tecnologia do DNA recombinante

tecnologia do DNA recombinante

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4. Como os genes clonados são utilizados?

O clone de interesse pode ser explorado sob vários aspectos. Ele pode ser seqüenciado e comparado com outras seqüências já descritas, ser utilizado no estudo da expressão gênica do(s) gene(s) contido(s) no clone, ser alterado especificamente por mutagênese sítio dirigida ou ser usado para gerar um produto de interesse comercial. Para isto quase sempre será necessário transferir o clone, ou parte deste para um vetor mais apropriado para atingir os objetivos desejados. A transferência de parte do DNA clonado para um novo vetor é conhecida como sub clonagem. Algumas destas aplicações serão abordadas nos capítulos seguintes.

5. Mapa de restrição

O mapa de restrição do DNA clonado ou de pequenas moléculas de DNAs de fagos, plasmídios ou mitocôndrias pode ser bastante útil na caracterização da molécula. Esta técnica envolve a separação por eletroforese dos fragmentos de DNA obtidos após digestão do DNA total com determinada enzima de restrição. A ordem dos fragmentos na molécula pode ser descoberta com o uso de outras enzimas de restrição, em duplas digestões e/ou por digestões seqüenciais usando 2 enzimas. Assim cada fragmento obtido após digestão com a enzima x é removido do gel e submetido à digestão com a enzima y e vice-versa (Figura 33).

Informações sobre o mapa de restrição de um fragmento de DNA são utilizadas, por exemplo, para subclonar partes deste fragmento para o seqüenciamento. O mapa de restrição do DNA mitocondrial vem sendo útil na caracterização de linhagens e/ou espécies de vários organismos, auxiliando em estudos taxonômicos e evolutivos.

Figura 33. Mapa de restrição do DNA do fago para várias endonucleases. As barras verticais indicam os locais de clivagem de cada enzima e os números no alto indicam o tamanho da molécula em unidades de 5000 pares de bases. Esta molécula possui no total 48502 pares de bases.

V. REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)

A reação em cadeia da polimerase possibilita a amplificação de uma seqüência rara de DNA a partir de uma mistura complexa, sem a necessidade de clonagem molecular. Esta técnica é amplamente utilizada em pesquisa básica, em medicina forense e no diagnóstico de doenças genéticas e infecciosas.

Inicialmente, é necessária a construção por síntese química de dois oligonucleotídeos de DNA (iniciadores) complementares as extremidades de cada fita de DNA, flanqueando a região de interesse. Estes oligonucleotídeos servem como iniciadores da síntese de DNA in vitro, que é catalisada pela DNA polimerase.

Um ciclo de PCR começa com a desnaturação por calor (95C), que promove a separação da fita dupla de DNA. A reação é resfriada na presença de um excesso dos dois oligonucleotídeos, possibilitando a hibridização dos dois iniciadores com a seqüência complementar presente no DNA alvo. Em seguida, a reação é incubada para atividade da DNA polimerase, produzindo novas fitas de DNAs a partir dos iniciadores e utilizando o quatro desoxirribonucleotídios (dATP, dCTP, dGTP e dTTP) (Figura 34).

Figura 34. As 3 etapas do ciclo de PCR (http://allserv.rug.ac.be/~avierstr/index.html).

A cada novo ciclo da reação inicia-se com o aquecimento para desnaturação da dupla fita de DNA, seguido de resfriamento para hibridação dos iniciadores e síntese de uma nova fita pela DNA polimerase a partir dos iniciadores, sendo que as fitas de DNA recém sintetizadas servem de molde no ciclo seguinte. Portanto, em cada ciclo é sintetizado o dobro do DNA produzido no ciclo anterior (Figura 35). Usualmente, são realizados de 20 a 30 ciclos para amplificação de um segmento de DNA específico dentro de um genoma.

Nas primeiras iniciativas para amplificar fragmentos de DNA utilizava-se a enzima DNA polimerase da Escherichi coli, que possui atividade máxima a 37C. Esta enzima deveria ser adicionada a cada ciclo pois o passo de desnaturação inativa a enzima. Um importante avanço ocorreu com a descoberta da enzima Taq DNA polimerase (Saiki et al, 1988) oriunda da bactéria Thermus aquaticus. A Taq DNA polimerase possui atividade ótima a 72C e permanece razoavelmente estável mesmo a 95C e com isto, a enzima é adicionada somente no inicio do processo .

