tecnologia do DNA recombinante

tecnologia do DNA recombinante

(Parte 4 de 6)

1.2. Preparo dos cDNAs para a ligação com o vetor

Uma vez obtido o cDNA, o próximo passo é prepará-lo para a inserção em um vetor de clonagem (Figura. 22). Para isso também existem vários métodos disponíveis, que diferem entre si dependendo do tipo de vetor escolhido: plasmídio ou fago. O fago tem sido o vetor de escolha para a construção de bibliotecas de cDNA. A razão básica desta preferência é a eficiência. Em comparação com plasmídios, o fago requer cerca de 16 vezes menos cDNA por g do vetor para produzir número equivalente de clones recombinantes. Além disso, bibliotecas em fago são mais fáceis de serem manipuladas do que bibliotecas em plasmídios. Entretanto, uma desvantagem dos vetores é que não são favoráveis para procedimentos de seqüenciamento do DNA e de mutagênese dirigida. Mais recentemente, outro tipo de vetor foi idealizado para suprir essas deficiências. Essa classe de vetores compreende os fagemídios que, como o próprio nome sugere, são plasmídios contendo porções do genoma de fago e que reúnem vantagens desses dois vetores.

Figura 22. Síntese de cDNA fita dupla.

Para dar uma noção dos passos implicados na clonagem do cDNA relatamos a seguir um procedimento adotado para a clonagem de cDNA em fago .

metilação dos sítios de EcoRI através do tratamento do cDNA com EcoRI, na presença de S-adenosil metionina. Esse passo é essencial para proteger os sítios EcoRI que possam existir no cDNA contra a ação da EcoRI em digestão a ser realizada subseqüentemente no processo de clonagem.

adição de adaptadores, com o sítio EcoRI, nas duas extremidades do cDNA. Essa reação resulta em moléculas de cDNA com adaptadores múltiplos ligados nas duas pontas (ver figura 23).

um único sítio de EcoRI é produzido em cada ponta do cDNA pela digestão com EcoRI, liberando o excesso de adaptadores ligados na molécula. A metilação prévia do cDNA garante que não haja digestão interna do cDNA.

antes de ser inserido no vetor, o cDNA é separado do excesso de moléculas de adaptadores. Isso é feito através de filtração em colunas de Sephadex.

as moléculas de cDNA são ligadas ao vetor, através de reação com T4 ligase.

o produto da ligação é empacotado com as proteínas formadora do capsídeo do fago.

os fagos obtidos são utilizados para infectar bactéria de linhagem que favorece o crescimento dos recombinantes.

após a infecção da bactéria com os cDNA recombinantes temos como produto uma biblioteca de cDNA, que deve conter cópias de toda as seqüências de RNAm da população original. Essa biblioteca pode ser estocada na geladeira, ou submetida a uma triagem em busca do clone de interesse.

2. Biblioteca genômica

Para se obter informações sobre a estrutura molecular de um gene de eucariotos é necessário o isolamento da porção do DNA genômico que contenha toda a unidade de transcrição, mais as regiões flanqueadoras onde se localizam os elementos controladores da expressão desse gene. O modo mais eficiente para se conseguir isolar essa porção do DNA é através do uso de uma biblioteca genômica, que deve conter clones portando fragmentos de DNA representantes de todo o genoma do organismo em questão. Deste modo, o aspecto principal considerado na construção de uma biblioteca genômica está na obtenção de um número grande de clones portando fragmentos do genoma, obtidos aleatoriamente. O tamanho necessário de uma biblioteca genômica, para que um dado fragmento de interesse esteja entre os fragmentos clonados, é determinado pelo tamanho do fragmento clonado e pelo tamanho do genoma. Deste modo, a estratégia básica na construção de bibliotecas genômicas busca minimizar o número de clones necessários através da clonagem de fragmentos de DNA de maior tamanho possível, e maximizar a eficiência da clonagem, através da utilização de vetores baseados no fago . Basicamente, a construção da biblioteca genômica envolve os seguintes passos:

isolamento de DNA de alto peso molecular, que é posteriormente quebrado de modo a produzir fragmentos de tamanho compatível com o vetor de clonagem.

ligação desses fragmentos no vetor e introdução dos recombinantes obtidos nas células hospedeiras.

