o interior e o exterior da célula bacteriana, auxiliando o bombeamento do DNA através da zona de adesão. A figura 7 ilustra este processo.

Figura 7. Mecanismo molecular proposto para explicar a transformação de E. coli com uma molécula de DNA exógeno.

II. VETORES DE CLONAGEM MOLECULAR

Após o isolamento de uma informação genética, por exemplo um fragmento de DNA obtido pela clivagem com enzimas de restrição, este fragmento deverá ser inserido numa outra molécula de DNA diferente, capaz de amplificar aquela informação genética em centenas de cópias. Este processo de amplificação é obtido através do uso de moléculas de DNA que são os chamados vetores de clonagem molecular.

Atualmente, os tipos básicos de vetores usados na metodologia do DNA recombinante apresentam características especiais que os tornam excelentes veículos de clonagem em diferentes situações.

A seguir, vamos apresentar os principais tipos de vetores atualmente em uso na biologia molecular.

1. PLASMÍDEO

Plasmídeos são pequenas moléculas de DNA dupla fita, contendo os elementos necessários para a sua replicação e pelo menos um gene que confere resistência a antibiótico. Estes elementos genéticos extra cromossomais variam de 5 a 400 kilobases e comumente estão presentes em duas ou mais cópias por célula. Os plasmídeos presentes num grande número de cópias são usados como veículos de clonagem desde que capacitem a amplificação do segmento do DNA neles clonado.

Um plasmídeo para ser um bom vetor de clonagem deve conter as seguintes propriedades:

a) possuir uma origem de replicação (O), ou seja, uma seqüência de DNA que permita que o vetor seja replicado na célula hospedeira;

b) apresentar dois ou mais sítios únicos de clivagem para endonucleases de restrição. O conjunto destes sítios, denominado de Múltiplos Sítios de Clonagem (MSC), é o local onde o inserto é incorporado ao vetor de clonagem;

c) possuir um gene que codifica um produto que distingue a célula transformada da célula não transformada. Por exemplo, muitos vetores de clonagem carregam o gene que confere resistência à ampicilina (AmpR). As células transformadas com tais vetores são capazes de crescer num meio contendo o antibiótico, enquanto que as células não tranformadas acabam morrendo.

A figura a seguir ilustra as principais características estruturais de um plasmídeo.

Figura 8. Estrutura molecular de um plasmídeo típico usado em clonagem molecular. Estão representados o gene de resistência (AmpR), a região de múltiplos sítios de clonagem (MSC) e a origem de replicação (O).

Um dos passos fundamentais no processo de clonagem molecular é o uso de enzima de restrição que produz extremidades compatíveis durante a clivagem do DNA a ser clonado (inserto) e a do DNA receptor (vetor).

Uma vez que o DNA foi ligado ao vetor, esta molécula híbrida deverá ser introduzida numa célula hospedeira geralmente bactérias, por um processo chamado de transformação, para que o vetor possa sofrer replicações e consequentemente amplificar o número de cópias do inserto. A bactéria transformada será facilmente reconhecida pela aquisição de um novo fenótipo dado pelo plasmídeo, ou seja, capacidade de crescer em meios contendo antibiótico.

2. FAGOS

Um dos vetores mais utilizados nos processos de clonagem molecular é o denominado bacteriófago l, o qual comporta-se como um vírus da E.coli. Antes de analisarmos o uso deste elemento como veículo de clonagem molecular, vamos mostrar resumidamente as suas propriedades biológicas e estruturais.

2.1 Biologia do fago l

O fago l é um parasita obrigatório da E.coli, o qual necessariamente deve injetar o seu DNA na bactéria hospedeira para a sua multiplicação. Após a infecção da E.coli o genoma do fago pode seguir duas vias:

a) No primeiro caso denominado estado lítico, o DNA do fago permanece na bactéria como uma molécula independente, havendo a ativação de alguns genes do fago e a concomitante inativação de outros, dentro de um programa estritamente definido. Como resultado o cromossomo do fago é replicado ativamente, ocorre a síntese das proteínas da capa e da cauda e formam-se novas partículas virais. Em aproximadamente 45 minutos após a infecção a célula hospedeira é lisada havendo a liberação de cerca de 100 novos fagos.

b) A outra via que o cromossomo do fago pode seguir é o denominado estado lisogênico. Neste caso, o DNA do fago é integrado no cromossomo da bactéria passando a ser chamado profago. No estado lisogênico, todos os genes do profago estão inativos com excessão do gene que produz a proteína repressora. A bactéria hospedeira carregando o profago multiplica-se e este é replicado passivamente e distribuído para as bactérias descendentes.