Figura 35. Os primeiros 4 ciclos de um PCR em detalhes.No terceiro ciclo, duas duplas fitas que apresentam o tamanho correto são copiadas (as duas fitas com o mesmo tamanho). No quarto ciclo, 8 duplas fitas que apresentam o tamanho são copiadas (http:// allserv.rug.ac.be/ ~avierstr/index.html).

Além de ser utilizada para a amplificação de um segmento específico de DNA dentro de um genoma, a metodologia de PCR pode ser utilizada para amplificar um segmento ou toda a seqüência de um produto gênico. Isso pode ser feito a partir da população de RNA de uma determinada célula ou tecido. Entretanto, como a Polimerase utilizada na metodologia de PCR é uma DNA Polimerase depedente de DNA, ela não pode usar RNA diretamente como molde para a amplificação. Assim, inicialmente é realizada uma reação de transcrição reversa, onde pela ação da transcriptase reversa o RNA é utilizado como molde para geração de cDNA, que é então utilizado como molde em uma PCR subsequente. Essa abordagem denominada de RT-PCR (Reverse Transcription and Polimerase Chain Reaction) é muito útil para se analisar de maneira rápida a expressão de genes de interesse, pois uma vez que a PCR é realizada a partir de cDNA, o fragmento correspondente ao gene de interesse só será amplificado naquelas células ou tecidos onde o gene é expresso. Esta técnica pode ser utilizada para clonagem de um cDNA de interesse, desde que já se tenha alguma informação de sua seqüência, sem a necessidade de se construir uma biblioteca de cDNA para isolá-lo.

VI. SEQÜENCIAMENTO DE DNA

A partir do final da década de 70 tornou-se possível a determinar a seqüência nucleotídica de fragmentos de DNA. O desenvolvimento da metodologia descrita por Sanger e cols associado a avanços tecnológicos, permite que hoje genomas inteiros sejam seqüenciados.

O princípio do método de terminação da cadeia para seqüenciamento de DNA baseia-se na síntese de DNA in vitro realizada na presença didesoxirribonucleotídeos. Um DNA purificado pode ser sintetizado in vitro em uma mistura que contém moléculas de fita única de DNA, enzima DNA polimerase, um DNA iniciador que possibilita a polimerase iniciar a síntese de DNA utilizando os desoxirribonucleotídios. Alternativamente, na presença de didesoxirribonucleotídeos (ddATP, ddCTP, ddGTP e ddTTP) na reação, o elongamento da cadeia de DNA é bloqueado pela incorporação do nucleotídeo sem um grupo OH na posição 3'.

No método originalmente desenvolvido por Sanger para seqüenciamento de DNA, uma fita complementar é sintetizada utilizando um mistura de desoxirribonucleotídeos, um deles marcado com P32 ou S35. São realizadas 4 reações independentes, contendo uma pequena quantidade de um tipo de didesoxirribonucleotídio em cada uma das reações. Cada reação produz um conjunto de cópias do DNA inicial que terminam em diferentes pontos da sua seqüência. Os produtos destas quatro reações são separados por eletroforese, utilizando quatro raias paralelas em um gel de poliacrilamida e os fragmentos são detectados através da marcação radioativa. Em cada um das raias, as bandas representam fragmentos que foram terminados em dado nucleotídeo em diferentes posições do fragmento inicial de DNA. Pela análise da ordem das bandas, começando pelo final do gel através das quatro raias, pode-se determinar a seqüência do DNA recém sintetizado (Figura 36).

Este método ainda é amplamente utilizado, sendo que vários avanços tornaram o seqüenciamento de DNA uma técnica simples e rápida. Os principais avanços foram a adaptação da PCR ao método de terminação da cadeia e a utilização de didesoxirribonucleotídeos marcados com diferentes corantes fluorescentes (fluorocromos). A utilização de fluorocromos permite que todas as quatro reações sejam realizadas em um único tubo e o produto da reação de seqüenciamento seja separado em uma única raia do gel.

Figura 36. Seqüenciamento de nucleotídeos pelo método do término do crescimento da cadeia. Lehninger, Principles of Biochemistry. Figura 10-36, p. 352.