Figura 23. Clonagem de cDNA em fago 

Dentre esses passos, o modo de preparo dos fragmentos a serem clonados (insertos) merece ser discutido criticamente dada sua importância na representatividade da biblioteca.

2.1. Preparo do DNA do inserto

Arepresentatividade de uma biblioteca genômica depende grandemente da aleatoriedade com que os fragmentos a serem clonados são gerados, para que não haja exclusão sistemática de nenhuma seqüência. O fracionamento mecânico do DNA é o meio de se obter completa aleatoriedade na fragmentação do DNA. Entretanto, esse método não é comumente adotado devido à trabalhosa manipulação necessária para que os fragmentos assim obtidos possam ser inseridos no vetor. Com bom senso e cuidado é possível conseguir fragmentação suficientemente aleatória através de digestões parciais do DNA com enzimas de restrição. Uma vantagem em se utilizar a digestão parcial do DNA é a produção de fragmentos com pontas coesivas e que, portanto, podem ser diretamente ligados ao vetor. Para garantir que a digestão atinja todo o genoma são utilizadas enzimas de restrição que cortam freqüentemente o DNA e que não apresentam desvios de distribuição de sítios. A enzima Sau3A I, que reconhece o sítio de 4 bases GATC, e que gera fragmentos compatíveis com sítios de clonagem de vários fagos e cosmídios, tem provado ser bastante útil na produção de bibliotecas de DNA genômico digerido parcialmente. Após a digestão parcial, os fragmentos gerados precisam ser fracionados antes de serem ligados ao vetor. Sem esse fracionamento, fragmentos pequenos poderão ligar-se entre si produzindo falsos recombinantes. Fragmentos muito grandes que não permitem o crescimento do fago poderão ligar-se aos braços do fago, alterando a relação entre as quantidades de DNA de inserto e vetor.

Um método de fracionamento freqüentemente adotado é o de centrifugação em gradiente de sacarose. Após a digestão parcial, a solução de DNA é aquecida para que possíveis fragmentos agregados se dissociem, e então, é aplicada sobre um gradiente de sacarose de alta salinidade. Após a centrifugação, são coletadas frações desse gradiente. Essas frações são analisadas por eletroforese em um gel de agarose. As frações contendo os fragmentos de DNA de tamanho apropriado são utilizadas para a ligação com o vetor. A figura abaixo ilustra esse procedimento.

Figura 24. Método para fracionamento do DNA por centrifugação em gradiente de sacarose. O gradiente é aspirado, de baixo para cima, com ajuda de uma bomba peristáltica. A porção mais densa do gradiente contendo o DNA de maior peso molecular, é aspirada primeiro.

Uma vez garantida a aleatoriedade dos fragmentos clonados, é bastante razoável se pensar que a probabilidade de uma dada seqüência de interesse estar presente em uma biblioteca genômica possa ser estimada estatisticamente, com base na distribuição de Poisson. Especificamente, o número de clone independentes (N) que precisam ser triados para uma probabilidade (P) de se isolar uma seqüência específica é dada por:

N = ln(1-P)/ ln[1-(I/G)]

onde I é o tamanho médio dos fragmentos clonados, em pares de base, e G é o tamanho do genoma, em pares de base.

Deste modo, precisamos triar cerca de 690.000 clones de uma biblioteca que usa como vetor um fago , para termos 99% de chance de isolar qualquer dada seqüência presente em uma única cópia em um genoma típico de mamífero.

