tecnologia do DNA recombinante

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(Parte 3 de 6)

5. BACTERIÓFAGO M13

O bacteriófago M13 é um fago filamentoso da E. coli e contém uma única fita de DNA envolvida por proteínas virais. Durante o seu ciclo, a célula hospedeira é infectada pela fita (+) a qual servirá como molde para a síntese da outra fita (-). A dupla fita denominada de forma replicativa, permanece no interior da célula hospedeira e é amplificada até 200 cópias por célula, quando então a fita negativa não mais se replica e a fita positiva continua a ser sintetizada, adquire as proteínas da cápsula viral e sai da célula hospedeira através de processo não lítico (Figura 16).

Figura 15. Esquema de clonagem no SV40 pela substituição da região precoce.

Figura 16. Replicação do bacteriofago M13.

5.1. Clonagem no bacteriófago M13

A grande utilidade deste sistema de clonagem é a sua facilidade na produção de DNA fita simples, facilmente recuperável do sobrenadante de uma cultura líquida da E.coli infectada com este vetor. Como veremos futuramente, este DNA fita simples é bastante útil no processo de sequenciamento do DNA pelo método desenvolvido por Sanger e colaboradores (1977).

Para facilitar o seu uso especialmente em estratégias de seqüenciamento, foram desenvolvidos vetores da série M13mp, os quais contém o MSC inserido no gene que expressa a b-galactosidase.

Mutações foram realizadas de tal modo que a enzima só é ativa quando o vetor está na célula hospedeira, convenientemente preparada. Este processo denomina-se de alfacomplementação. A inclusão do múltiplo sítio de clonagem no gene da b galactosidade visa a identificação dos possíveis recombinantes quando na presença de um substrato cromogênico o X-gal ou Bluogal (5-bromo-4-cloro-indolil-b-D-galactosídeo) e o indutor IPTG. Quando o vetor está intacto (não recombinante), a enzima é funcional e frente ao substrato cromogênico este é clivado produzindo placas de cor azul. Por outro lado, quando um fragmento de DNA é inserido no múltiplo sitio de clonagem, a expressão da enzima é suprimida, portanto as células são incapazes de metabolizar o substrato cromogênico formando placas incolores.

5.2. Estratégia de clonagem em vetores da série M13mp

A utilização de vetores com diferentes orientações do múltiplo sítio de clonagem, tais como M13mp8 e o M13mp9, facilita a inserção de um fragmento de DNA em ambas as orientações. Como veremos adiante, esta estratégia apresenta grande aplicação no programa de sequenciamento de um DNA pelo método de Sanger.

A figura 17 ilustra a inserção de um fragmento de DNA clivado com as enzimas Pst1 (P) e EcoRI (E) nos vetores M13mp8 e M13mp9, ambos clivados com as mesmas enzimas. Esta clonagem orientada permite a inserção do fragmento de DNA na orientação 5'®3' no vetor M13mp8 e na orientação 3'®5' no vetor M13mp9.

Figura 17. Clonagem de um fragmento de DNA nos vetores M13mp8 e M13mp9 clivados

com as enzimas EcoRI (E) e PstI (P).

6. FAGoMÍDEOS

Apesar do bacteriófago M13 apresentar grande aplicabilidade especialmente nos processos de seqüenciamento de DNA, foram desenvolvidas outras gerações de fagos, os quais reunem as vantagens do fago M13 e a do plasmídeo. Os primeiros foram os vetores da série pEMBL e mais tarde os plasmídeos pTZ, pBluescript e pGEM (+/-). Estes vetores são chamados de fasmídeos ou fagomídeos e apresentam as seguintes características principais:

fagomídeo apresenta um versátil MSC, permitindo a clonagem de grandes insertos sem maiores dificuldades, além de que, as enzimas situadas neste sítio foram ordenadas de tal modo a permitir uma alternativa interessante durante o processo de sequenciamento.

utilizando uma combinação estratégica de duas enzimas de restrição, é possível criar terminações 5' e 3' proeminentes, tornando agora uma extremidade (a do inserto) susceptível à ação da Exonuclease III. Esta estratégia, permite a obtenção progressiva e controlada de vários fragmentos deletados do inserto, os quais após a recircularização tornam-se apropriados para o sequenciamento. Este procedimento, facilita o seqüenciamento de um grande inserto de DNA, sem a necessidade de múltiplas subclonagens como é usual no sistema M13 ou a síntese de vários oligonucleotídeos internos, usados como iniciadores no processo de seqüenciamento.