Atualmente, todo o processo de seqüenciamento de DNA pode ser realizado em seqüenciadores automáticos. Nestes equipamentos o produto da reação de seqüenciamento é separado por eletroforese em gel ou em capilar, os fluorocromos são excitados por um feixe laser, os sinais fluorescentes são amplificadas e detectados por tubos fotomultiplicadores ou nos modelos mais modernos por câmaras CCD. Análises computacionais identificam cada nucleotídeo pelo comprimento de onda de emissão específico de cada fluorocromo. As bases são identificadas de acordo com a forma do pico fluorescente e a distância entre picos sucessivos (Figura 37).

Figura 37. O produto da reação de seqüenciamento é submetido à eletroforese em uma raia de gel. À medida que os fragmentos passam pelo feixe de laser, os fluorocromos são excitados e a luz emitida é detectada por um fotomultiplicador. Esta informação é traduzida na forma de seqüência através de um computador.

VII. Expressão de proteínas heterólogas

1. Introdução

A descoberta de promotores e repressores específicos do genoma de E. coli, de uma variedade de vírus de E. coli e de células eucarióticas permitiu a manipulação da expressão de proteínas e a clonagem de genes sob o controle de um dado promotor, cuja expressão pode ser indutível ou contínua. O primeiro, e mais comumente usado, sistema de expressão de proteínas heterólogas em E. coli é baseado no operon lac (Figura 38). Neste sistema, o DNA de interesse é clonado em fago (no caso de biblioteca de cDNA de expressão) ou plasmídeo contendo o lacI (repressor), lacP (promotor) e lacZ (gene estrutural transcrito para mRNA da -galactosidase). A indução da transcrição é obtida pela adição de um análogo de lactose sintético e não degradável (isopropiltio--D-galactosídeo, IPTG), o qual se associa ao repressor e inibe-o, deixando o promotor livre para a interação com a RNA polimerase e consequente transcrição do gene.

Figura 38. Esquema ilustrando o funcionamento do operon lac. (a) Na ausência de indutor. (b) Na presença de indutor.

O sistema mais comumente utilizado para expressão de proteínas heterólogas é o que utiliza E. coli como célula hospedeira. Este sistema é amplamente difundido devido à facilidade e baixo custo de se cultivar E. coli, e pela reprodutibilidade e abundância de proteína que produz. Além disso, modificações nos vetores e linhagens de E. coli são frequentemente feitas no sentido de aumentar a eficiência e versatilidade do sistema original. Com isto, e com o advento de novos sistemas de expressão em células de eucariotos (levedura, insetos, mamífero), a expressão de proteínas clonadas tornou-se uma abordagem poderosíssima que vem revolucionando os estudos de estrutura, função, purificação e identificação de novas proteínas. Nestes outros sistemas, o recombinante a ser introduzido no hospedeiro alvo pode ser facilmente construído e amplificado em E. coli. Por isso os plasmídeos de levedura, mamífero, etc. são construídos por fusão de uma porção de um plasmídeo de E. coli (origem de replicação e resistência a um antibiótico) com seqüências específicas para se obter expressão em célula eucariótica, conforme veremos adiante.

2. Expressão de proteínas heterólogas em E.coli

O uso de E. coli para a obtenção de proteína em quantidade suficiente para o estudo da estrutura e função da mesma ou para aplicações clínicas ou industriais é hoje disseminado e constitui-se em um marco na história do nosso conhecimento de estrutura de proteínas. Este tópico pretende sobretudo descrever os passos básicos envolvidos na construção de recombinantes e expressão, em bactéria, de uma proteína clonada.

2.1 Subclonagem em plasmídeos de expressão

O procedimento de clonagem de um fragmento de DNA para expressão é exatamente igual a qualquer clonagem, no entanto, deve se ter em mente que o propósito será obter a proteína correta. Para tanto, é necessário respeitar o sinal de tradução de genes procarióticos (sinal de Shine-Dalgarno), em outras palavras, o DNA deve ser clonado de maneira que sua fase de leitura correta fique em fase com o ATG iniciador (Figura 39). Além disso, um vetor para expressão em E. coli deve apresentar as seguintes características:

origem de replicação

marcador para seleção: gene que confere resistência a antibióticos como ampicilina, tetraciclina, cloranfenicol, neomicina. Ex. o gene da -lactamase que confere resistência a ampicilina.

um promotor para transcrição: como os vetores de expressão são normalmente projetados no sentido de produzir proteína em abundância, o DNA codificante para uma dada proteína deve ser colocado sob o comando de um promotor forte (exemplos: lacZ, tac (trp+lacZ), l-pR, l-pL, pf10 do bacteriófago T7) e regulável, isto é, contendo um repressor para manter os níveís basais de expressão do gene insignificantes até a indução, o que se faz geralmente por adição de IPTG, no caso por ex. do repressor lacI, ou choque térmico, no caso do repressor cIts857.

sinal de terminação da transcrição

sequências para controle da tradução, como por ex., um sítio de ligação ao ribossomo para a iniciação da tradução (Shine-Dalgarno) e um ATG iniciador. Um sinal de terminação da tradução (códon de terminação) também deve estar presente no vetor ou no inserto a ser clonado, ou deve ser adicionado.

um MSC para facilitar a inserção do gene de interesse na orientação correta.