N = ln(1-0,99)/ln[1- (2x104/3x109)]= 690.000

2.2. Vetores utilizados na construção biblioteca genômica

Fagos e cosmídeos são comumente usados na construção de bibliotecas genômicas. Nos dois casos, fragmentos grandes de DNA gerados por fragmentação aleatória são ligados com o DNA do vetor para formar concatâmeros que podem então ser empacotados em partículas de fago . As bibliotecas construídas em vetores são armazenadas e propagadas na forma de fagos recombinantes. No caso de clonagem em cosmídios, entretanto, essas partículas virais servem meramente como veículos para introduzir o DNA recombinante dentro da bactéria. Uma vez dentro da bactéria o cosmídio se comporta como um plasmídio grande.

Os cosmídios podem aceitar insertos de aproximadamente 45kb, quase duas vezes o tamanho dos insertos clonáveis em fago . Deste modo, usando-se o cosmídio como vetor, é necessário gerar somente 350.000 recombinantes para atingir 99% de probabilidade de uma seqüência de cópia única estar representada em uma biblioteca genômica de mamífero. Entretanto, bibliotecas em cosmídios são mais difíceis de se construir e manter do que as bibliotecas de fagos. Cosmídios são então usados quando o gene de interesse é muito grande ou quando uma região extensa do DNA cromossomal é desejada. No caso de isolamento rotineiro de segmentos de genes ou em circunstâncias onde a biblioteca será usada muitas vezes, o uso de vetores é mais recomendado.

Na figura abaixo apresentamos um diagrama da estrutura de um vetor tipo , bastante utilizado na construção de bibliotecas genômicas.

Figura 25. Estrutura do vetor EMBL3. BE=braço esquerdo; BD=braço direito; stuffer= fragmento central; S=SalI; B=BamHI; E=EcoRI.

Conforme indicado no diagrama este vetor apresenta um fragmento central flanqueado por dois fragmentos essenciais (direito e esquerdo). O fragmento à esquerda, chamado de braço esquerdo, codifica para as proteínas do capsídeo e o fragmento à direita, chamado de braço direito, contém a origem de replicação do fago e promotores de outros genes essenciais. Entre o fragmento central e os dois braços encontram-se os sítios de restrição utilizados na clonagem - SalI, BamHI, EcoRI - em orientação inversa.

Como todo fago , a extremidade de cada braço apresenta um segmento de fita simples (cos). Esses segmentos são complementares entre si e permitem a recircularização da molécula, e a conseqüente replicação do DNA do fago dentro da célula hospedeira.

Esse tipo de vetor é chamado de vetor de substituição por que no processo de clonagem a parte central do DNA do fago é substituída pelo fragmento de DNA a ser clonado, originando a molécula recombinante.

Mais recentemente outros vetores com capacidade para grandes insertos foram desenvolvidos. Os cromossomos artificiais de levedura (YACs) são moléculas lineares de DNA cuja arquitetura mimetiza a estrutura de um cromossomo autêntico (Figura 26). Os YACs recombinantes são criados pela ligação de fragmentos grandes de DNA genômico exógeno (até 2000 kb) com os dois "braços" do vetor YAC e o produto da ligação é introduzido na levedura por transformação. Nos YACs recombinantes, o segmento de DNA genômico exógeno é flanqueado de um lado por um centrômero, uma origem de replicação e uma marca de seleção e pelo outro lado, por uma segunda marca de seleção. As leveduras transformantes com cromossomo artificial são selecionadas como colônias em meio com as drogas de seleção.

Os cromossomos artificiais de bactérias (BAC) são moléculas de DNA circulares que carregam uma marca de seleção a antibiótico. Os segmentos de DNA genômico exógeno são clonados no vetor BAC in vitro e o produto da reação de ligação é introduzido por eletroporação em cepas de E. coli, onde é mantido como um plasmídio de cópia única. Os vetores BACs carregam marcadores que permitem a discriminação dos clones vazios e cheios. A média de tamanho dos clones de BACs é 120 kb, mas alguns clones podem chegar 300kb.