6.1. Clonagem no fagomídeo

Vamos utilizar como exemplo, o fagemídeo lZAP que é particularmente útil para clonagem de cDNA. Este vetor, incorpora a biologia do fago M13 de tal modo que um cDNA clonado neste vetor pode ser automaticamente excisado do fago para um fagomídeo denominado pBluescript.

Basicamente, qualquer DNA clonado no MSC inativa o gene LacZ, produzindo uma proteína de fusão quando na orientação correta, podendo assim também ser rastreada com anticorpos.

Quando uma cepa da E.coli (F') é infectada com o fago recombinante e superinfectada com o fago auxiliar, esse produz as proteínas do sistema M13. Essas proteínas reconhecem os sinais de iniciação e término da síntese de DNA do fago auxilar (f1) que estão flanqueando o pBluescript, que por sua vez está incorporado no fago ZAP e carrega o inserto. Com a clivagem destas duas seqüências, o DNA é automaticamente circularizado na bactéria para originar a forma recombinante do plasmídeo Bluescript SK(M13).

O inserto clonado no Bluescript é flanqueado por promotores para as RNA polimerases dos fagos T3 e T7. Neste sentido, após o vetor ser convenientemente linearizado, cópias do RNA relativo ao inserto, podem ser obtidas em ambas as direções através do uso das RNA polimerases T3 e T7.

7. VETORES PARA TRANSFORMAÇÃO DE LEVEDURAS

O grande interesse existente no estudo das leveduras Saccharomyces cerevisiae e Schizosacharomyces pombe deve-se ao fato de que tratam-se de organismos eucariotos inferiores e como tais possuem organização celular similar à de eucariotos superiores. Além disso, muitas proteínas de leveduras são similares estrutural e funcionalmente às suas homólogas em mamíferos. A utilização de leveduras como um modelo de estudo traz as seguintes vantagens:

tempo de crescimento reduzido que permite a obtenção de grandes quantidades de leveduras em pouco tempo.

genoma de pequeno tamanho, cerca de 200 vezes menor que o genoma de mamíferos, o que simplifica análises moleculares e genéticas.

possibilidade de manter as leveduras como células haplóides ou diplóides, o que permite a obtenção de mutações recessivas em células haplóides, bem como a realização de experimentos de complementação genética. As células de mamíferos são diplóides o que torna impossível a detecção de mutações recessivas.

Existem diferentes marcadores de seleção que são utilizados em leveduras. A maior parte dos genes marcadores utilizados em leveduras são genes envolvidos na biossíntese de aminoácidos e nucleotídeos. Um dos marcadores frequentemente utilizados é o gene de levedura LEU2 que codifica para uma das enzimas da via de síntese da leucina, a enzima -isopropilmalato dehidrogenase. A linhagem mutante de levedura, leu2, não cresce em meio de cultura que não contém leucina. Assim quando o gene LEU2 é utilizado na transformação da linhagem leu 2, as células desta linhagem que adquiriram o gene LEU2 serão capazes de crescer em meio de cultura deficiente no aminoácido leucina. Esta estratégia é semelhante a resistência à ampicilina adquirida por bactérias que foram transformadas com plasmídeos que contém o gene que promove a resistência à ampicilina.

A tabela a seguir lista alguns dos marcadores de seleção comumente utilizados em levedura.