Em condições naturais a opção entre seguir o estado lítico ou lisogênico depende das condições do meio. Assim, via de regra, em meio rico em nutrientes o estado lítico é preferencial, por exemplo o fago l na bactéria E.coli intestinal. Por outro lado, em meio pobre de nutrientes como é o caso da E.coli no solo, o fago prefere o estado lisogênico. Em condições experimentais, o estado a ser seguido depende de um balanço entre os fatores do meio intra e extra celular e de fatores genéticos da bactéria hospedeira e do bacteriófago.

2.2 Genoma do fago

O bacteriófago é uma partícula viral constituída de aproximadamente 50% de proteínas e 50% de DNA. O DNA do fago , na forma como ele é isolado da partícula viral, é uma molécula linear com dupla fita de aproximadamente 48.500 pares de bases. As extremidades da molécula contêm uma fração de DNA fita simples com cerca de 12 nucleotídeos, os quais são complementares na sequência de bases e através delas é que o DNA assume a forma circular quando ele é injetado na célula hospedeira. Estas extremidades são denominadas de sítios cos. O genoma do fago codifica para aproximadamente 50 proteínas, cujos genes tem um cronograma de expressão bem definido, o que determina a instalação do estado lítico ou lisogênico.

As figuras 9 e 10 ilustram o ciclo biológico do fago l em uma célula hospedeira e o genoma do fago com alguns dos seus principais genes, respectivamente.

2.3 Controle de expressão dos genes do fago

Seja qual for a via a ser seguida pelo fago , ou seja via lítica ou lisogênica, a expressão dos genes envolvidos nestes circuitos começa pelos produtos dos genes N e Cro, regulados pelos promotores pL e pR respectivamente situados à esquerda (pL) e à direita (pR) do gene cI.

Durante o transcurso da via lítica, o produto do gene cro está diretamente relacionado com a replicação do genoma do fago , através da indução da expressão dos genes OP. Por outro lado, o produto do gene N está diretamente relacionado com a expressão dos genes da região de empacotamento, ou seja genes A e J, responsáveis pela síntese das proteínas da cabeça e da cauda do fago , como também da expressão dos genes S e R, diretamente envolvidos com a lise da célula hospedeira.

Figura 9. Replicação do fago l no interior da célula hospedeira. Após adsorção (1) e injeção (2) do genoma do fago na bactéria, a via lítica indicada pelos números 3, 4 e 5 leva a formação de novas partículas virais. Alternativamente, a via lisogênica (6) pode ser ativada levando à integração do material genético viral ao genoma da bactéria hospedeira.

Figura 10. Representação esquemática do genoma do fago l.

Durante a via lisogênica, a transcrição também inicia-se pelos promotores pL e pR coordenando a expressão dos genes cII e cIII. O produto destes dois genes coordena a expressão do gene cI que produz uma proteína repressora inibindo a expressão dos genes responsáveis pelo empacotamento e a lise. Por outro lado, um outro gene importante é o int, cujo produto relaciona-se com a integração do fago no genoma bacteriano estabelecendo o estado lisogênico.

2.4 O uso do fago como vetor de clonagem molecular

Durante o ciclo lítico, os genes envolvidos no processo de lisogênia são dispensáveis e consequentemente a região de integração do genoma do fago pode ser totalmente substituída por um outro fragmento de DNA, sem que haja qualquer alteração nos processos envolvidos na via lítica.

Uma das maiores vantagens de usar o fago como vetor de clonagem é que o DNA inserido no fago é empacotado in vitro. Embora a eficiência de empacotamento seja cerca de 10%, uma vez que os fagos são empacotados teremos 100% de eficiência na infecção da E.coli hospedeira. Este processo é altamente eficiente quando comparado com o da transformação bacteriana com plasmídeos. Neste caso, os melhores resultados situam-se ao redor de 108 transformantes por µg de DNA o que significa que menos de 1 em 1000 plasmídeos são incorporados na E.coli hospedeira.