Os vetores de bacteriófago P1 acomodam fragmentos genômicos de 70 a 100Kb. Neste sistema, as moléculas lineares recombinantes geradas a partir de seqüências do vetor e do genoma são empacotadas in vitro em bacteriófago P1. Após a injeção em E. coli, as moléculas se tornam circulares pela atividade de uma recombinase, que promove a recombinação de seqüências específicas presentes no vetor. Estes vetores carregam marca de seleção para antibiótico, marca de seleção positiva para seleção dos clones com inserto de DNA genômico exógeno e uma origem de replicação plasmídial P1, que mantém uma ou duas cópias dos plasmídios recombinantes na célula. Uma segunda origem de replicação pode ser ativada para amplificação dos plasmídios antes do isolamento do DNA.

Figura 26. Construindo um cromossomo artificial de levedura (YAC). O vetor YAC carrega uma origem de replicação (ORI), um centrômero (CEN), dois telômeros e marcas de seleção (X e Y). Lehninger, Principles of Biochemistry. Figura 29-16, p. 1139.

Os cromossomos artificiais P1 combinam as características dos bacteriófagos P1 e dos BACs, incluindo a marca de seleção positiva e as origens de replicação do bacteriófago P1. Os clones circulares recombinantes de PACs gerados durante a reação de ligação in vitro são introduzidos em E.coli por eletroporação e mantidos como um plasmídio de cópia única na célula. Os insertos da biblioteca de DNA do genoma humano em PACs variam de 60kb a 150kb.

IV. Detecção e ANÁLISE DO CLONE RECOMBINANTE

Um passo crucial na Tecnologia do DNA recombinante é encontrar o clone correto na mistura de clones que foi criada durante os procedimentos da confecção da biblioteca genômica ou de cDNA. Embora seja relativamente fácil selecionar as colônias que abrigam os vetores de clonagem usando os marcadores de resistência a antibióticos que estão presentes nos vetores (Figura 27A), é muito mais difícil selecionar o clone que contenha o gene de interesse. Note que no caso do vetor ser um plasmídio deverão ser examinadas milhares de colônias de bactérias crescidas em placas de petri contendo agar, para a detecção daquela(s) colônia(s) que produza(m) pequenas quantidades da proteína expressa pelo gene de interesse ou então que possua(m) o gene de interesse sem qualquer expressão protéica que o caracterize (Figura 27B). Será discutida inicialmente a situação na qual a proteína é expressa no hospedeiro. Em seguida será discutida a situação mais comum onde a proteína não é expressa e a análise será feita através da própria presença do DNA de interesse no fago ou na bactéria.

1. Quando o gene de interesse é expresso no hospedeiro

Se o gene de interesse é capaz de se expressar na célula hospedeira pode-se identificar o clone que carrega este gene pela presença desta proteína entre as colônias recombinantes. Para isto, o hospedeiro não deve produzir esta proteína, a menos que ele carregue o clone que a produza. Se esta proteína for produzida normalmente pela célula hospedeira, será então necessário o uso de uma célula hospedeira defectiva ou mutante para o gene de interesse. Quando este gene for incorporado ele pode ser detectado por complementação daquela função. Se a proteína a ser detectada for específica de mamífero, por exemplo, a célula hospedeira já será naturalmente defectiva. Se a proteína for uma enzima que catalisa uma reação mensurável pode ser possível triar as colônias por sua atividade enzimática.

Se a proteína de interesse não for uma enzima com função detectável, uma outra estratégia será necessária para a identificação do clone correto, como por exemplo, o uso de um anticorpo específico para a proteína de interesse. Anticorpo é uma proteína do soro produzida pelos mamíferos que se combina com alta especificidade com outra proteína, o antígeno. Neste caso, a proteína de interesse é o antígeno. Como o anticorpo se combina especificamente com o antígeno, se o antígeno estiver presente em uma ou mais colônias de uma placa de petri, a identificação destas colônias poderá ser feita observando-se a reação antígeno-anticorpo.

Figura 27. Em A,estrutura do plasmídio pBR322, um típico vetor de clonagem. Em B, método da inativação insercional para isolar plasmídios contendo DNA exógeno. A inserção do DNA exógeno no plasmídio pBR322 causa inativação da resistência à tetraciclina, permitindo o isolamento de transformantes contendo o fragmento de DNA clonado (B). Lehninger, Principles of Biochemistry. Figura 29-6, p. 1126.