GENE

ENZIMA

SELEÇÃO

HIS3

Imidazol glicerolfosfato desidratase

Histidina

LEU2

-Isopropilmalato desidrogenase

Leucina

LYS2

-Aminoadipato redutase

Lisina

TRP1

N-(5'-fosforibosil)- antranilato isomerase

Triptofano

URA3

Orotidina-5'fosfato decarboxilase

Uracil

Tabela 2. Genes marcadores de seleção em levedura. Os meios de cultura utilizados em geral contém todos os aminoácidos necessários à manutenção da levedura com exceção de um. Assim, por exemplo, células transformadas com o gene HIS 3 são selecionadas em meio de cultura deficiente em histidina.

Os vetores utilizados na transformação de leveduras são capazes de se propagar tanto em E. coli quanto em levedura. A manipulação destes vetores (clonagem, mutagênese, seqüenciamento, etc) é realizada em bactéria como para qualquer plasmídeo convencional e então o mesmo é transferido para levedura, organismo onde os ensaios de interesse são realizados. Tais vetores são denominados vetores do tipo ponte (“shuttle vectors”) e contêm entre outros elementos origens de replicação de bactéria e levedura bem como genes marcadores que funcionam para a seleção nos dois organismos.

Diferentes tipos de vetores são utilizados na transformação de leveduras:

Vetores de integração: tais vetores contêm origem de replicação de bactérias e genes marcadores para seleção em bactéria e levedura. Neste caso o plasmídeo não é capaz de replicar de modo autônomo na levedura. O modo pelo qual este tipo de vetor é propagado e é capaz de expressar o marcador de seleção é através da integração em um dos cromossomos de levedura.

Vetores que replicam em levedura: tais vetores também contém origem de replicação de bactéria e genes marcadores para seleção em bactéria e levedura. Dois tipos de origens de replicação de levedura são empregadas nestes plasmídeos. O primeiro tipo consiste na origem de replicação do plasmídeo de 2 m, que é de ocorrência natural em levedura. O segundo consiste de origens de replicação isoladas de DNA cromossomal denominadas ARS (Autonomously Replicating Sequence, sequências de replicação autônoma). Plasmídeos contendo a origem de replicação do plasmídeo de 2m ou sequências tipo ARS replicam em múltiplas cópias em levedura (Figura 18). Uma variante deste tipo de vetor inclui, além da sequência ARS, uma sequência tipo centromérica, denominada CEN, que garante que a replicação destes plasmídeos seja estável, ocorrendo uma única vez por ciclo celular e que eles sejam segregados de modo preciso durante a mitose e meiose. Vetores contendo sequências tipo CEN são mantidos em cópia única na levedura (Figura 18).

YACs: (Yeast Artificial Chromosome, cromossomo artificial de levedura) são uma variação de um vetor de cópia única, que contêm sequências centroméricas (CEN) e sequências teloméricas, que são sequências das extremidades dos cromossomos. A presença de sequências teloméricas nestes vetores permite que sejam replicados como moléculas lineares, com comportamento semelhante ao do DNA cromossomal. YACs não são utilizados de rotina em experimentos de clonagem, entretanto, têm se mostrado uma ferramenta valiosa na caracterização de grandes segmentos genômicos na medida em que é possível clonar em um YAC fragmentos que vão de 100 a 2000 kb (Figura 19).

Figura 18. Vetores de levedura. Contêm sequências de plasmídeo (aqui de pUC118) que permitem a propagação e dão resistência a ampicilina em E.coli, o gene de seleção em levedura (neste caso LEU 2) e sítios únicos de restrição. Vetores multicópias: Estes plasmídeos existem na forma circular na levedura. Alguns destes vetores empregam a origem de replicação do plasmídeo de 2 m, outros utilizam origens de replicação isoladas de cromossomos que são denominadas ARS. 2m e ARS permitem a replicação do plasmídio em múltiplas cópias. Vetores cópia única: Vetores que contém origens de replicação tipo ARS podem ser mantidos estavelmente através da adição de sequências centroméricas, CEN. A existência de sequências tipo CEN assegura que o plasmídeo seja mantido em 1 ou 2 cópias na levedura e segregado de modo preciso durante a divisão celular.