Atualmente, existem vários derivados do fago nos quais um ou mais sítios de restrição flanqueiam a região de recombinação, facilitando a sua substituição por um outro DNA. Estes são os chamados vetores de substituição. Um exemplo típico destes vetores é o EMBL3, no qual a região de recombinação é flanqueada pelas enzimas de restrição EcoRI, BamHI e SalI. Esse vetor quando quando clivado pode receber fragmentos de DNA variando de 10,4 a 20 kb, como mostra a figura abaixo.

Outros derivados do fago l são os chamados vetores de inserção. Neste tipo de vetor, os fragmentos de DNA que podem ser inseridos devem ter no máximo até 7kb de tamanho para não alterar os processos de empacotamento do genoma do fago.

Os vetores de inserção derivados do fago l mais bem utilizados especialmente na clonagem de cDNA, são os vetores lgt10 e o lgt11. Vamos a seguir fazer algumas considerações sobre estes dois tipos de vetores.

No fago lgt10, o inserto geralmente cDNA, é inserido no sítio da EcoRI situado no gene repressor cI. O fago recombinante terá agora o gene cI obstruído e consequentemente durante a cultura provocará a lise das colônias de bactérias transformadas. Essas colônias lisadas são visualizadas como círculos com o centro claro (placas de lise), bastante distintos das colônias não recombinantes, que por possuírem o gene cI íntegro não são lisadas e permanecem como colônias turvas.

Figura 11. Representação esquemática da clonagem de um fragmento de DNA genômico no fago . As regiões indicadas por a contém todas as informações necessárias para replicação em E. coli e empacotamento in vitro. Os diferentes fragmentos obtidos da digestão do DNA de interesse com enzima apropriada estão indicados pelas letras b e c, onde somente c possui tamanho adequado para o empacotamento.

Por outro lado, o fago lgt11 contêm um sítio de restrição EcoRI localizado num gene chamado LacZ, a 53 nucleotídeos do códon de término da enzima codificada por esse gene (b-galactosidase). Essa enzima, cuja expressão pode ser induzida por IPTG (isopropil--D-galactosídeo), degrada o substrato X-gal produzindo um precipitado de cor azul. Portanto, colônias de bactérias carregando o DNA do fago com o gene LacZ intacto (sem inserto), na presença do indutor IPTG e do substrato X-gal, ficarão azuis. Enquanto que, aquelas portanto o DNA o fago que incorporou o inserto no sítio de EcoRI, não expressam a -galactosidade e permanecem de cor branca, o que facilita a identificação dos clones recombinantes.

3. COSMÍDEO

A clonagem de fragmentos de DNA no fago l apresenta uma limitação, pois o fragmento a ser clonado não pode ser maior do que cerca de 15kb (Figura 12). Na maioria das vezes, esta dimensão é suficiente para conter um gene completo, incluindo as sequências flanqueadoras. Entretanto, muitos genes apresentam dimensões da ordem de 35 a 40 kb e nestes casos, a técnica usada para a clonagem deste tipo de fragmento é a chamada clonagem em cosmídeos.

Os cosmídeos, são plasmídeos que contêm um fragmento de DNA do fago l que inclui o sítio cos. Estes cosmídeos podem ser usados como veículos de clonagem molecular empregando o sistema de empacotamento in vitro que reconstitui a estrutura do fago (cabeça e cauda) e assim é usado para infectar a célula hospedeira.

As enzimas do sistema de empacotamento do fago l reconhecem os dois sítios cos situados de 35 a 49 kb de distância e neste caso, somente fragmentos desta ordem de tamanho serão convenientemente empacotados.

O DNA genômico de interesse é clivado com uma enzima de restrição que produz grandes fragmentos de DNA, os quais serão ligados ao cosmídeo, também clivado com a mesma enzima.

A situação ideal é que cada fragmento do DNA genômico apresente um sítio cos nas suas extremidades. Durante o empacotamento, as enzimas do sistema reconhecem os sítios cos situados a uma distância dentro de 49Kb, clivam estes sítios e empacotam estas moléculas.

O DNA do cosmídeo é injetado no interior da célula hospedeira, circulariza igual ao DNA do fago e replica como um plasmídeo normal, sem expressão de qualquer função do fago. As células infectadas serão selecionadas com base na resistência adquirida a um determinado antibiótico. A figura 12 ilustra um típico processo de clonagem em cosmídeo.