Para que o antígeno seja produzido na célula hospedeira a biblioteca de cDNA terá de ser construída num vetor de expressão. Neste caso os cDNAs são inseridos nestes vetores em regiões que promovam sua expressão em E.coli, normalmente em promotores que possam ser regulados. Esta proteína antigênica será expressa como uma proteína de fusão, ou seja, será sintetizada subseqüente a alguns aminoácidos pertencentes à proteína do vetor bacteriano. Estas proteínas de fusão são geralmente mais estáveis que a correspondente proteína de eucarioto produzida em bactéria e, portanto podem ser obtidas em grande quantidade. Para visualizar a produção destas proteínas, uma parte dos fagos de cada placa de lise (ou bactérias) recombinantes desenvolvidos numa placa de Petri são transferidos (como um carimbo) para uma membrana de nitrocelulose, tratados para expor suas proteínas e então submetidos a uma solução contendo um anticorpo específico para a proteína desejada. Depois que os anticorpos livres são removidos, um segundo anticorpo é adicionado para localizar a posição do primeiro. O segundo anticorpo é normalmente radioativo e pode ser identificado por autoradiografia utilizando-se um filme de raio X. Se uma colônia radioativa estiver presente, uma mancha no filme de raios-X será observada depois que o filme for revelado (Figura 28). A localização desta mancha no filme corresponde à localização da colônia que produziu aquela proteína, na placa de petri original. Esta colônia será então recuperada da placa original e cultivada.

Uma limitação deste procedimento é que o anticorpo utilizado nesta triagem precisa ser específico para a proteína de interesse. A produção de anticorpos pode ser obtida pela injeção da proteína (antígeno) em um animal. No entanto, esta proteína injetada deve ser pura, caso contrário mais que um anticorpo será formado.

2 O uso de sondas moleculares de ácidos nucléicos para identificar o gene de interesse

Como pode ser detectado um gene de interesse entre as colônias da biblioteca genômica ou de cDNA, se este gene não é expresso?

Quando o DNA em solução aquosa é aquecido à 100C, ou exposto à pH alto, as bases complementares que normalmente seguram as duplas hélices juntas são dissociadas em duas fitas simples. Este processo é chamado de desnaturação. Estas mesmas fitas simples poderão se reassociar se forem conservadas à 65C, por longos períodos, num processo chamado de renaturação (ouhibridação,quando a associação ocorre entre ácidos nucléicos de diferentes origens). Reações de hibridação ocorrem entre quaisquer duas cadeias de ácidos nucléicos de fita simples (DNA:DNA, RNA:DNA ou RNA:RNA) desde que tenham seqüências de nucleotídeos complementares.

Figura 28. Triagem de bibliotecas de expressão com anticorpos. Se o inserto estiver na orientação correta e na apropriada seqüência aberta de leitura é traduzido em proteína de fusão (antígeno). Os anticorpos identificam as placas de lise específicas destes antígenos.

Este princípio da hibridação molecular é fundamental para caracterizar DNAs recombinantes quando o gene de interesse não é expresso. Sondas de ácidos nucléicos (fragmentos de ácido nucléico marcados radioativamente, geralmente com 32P) são utilizadas para localizar clones, numa biblioteca genômica ou de cDNA, que carreguem uma seqüência de DNA de interesse. Após a confecção da biblioteca genômica (ou de cDNA) os fagos carregando DNA recombinante são espalhados juntamente com uma suspensão de bactérias numa placa de petri contendo meio de cultura sólido. Uma vez visualizada as placas de lise (ou as colônias, no caso do vetor ser um plasmídio) é preparada uma réplica de cada placa de petri com uma membrana de náilon ou de nitrocelulose. Este processo permite a transferência de uma porção de fagos de cada placa de lise (ou de bactérias de cada colônia) para a membrana, de tal maneira que o padrão das placas de lise da placa de petri original seja mantido na membrana. Para identificar qual das placas de lise porta o gene de interesse esta membrana é tratada para expor e desnaturar o DNA das colônias ali presentes e incubados com uma solução de DNA ou RNA fita simples, marcada radioativamente e complementar ao gene de interesse para permitir a hibridação. Dois polinucleotídios simples fitas somente irão se hibridar se forem complementares. A localização da placa de lise que se hibridou à sonda é determinada após a exposição da membrana a um filme de Raios-X (autoradiografia) e a comparação deste filme com a disposição das colônias na placa de petri original (Figura 29).