Figura 39. Procedimentos para clonagem de um fragmento de DNA em fase de leitura correta em um plasmídeo de expressão.

Uma vez construído, o vetor de expressão contendo a sequência codificadora da proteína de interesse é introduzido em E.coli por transformação.

Ao planejar uma subclonagem para a expressão de proteína, além de se respeitar a fase de leitura correta, deve-se também tentar na medida do possível fazer a clonagem unidirecional do inserto. Na clonagem unidirecional utilizam-se duas enzimas de restrição para digerir o vetor e o DNA inserto. Na bidirecional utiliza-se uma única enzima, de modo que as pontas são iguais, permitindo a inserção do fragmento em ambas as orientações. Assim, em uma clonagem bidirecional há 50% de probabilidade de se obter os recombinantes na orientação correta (senso) e 50% na orientação invertida (anti-senso).

2.2 Análise dos plasmídeos e seleção dos subclones corretos

A análise de DNA plasmidial para a seleção dos subclones corretos é feita por digestão com enzimas de restrição e confirmada por sequenciamento se julgar necessário. A análise de restrição é um procedimento bastante simples; entretanto deve ser feito com cautela e atenção. Seu objetivo é selecionar o clone recombinante correto quanto ao tamanho do inserto e sua orientação.

Como regra a primeira digestão deve ser feita com a(s) enzima(s) utilizada(s) para a clonagem; isto produzirá dois fragmentos: plasmídeo linear + inserto, e permitirá avaliar se os sítios de clonagem foram recuperados intactos. Se a ligação for realizada entre extremidades cegas, preenchidas pela ação da Klenow polimerase, verifica-se em um catálogo de enzimas de restrição se haverá a formação de um novo sítio, o qual poderá ser clivado para análise. Outra alternativa consiste em clivar em sítios próximos ao da clonagem em ambas as extremidades.

A segunda digestão, no caso da clonagem bidirecional, deve ser planejada para determinar a orientação do inserto. Deve-se escolher um sítio único e não centralizado no inserto e um sítio no MSC que seja ausente no inserto, produzindo de preferência dois fragmentos de tamanhos facilmente distingüíveis no gel. Calcular previamente o tamanho dos fragmentos esperados para ambas as orientações. A digestão completa é fundamental para a correta interpretação dos resultados. A Figura 40 esquematiza um projeto de subclonagem de um gene e a análise de restrição dos subclones obtidos com o objetivo de: a) selecionar os recombinantes, b) selecionar o recombinante correto.

3. Produção de proteínas heterólogas em E. coli

3.1. Produção de proteínas híbridas

De maneira ideal, quando se pensa em expressão heteróloga, espera-se que a proteína de interesse seja estável, não tóxica para a bactéria, solúvel, produzida em grande quantidade e possa ser facilmente purificada. Um procedimento muito utilizado é o de expressar a proteína de interesse em fusão com um “tag” específico que permita a fácil purificação da mesma através de cromatografia por afinidade em resinas às quais se encontram acopladas ligantes, aos quais o “tag” possa se ligar especificamente. Uma outra vantagem óbvia de se produzir uma proteína híbrida, ou de fusão, é no caso da expressão de polipeptídeos pequenos ou mesmo peptídeos, os quais, sem fusão, seriam instáveis e rapidamente degradados na célula.

Figura 40. Subclonagem de um fragmento de DNA em plasmídeo de expressão e análise de restrição de dois recombinantes obtidos.

Nota : Os clones 1 e 2 foram digeridos com BamHI e Hind III, separadamente.

Responda: Qual dos dois clones tem o inserto na orientação correta (senso) para a expressão da proteína?