Figura 12. Esquema de clonagem em cosmídeo.

4. VÍRUS

A biologia molecular dos vírus de DNA e RNA foi extensivamente estudada antes do advento da metodologia do DNA recombinante. O vírus SV40, isolado de células tumorais de macacos, foi um dos primeiros sistemas virais utilizados para introduzir genes em células de mamíferos. O DNA do SV40 apresenta 5.200 pares de bases e pode ser dividido em duas regiões quanto a expressão gênica viral. Estas regiões são chamadas de região precoce e região tardia.

A região precoce é expressa através do ciclo lítico, enquanto que a expressão dos genes da região tardia ocorre somente após o início da replicação do DNA viral. Entre estas duas regiões situa-se a origem de replicação do DNA do vírus.

Um produto de expressão da região precoce é o antígeno T, o qual é responsável pela transformação maligna de células não permissíveis (células nas quais o vírus não completa a sua replicação), como também pelo início da replicação viral em células permissíveis. Os produtos de expressão codificados pela região tardia correspondem às proteínas que formam o capsídeo da partícula viral. A figura 13 ilustra o genoma do virus SV40.

Figura 13. O DNA do virus SV40

4.1. Clonagem no vírus SV40

A produção de DNA recombinante no vírus SV40, pode ser realizada através da substituição do segmento de expressão precoce ou do segmento de expressão tardia.

No primeiro caso, o vírus recombinante não produz o antígeno T, ao passo que na segunda opção não haverá produção das proteínas do capsídeo. Entretanto, estas funções deletadas podem ser suprimidas como veremos a seguir.

4.1.1. Clonagem no SV40 pela substituição da região tardia

Quando a região tardia do SV40 é substituída com outro DNA, perde-se a expressão das proteínas do capsídeo (funções tardias). Para que o sistema de clonagem funcione adequadamente pode-se realizar a infecção simultânea com um outro vírus SV40 que tem uma deleção nos genes da região precoce, mas a região tardia intacta. Nas células co-infectadas as proteínas da região precoce serão produzidas pelo vírus recombinante e as proteínas do capsídeo pelo vírus deletado. Como resultado, teremos a produção de uma população de partículas virais mistas, ou seja, vírus deletado e vírus recombinante. A figura 14 ilustra este procedimento.

Figura 14. Clonagem no SV40 pela substituição da região tardia

4.1.2. Clonagem no SV40 pela substituição da região precoce

Quando a clonagem no SV40 é feita na região precoce, a produção de partículas virais depende do suprimento, por uma outra fonte, das proteínas codificadas pela região precoce (antígeno T). Para evitar uma infecção mista com um vírus SV40 deletado, usa-se uma linhagem celular, as células COS as quais, apresentam uma porção do genoma do SV40 integrado ao seu próprio cromossomo. Esta linhagem celular produz a proteína viral denominada antígeno T, a qual liga-se na origem de replicação do vírus e induz a sua replicação. A figura 15 ilustra este tipo de clonagem.

Apesar deste sistema viral ter sido usado como vetor de expressão em muitas estratégias de clonagem, existem algumas desvantagens de seu uso. Uma delas é que o gene a ser clonado não pode ser grande, a outra é que as células hospedeira só podem ser células de macacos e finalmente, o genoma da célula hospedeira pode sofrer rearranjados ou deleções.

Atualmente, dois outros sistemas virais mais versáteis estão em uso, são eles o vírus da vacina e o Baculovírus, os quais podem aceitar genes bem maiores do que aqueles aceitos pelo SV40. Um inconveniente para estes dois sistemas virais é que ambos apresentam um grande genoma e o gene a ser clonado só pode ser inserido por processos de recombinação dentro das células, o qual é bastante lento em relação aos processos tradicionais em uso na metodologia do DNA recombinante.

Finalmente, um sistema viral bastante promissor são os retrovírus que são vírus cujo material genético é o RNA e apresentam um ciclo bastante diferente dos mencionados anteriormente que são ciclos líticos. Os retrovírus infectam uma grande variedade de células de mamíferos e o seu RNA é transcrito reversamente para DNA o qual é incorporado ao genoma da célula hospedeira. Neste estado ele produz continuamente novas partículas virais, juntamente com o produto do gene nele clonado. Devido a sua versatilidade, os retrovírus são atualmente os vetores eleitos para uso em terapia gênica.

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