Esta sonda molecular radioativa pode ser parte de um gene já clonado para o qual se procura o gene total, pode ser o DNA de um gene vizinho ao gene de interesse, pode ser o RNA de genes que são expressos em tecidos específicos ou em estágios específicos do ciclo celular, ou mesmo o gene de uma outra espécie que codifica para a mesma proteína. Neste último caso, a reação de hibridação pode ser realizada em baixa temperatura (420C ao invés de 650C) e em baixa concentração de sal (baixa estringência) para permitir a hibridação mesmo entre DNAs que tenham algumas bases não complementares.

Figura 29. Triagem de uma biblioteca genômica ou de cDNA, construídas no fago , com uma sonda molecular para encontrar um clone de interesse. Esta triagem é feita espalhando-se os fagos previamente incubados numa cultura de bactérias, em várias placas de agar. Depois que as placas de lise tornam-se visíveis, são feitas as réplicas em membrana de nitrocelulose, seu DNA é exposto e hibridizado com a sonda molecular. A posição do clone recombinante de interesse é identificada através de autoradiografia. O DNA é isolado dos fagos presentes na placa de lise positiva, identificada na placa de petri original e submetida a análises posteriores.

Genes que respondem a um mesmo mecanismo de regulação podem ser identificados numa biblioteca de cDNA por hibridação diferencial. Isto é, genes expressos em tecidos específicos, em estágios específicos do desenvolvimento ou do ciclo celular e genes regulados por fatores de crescimento são adequados para serem analisados por este tipo de abordagem. Para esta identificação é necessário produzir duas populações celulares (ou extrair mRNA de dois diferentes tecidos) uma na qual eles não se expressam e outra na qual eles se expressam. Suponha por exemplo, que uma biblioteca de cDNA seja preparada usando o mRNA isolado de células tratadas com fatores de crescimento. Esta biblioteca é plaqueada e transferida para dois conjuntos de membranas de nitrocelulose. Um conjunto é ensaiado com DNA marcado radioativamente preparado por transcrição reversa do RNA das células tratadas com os fatores de crescimento. O outro conjunto de filtros é hibridado com cDNA preparado de células não tratadas. Clones positivos identificados por hibridizar mais fortemente com a primeira sonda codificam mRNAs induzíveis pelos fatores de crescimento (Figura 30).

Quando o DNA a ser clonado expressa uma proteína cuja seqüência é conhecida pode-se inferir a seqüência de um trecho de DNA que lhe deu origem e sintetizar oligonucleotídeos que lhe sejam complementares para serem utilizados como sondas moleculares. Estes nucleotídeos devem ter pelo menos 17 a 20 nucleotídeos de comprimento para ser específico para a seqüência procurada. Um problema enfrentado para sintetizar estes oligonucleotídeos é a degenerecência do código genético. Alguns aminoácidos são codificados por quatro ou mesmo seis diferentes códons e, portanto mesmo um pequeno polipeptídio pode ter sido codificado por várias seqüências de DNA. Para contornar este problema as sondas oligonucleotídicas são algumas vezes sintetizadas como uma mistura de todas as possíveis combinações dos códons que são traduzidas naquela seqüência protéica (Figura 31). Uma destas seqüências é correta e irá hibridar com o clone de interesse, mas a possível hibridação dos outros oligonucleotídeos com seqüências sem interesse pode levar a obtenção de clones falsos positivos.