GLOSSÁRIO

ARS: (autonomous replication sequence, sequência de replicação autônoma). Sequência que funciona como uma origem de replicação em cromossomos de levedura.

BAC: (bacterial artificial chromosome, cromossomo artificial de bactéria). Vetor utilizado na clonagem de DNA genômico, baseado no fator F de plasmídeo que assegura que o plasmídeo seja mantido em pequeno número de cópias na bactéria.

Centrômero: região do cromossomo que apresenta uma constricção e à qual liga-se o fuso mitótico durante a meiose ou mitose. É necessária para a manutênção da estabilidade e segregação correta dos cromossomos durante a divisão celular.

Origem de replicação: região onde é iniciada a síntese de DNA em um dado fragmento de DNA.

Telômero: extremidade do cromossomo que contém sequências repetitivas de DNA sintetizadas pela enzima telomerase e importantes na manutenção da integridade cromossomal.

YAC: (yeast artificial chromosome, cromossomo artificial de levedura). Sistema de clonagem em levedura que consiste de um vetor linear que tem capacidade de replicação autônoma e que contém um centromêro de levedura e duas sequências teloméricas em suas extremidades.

Figura 19. YACs: Contêm um centrômero, dois telômeros, gene(s) marcadores para seleção em levedura e uma seqüência tipo ARS. Devido à presença destas seqüências os YACs são replicados como pequenos cromossomos lineares na levedura.

III. CONSTRUÇÃO E USO DE BIBLIOTECAS DE DNA RECOMBINANTE

A obtenção de uma molécula de DNA recombinante, através da ligação de um fragmento de DNA de interesse com o DNA de um vetor, é um processo direto e relativamente simples. Entretanto, problemas especiais surgem quando o fragmento de interesse constitui uma fração pequena do DNA total. Este é o caso encontrado comumente quando o objetivo é o isolamento de genes presentes em uma única cópia num genoma complexo, ou quando o objetivo é o isolamento de clones portadores do DNA complementar à RNA mensageiro raro. Deste modo, é claro que quando queremos clonar um determinado gene ou o DNA complementar da mensagem ou mensagens por ele codificado(s) é necessário à obtenção de coleções de clones recombinantes, portadores de moléculas representantes de todo o genoma, ou de coleções de clones de cDNAs derivados de toda a população de mensageiros da célula ou tecido de interesse. Essas coleções de clones de DNA recombinante são chamadas de bibliotecas: Biblioteca Genômica, no caso dos clones terem sido obtidos a partir do DNA genômico ou Biblioteca de cDNA, no caso dos clones terem sido construídos a partir de DNA complementar.

O DNA de organismos superiores é bastante complexo: por exemplo, o genoma haplóide de mamífero é composto de aproximadamente 3x109 pares de bases (pb). Portanto, se o fragmento de interesse tiver 3000 pb, ele compreenderá somente 1 parte em 106 de uma preparação do DNA total. De modo similar, uma espécie de RNAm particularmente rara pode compreender somente 1 parte em 105 ou 106 da fração de RNA mensageiros de uma célula. Deste modo, para que seja garantida a presença na biblioteca de pelo menos uma versão de todas as seqüências da população alvo, um dos pontos principais na construção de bibliotecas úteis é a obtenção de grandes quantidades de clones. Embora a solução deste problema envolva estratégias específicas no preparo do DNA alvo e na escolha do vetor de clonagem, em linhas gerais a construção de bibliotecas genômicas e de cDNAs segue um procedimento básico bastante semelhante. Nos dois casos, o DNA genômico ou os cDNAs são preparados para a inserção no vetor escolhido. O vetor e o DNA alvo são ligados e introduzidos em E. coli através de infecção ou em alguns casos, por transformação direta (Figura 20).