Em geral projeta-se ainda um sítio sensível a uma determinada protease (ex: fator Xa, trombina), inserido imediatamente acima do sítio de clonagem, de maneira que a proteína híbrida possa ser clivada liberando a proteína clonada que pode então ser facilmente purificada utilizando-se a mesma coluna de afinidade. A coluna reterá a proteína de fusão e eliminará no "void" a proteína de interesse. Um exemplo de proteína híbrida obtida por clonagem no vetor pMAL é dado na Figura 41.

O procedimento de proteólise é relativamente trabalhoso e nem sempre eficiente, por isso quando a proteína de fusão não interfere se utiliza a própria proteína híbrida, por exemplo, para experimentos funcionais, produção de anticorpos, etc. Note que neste caso pode ser estratégico ter o mesmo DNA clonado em dois sistemas de fusão diferentes. Isto permitirá que anticorpos produzidos contra uma proteína híbrida sejam purificados por afinidade contra a outra, purificando-se assim apenas anticorpos cujos epitopos localizam-se na proteína clonada.

Dentre os vetores utilizados com sucesso para a produção de proteínas híbridas podemos citar:

pGEX: apresenta a glutationa-S-transferase de Schistosoma japonicum (26 kDa) como proteína de fusão, permitindo a purificação da proteína de fusão em coluna de agarose-glutationa

pMAL: apresenta a proteína ligante de maltose (PLM) de bactéria (42 kDa) como fusão, permitindo a purificação da proteína de fusão em coluna com amilose acoplada

pQE: apresenta um “tag” de 6 resíduos de histidina como fusão e permite a purificação das proteínas de fusão em colunas quelantes de Ni2+

pUR: cuja fusão é um fragmento da -galactosidase

A produção de proteínas híbridas é geralmente muito simples, eficiente e de baixo custo financeiro, podendo suprir de imediato necessidades da pesquisa básica, tais como, produção de anticorpos e purificação destes por afinidade, sondas em experimentos variados e para estudos funcionais/estruturais da proteína expressa. Permite, também, a expressão em grande escala, para fins industriais ou clínicos de enzimas, hormônios, anticorpos, etc., quando a atividade da proteína é preservada. Além disto, é possível se obter, por mutagênese, proteína com a atividade de interesse potenciada e livre de efeitos adversos ou atividades indesejadas.

(b)

Figura 41. a) Esquema ilustrando os passos para a expressão, purificação e clivagem de uma proteína de fusão. b) Gel de poliacrilamida-SDS de frações da purificação da proteína de fusão PLM-paramiosina. Em A são mostrados os extratos de células não induzidas (1) e de células induzidas (2). Em B, proteína de fusão PLM-paramiosina após eluição da coluna de amilose por adição de maltose (1), após clivagem por fator Xa (2) e fração coletada no "void"após passagem na coluna para a retenção da PLM (3).

É importante estar alerta de que a situação ideal exposta acima nem sempre é atingida. Na realidade, na grande maioria das vezes, proteínas de eucarioto produzidas em bactéria não são solúveis; às vezes podem ser tóxicas para a célula; algumas são expressas em baixos níveis; algumas interferem com a sua fusão inibindo-a de se ligar à resina de afinidade e tornando a purificação menos eficiente; outras formam agregados extremamente insolúveis mesmo na presença de SDS/b-mercaptoetanol; algumas têm a sua atividade biológica plenamente recuperada, porém outras são inativas.

Assim, dentre os problemas mais comuns que ocorrem com a produção de proteínas heterólogas em E. coli, podemos citar:

Proteínas tóxicas: algumas proteínas são tóxicas para a célula hospedeira. Neste caso, pode-se proceder a secreção. Uma alternativa à produção de proteína citoplasmática, é a produção de proteínas que são secretadas. Para tanto basta clonar o DNA codificante em fusão com uma seqüência codificante para um peptídeo sinal de procarioto. Este peptídeo é clivado pela peptidase sinal quando a proteína é secretada para o periplasma. Embora este método freqüentemente traga problemas com o rendimento ou a clivagem do peptídeo sinal, há vantagens em alguns casos: no caso de proteínas tóxicas para a bactéria; algumas proteínas degradadas por protease no citoplasma são estáveis no periplasma; algumas que são inativas quando produzidas intracelularmente são ativas quando secretadas; a proteína produzida já tem a sua metionina N-terminal processada. Um exemplo de sucesso é a expressão do hormônio fator de crescimento epidermal humano (hEGF) sob o comando do promotor da fosfatase alcalina (phoA) e com a seqüência sinal desta. A indução é obtida sob privação de fosfato do meio.

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