Uma variação deste método é utilizar o menor número possível de oligonucleotídeos como sonda, escolhendo a região da proteína que contém o menor número possível de códons degenerados (por exemplo, metionina é somente codificada pelo códon AUG). Deve-se levar em conta também qual é o códon de uso mais freqüente para cada aminoácido, na espécie que está sendo analisada.

Figura 30. Clonagem de genes regulados por fatores de crescimento através de hibridação diferencial. Esta estratégia é utilizada para clonar uma família de genes que são induzidas quando células quiescentes são estimuladas a crescer pela adição dos fatores de crescimento.

Figura 31. Desenho de sondas oligonucleotídicas baseadas na seqüência protéica. Como a maioria dos aminoácidos é especificada por dois ou mais códons estes oligonucleotídeos são sintetizados usando-se uma mistura dos nucleotídeos das posições ambíguas. A seqüência correta estará representada entre os oligos. Uma outra possibilidade é usar uma sonda tentativa cuja escolha é baseada na freqüência de uso do códon na espécie em estudo. Neste caso pareamentos incompletos podem ocorrer.

3 Análise do DNA e RNA por eletroforese em gel e “blotting”

Várias técnicas foram desenvolvidas baseadas nas propriedades de hibridação dos ácidos nucléicos visando a triagem e isolamento de seqüências específicas destas moléculas. A maioria destas técnicas, conforme já mencionado, trabalha com uma réplica do DNA de interesse imobilizado num suporte sólido tal como uma membrana de náilon ou de nitrocelulose. Um destes métodos, desenvolvido na década de 70 por E. M. Southern, tornou-se conhecido por "Southern blotting". Nesta técnica o DNA é digerido com uma ou mais enzimas de restrição e os fragmentos resultantes separados por eletroforese num gel de agarose. Os fragmentos de DNA dupla fita são visualizados por coloração com brometo de etídio, desnaturados 'in situ' com hidróxido de sódio e transferidos para uma membrana por capilaridade, com o auxílio de uma solução de alta concentração salina. Tais condições permitem que o DNA seja retido na membrana no ponto de contacto entre o gel e a membrana, criando uma réplica do gel. O DNA é covalentemente ligado à membrana usando-se calor ou luz ultravioleta. Sondas de ácidos nucléicos (DNA ou RNA marcados radioativamente) podem ser utilizadas para hibridar com o DNA fixado na membrana e a posição na qual a ligação específica ocorrer pode ser detectada por autoradiografia da membrana (Figura 32). O padrão de hibridação pode ser comparado diretamente com a região no gel original que contém a seqüência de DNA de interesse. Southern blotting é uma técnica tão poderosa que permite que as informações obtidas sejam utilizadas para a construção de um mapa de restrição de uma determinada parte do DNA clonado, por exemplo, para identificar a região que contém o gene de interesse. Esta técnica possibilita também que as sondas de ácidos nucléicos sejam utilizadas para diagnósticos de distúrbios genéticos, ensaiando-se o DNA genômico dos indivíduos afetados e de seus familiares. De modo análogo, moléculas de RNA também podem ser identificadas após serem separadas por eletroforese, transferidas para nitrocelulose, sofrerem hibridação com sondas de DNA ou RNA. Esta técnica de analisar RNA, por analogia ao Southern blotting, recebeu o nome de Northern blotting. Esta técnica é útil como auxiliar na análise de clones de cDNA porque, o tamanho do mRNA específico pode ser comparado com o tamanho dos cDNAs clonados, revelando a integridade dos clones. Além disto, esta técnica permite indicar em qual tecido ou tipo celular um determinado gene é expresso ou quais são os fatores que regulam a sua expressão.

Figura 32. Southern blotting. Um fragmento de DNA específico pode ser identificado separando-se a mistura de fragmentos por eletroforese, transferindo-se para nitrocelulose e hibridizando-se com uma sonda molecular complementar à seqüência e marcada com 32P.

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