1. Biblioteca de cDNA

A descoberta da enzima transcriptase reversa, uma DNA polimerase dependente de RNA encontrada predominantemente em vírus de RNA de tumor, tornou possível a síntese in vitro de DNA usando-se como molde RNAm. O DNA produto dessa reação é o DNA complementar ou cópia da mensagem, abreviadamente chamado de cDNA. A síntese e possível clonagem de cDNAs contribuíram para grandes avanços na análise da estrutura e expressão de genes de eucariotos e propiciaram uma revolução tecnológica nas indústrias farmacêutica e de alimentos. Esses clones são comumente isolados de bibliotecas de cDNA, construídas a partir da população de RNAm isolada da célula ou do tecido de interesse. Portanto, em comparação com bibliotecas do genoma total essas bibliotecas são enriquecidas com seqüências gênicas. Uma vez que o cDNA é cópia da mensagem, ele não contém introns e apresenta significativamente poucas seqüências que não codificam para proteínas (Figura 21). A ausência de introns permite que cDNAs relativos a células de eucariotos superiores sejam diretamente transcritos e traduzidos em bactérias e em outros microorganismos, permitindo assim a produção em grande escala de polipeptídios importantes tanto na área de pesquisa como na área aplicada. A ausência de introns também facilita a determinação direta da seqüência da mensagem e subseqüente dedução da seqüência de aminoácidos da proteína por ela codificada. Isso tem resultado na identificação da seqüência de uma enorme quantidade de proteínas, algumas vezes mesmo antes de terem sido identificadas genética ou bioquimicamente.

Figura 20. Passos envolvidos na construção de Bibliotecas de cDNA e Bibliotecas genômicas.

Figura 21. Diagrama representando de forma simplificada as diferenças entre um fragmento de DNA genômico e do cDNA relativo a ele.

De modo resumido, o procedimento para a síntese, clonagem e isolamento de cDNAs específicos envolve 4 etapas:

1) Síntese in vitro de cDNAs de fita dupla a partir de RNAs mensageiros isolados do tecido de interesse.

2) Preparo dos cDNAs para a ligação com o vetor escolhido.

3) Introdução dos cDNA recombinantes nas células hospedeiras, onde serão replicados. Isto resultará na amplificação dos recombinantes e dependendo do vetor utilizado, na expressão das proteínas codificadas pelas mensagens que deram origem aos cDNAs.

4) Identificação dos clones de interesse através de um processo de triagem dos clones recombinantes.

1.1. Síntesede cDNAs de fita dupla

A construção de uma biblioteca de cDNA inicia-se com o isolamento do RNA total do tecido e subseqüente seleção da fração de RNA poli(A)+, que compreende a maioria das mensagens presentes na célula. O isolamento de RNA poli(A)+ de boa qualidade é essencial, uma vez que qualquer degradação do RNAm afetará a representatividade das seqüências na biblioteca.

Uma vez obtida a fração de RNA poli(A)+, procede-se à síntese dos cDNAs através de uma série de reações enzimáticas (Figura 22). Nos últimos dez anos foram descritos vários métodos para síntese de cDNA, cada um apresentando vantagens e desvantagens particulares. Como exemplo, apresentamos a seguir um procedimento amplamente usado para esse fim:

a) Síntese da fita de DNA complementar ao RNAm (cDNA) através da enzima transcriptase reversa. Essa enzima é capaz de catalisar in vitro a polimerização de DNA a partir RNA e requer um "primer" com a extremidade 3'OH livre para iniciar a síntese. Na maioria das vezes, a molécula utilizada como "primer" é um oligo (dT), que se anela na cauda poli (A)+ do RNA.

b) Após a síntese dessa fita de cDNA, o RNAm é parcialmente removido, pelo uso da RNase A para cortar pedaços do RNA da molécula híbrida RNA-DNA.

c) Utilizando como "primer" os fragmentos de RNA não digeridos pela RNaseA, a DNA polimerase de E. coli substitui eficientemente o RNA por DNA, resultando em uma molécula de cDNA de fita dupla.

d) O cDNA fita dupla é tratado com T4 polimerase. Através da atividade 3'-5' exonucleásica dessa enzima remove-se possíveis nucleotídeos extras nas extremidades 3'.

e) O produto final desse conjunto de reações é uma molécula de DNA de fita dupla, cópia exata da mensagem.

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