Baixe Extração e quantificação de Ácidos nucleicos e outras Notas de estudo em PDF para Bioquímica, somente na Docsity!
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EE de Medicina Universidade Coimbra
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Bioquímica =-Prática
Introdução
XIII)
DNA • Os cromossomas contêm eucromatina, descondensada, tendo genes activos; • Contêm também heterocromatina, condensada, com genes inactivos. DNA • Contém o material genético do indivíduo • Responsável pela hereditariedade • Contém inúmeros genes que codificam proteínas • Tem estrutura em dupla hélice, circular ou hélice simples • Cresce no sentido 5’→3’ • Tem cerca de 20Å de diâmetro RNA – RNAt • Traduz a sequência de bases do mRNA em aminoácidos RNA
- FRNA
* Forma os ribossomas, combinado com
proteínas
Assembled
FRNA Proteins Subunits ribosomes
& eo + Total; 31 —s ES]
z 238 ss
g (2900 FNTS) (120 7NTs) sos
O -==iiiiiiiiiiiiiiciliDaaaDaDDDDDaDaDDDaDDDaDDoDaonao.
a
& Total: 21 ;
(1500 rNTs)
285:5.85
ic (vertebrate)
5s
(4800 rNTs, 160 rNTs) (120 rNTs)
Total: 33
(1900 FNTs)
RNA • Enquanto que no DNA a pentose é uma desoxirribose, no RNA é uma ribose. • No RNA a base azotada Timina encontra-se substituída por Uracilo Procedimento Material: Reagentes: - Tampão A (Tampão de lise das hemácias): 0,32 M sacarose; 10 mM Tris HCl; 5 mM MgCl2; 0.75% Triton- X-100; (pH a 7.6) - Tampão B (desproteinização): 20 mM Tris-HCl; 4 mM Na2EDTA; 100 mM NaCl; (pH a 7.4) - Água - SDS 10% - Solução de Proteinase K (20 mg/mL) - NaCl 5.3 M - Isopropanol frio - Etanol 70% frio - TrisHCl 10 mM Pipetas e micropipetas Centrifugadora Tubos de ensaio Suporte de tubos de ensaio Incubadora Reagentes Tampão A lise dos glóbulos vermelhos Tampão B Provoca a lise das membranas celulares (nucleares inclusivé) e desnatura proteínas Proteinase K destrói as proteínas Cloreto de Sódio precipita as proteínas isopropanol força o DNA a precipitar formando a medusa Etanol lava a medusa Na estufa o etanol evapora e o DNA solidifica Resultados 0,092 0,065 1,4 0,485 Absorvância 260 nm Absorvância 280 nm DO260/ DO280 Concentraçã o (µg/µl) Medusa de DNA Discussão [ ] do DNA extraído [DNA] = DO260 x 0,05 x fd 0,485 µg/µl Perdas de DNA: - Acção de DNases citoplasmáticas - Insuficiente e não imediata preservação a frio - Incompleta precipitação do DNA - (…) Aferir rendimento da extracção Posteriores Aplicações - PCR - Electroforese Amplificar milhões de vezes uma dada sequência nucleotídica de interesse Avaliar a [ ] do DNA extraído, por comparação de um marcador - Sequenciação do DNA - RFLPs Aplicações forenses, como meio de diagnóstico, filogenéticas Grau de Pureza e Aplicações A aplicação do DNA extraído em posteriores processos implica um grau de pureza entre 1,5 e 2,0 Na Experiência: Não pode ser posteriormente aplicado, nomeadamente na técnica de PCR DNA extraído demasiado contaminado (1,4) Contaminação dificulta: - acesso à DNA Polimerase - emparelhamento dos primers
